Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

תסה תנוענות פלנרית כדי לאמוד את המאפיינים של מודולים ביולוגיים של מוצרים טבעיים

Published: May 30, 2020 doi: 10.3791/61070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State University of New York (SUNY) at Morrisville

Summary

תנועתיות פלנרית משמשת כדי לאמוד את תכונות ממריצים ונסיגה של מוצרים טבעיים בהשוואה לתנועה של בעלי החיים במעיין בלבד.

Abstract

אמצעי פשוט, נשלט של שימוש פלנרי שאינו טפילי, Dugesia tigrina, תולעת שטוחה מימית חיים חופשיים, כדי לחקור את תכונות ממריץ ונסיגה של מוצרים טבעיים מתואר. מחקרים ניסיוניים המרוויחים מהיבטים ייחודיים של פיזיולוגיה פלנרית הוחלו על מחקרים על ריפוי פצעים, התחדשות ותוסס גידולים. בנוסף, מכיוון שהפלנריים מפגינים רגישות למגוון גירויים סביבתיים ומסוגלים ללמוד ולפתח תגובות מותנות, ניתן להשתמש בהם במחקרים התנהגותיים הבוחנים למידה וזיכרון. Planarians יש סימטריה דו-צדדית בסיסית ומערכת עצבים מרכזית המשתמשת במערכות מוליך עצבי הניתן ללימודים הבוחנים את ההשפעות של ביואפנולטורים עצביים שריריים. כתוצאה מכך, מערכות ניסיוניות ניטור תנועה פלנרית ותנועתיות פותחו כדי לבחון התמכרות וחומרים גמילה. מכיוון שתנועתיות פלנרית מציעה את הפוטנציאל של מערכת תנועתית רגישה, מתוקנה בקלות כדי לפקח על ההשפעה של גירויים, מבחן מהירות הקטר התכנון (pLmV) הותאם כדי לפקח על התנהגויות גירוי ונסיגה על ידי planarians באמצעות קביעת מספר קווי הרשת חצו בעלי החיים עם הזמן. כאן, הטכניקה והיישום שלה מדגימים ומוסברים.

Introduction

הפרוטוקול המתואר משתמש בתנוענות פלנרית כדי לספק אמצעי להערכת ההשפעות של מודולים ביולוגיים של חומרים טבעיים. זה הותאם במיוחד כדי לקבוע אם חומרים אלה מתפקדים כממריצים, ואם הם היו קשורים אז עם התנהגות גמילהמדידה 1. תסרוקת זו, המכונה מבחן מהירות הקטר התפלנית (pLmV), שימשה לראשונה לבדיקה של סוכנים פרמקולוגייםידועים 2,3. היישום של תנוענות פלנרית זו מבוססת תנועלת גדל מאז בפופולריות, אומץ על ידי מעבדות שונות המעוניינות בחומרים אחרים מאשר מוצרים טבעיים4,,5. לצורך כך, פלנרי ממוקם בצלחת פטרי המכילה מי מעיין או מי מעיין המכילים אפנן ביולוגי מומס. מכיוון שהמנה עצמה מונחת על נייר גרף, ניתן להשתמש במספר קווי הרשת שחצו בעלי החיים עם הזמן במהלך התנועה על המכל כדי לקבוע את קצב התנועה בכל מצב. מבחן האור/כהה, המכונה גם מבחן העדפת מקום מותנה (CPP), הוא וריאציה נוספת על הנושא של ניטור תנוניות פלנרית, ומעריך כמה מהר בעלי החיים מגיבים ונודדים לסביבה חשוכה6,,7. ניתן לנתח מעקב וידאו אחר תנועות תכנון באמצעות תוכניות מחשב ומרכז מסה (COM) מעקבאחר 8,9,,10,11.

שימוש בתכנון כמודל בעלי חיים עבור מחקרים כאלה מציע מספר יתרונות על בעלי חיים אחרים בכך שהנסוי יכול בקלות לשלוט בסביבת ה-assay. באופן ספציפי, להרעיב את התכנון לפני ניסויים יכול למנוע את חשיפתם לחומרים תזונתיים או תרופתיים אחרים שאחרת עלולים לבלבל את התוצאות, ואת biomodulator ספציפי תחת חקירה ניתן להציג את planarians פשוט על ידי הוספתו ישירות למים התרבות, ובכך לתקנן את החשיפה. מאז planarians יש מערכת העצבים נוירוטרנסמיטורים המזכירים בעלי חיים 'בסדר גבוה', הפיזיולוגיה ותגובות ניסיוניות של בעלי חיים אלה לגירויים עצביים שריריים נחשבים רלוונטיים ביולוגית אורגניזמים אחרים12,13,14,15,16. כמו כן, מכיוון שהתכננים זולים יחסית וישירים לתחזוקה במעבדה, הם מציעים מודל ביולוגי נגיש לחוקרים רבים.

כחיה ניסיונית, התכנון מתאים למגוון רחב של מחקרים. לדוגמה, הקבוצה שלנו, כמו גם חוקרים אחרים להשתמש planarians כדי ללמודגידולים 17,18,19. Planarians גם להפגין שורה של התנהגויות תגובה כימי, תרמי, כוח הכבידה, חשמל, תמונה, וגירויים מגנטיים שיצרו את הבסיס של מערכות אסיי אחרות. חלק מתופעות אלה שימשו ללימוד למידה וזיכרון בבעלי חייםאלה 20,21,22,23,,24,,25,26,27., השימוש העיקרי במודל התכנון בספרות כיום מתמקד בפעילותם של תאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריים, הנקראים neoblasts,ותפקידם בהתחדשות 28,29,30. לפיכך, אימוץ המודל המתואר כאן מאפשר מחקר נוסף באמצעות תחודות אחרות המבוססות על תכנון כדי לספק הבנה רחבה יותר של האופן שבו מוצרים טבעיים ובואפנונים אחרים משפיעים על האורגניזם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. גיבר פלנרי

  1. השתמש בתכנון שנרכשו בחברת אספקה ביולוגית או שנתפסו בטבע במידת הצורך. התכנון המשמש בפרוטוקול זה הוא Dugesia tigrina, כפי שרשום ברשימת האספקה. מין זה מכונה גם ג'ירארדיה טיגרינה31. מינים ימיים אחרים מקובלים גםכן על 2,3.
    הערה: הפרוטוקול המתואר מיועד לבעלי חיים שנרכשו בחברת אספקה ביולוגית. מערכת ההסתה הזו לא נבדקה עם אנשים שנתפסו בטבע. עם זאת, אם נעשה שימוש בתכנון שנתפס בטבע, מומלץ לתרגל אותם למים המשמשים בניסויים, כמו גם לסביבת המעבדה לפחות שבוע לפני השימוש.
  2. עם ההגעה, מעבירים את התכנון למכלי אחסון מזון מפלסטיק המכילים מי מעיין נקיים ולשמור על המכסים פתוחים.
  3. שמור על תכנון בסביבה חשוכה.
  4. להאכיל את התכנון החדש נמסר לאחר 24-36 שעות בסביבה החדשה שלהם.
  5. אפשרו ללוכנים להסתגל למעבדה לפחות שבוע לפני הניסויים.
  6. להאכיל את התכנון בלוח זמנים קבוע פעמיים בשבוע.
    1. אפשרו לתכנון להאכיל את הליביטום על ביצים מבושלות אורגניות קצוצים או כבד בקר אורגני מעורבב במשך 1-2 שעות.
    2. מניחים את התכנון המוזנים במיכל נקי לאחר ההאכלה.
      1. הסירו את המים המלכלכים מהכנות.
      2. השתמש במכחול קטן שטוח בצבעי מים (מספר 3-6) כדי להעביר פסולת מזון ורפש דבקות במיכל מסביב planarians מגבת נייר.
      3. עם מי מעיין מתוקים ומערבולת עדינה או תסיסה, לנתק את פלנריים ולשפוך אותם לתוך מיכל נקי.
      4. ניתן להעביר את כל התכנון שנותר לדבוק במיכל באמצעות מכחול עגול בצבעי מים (מספר 3-6) או להעביר פיפטה עם משעמם רחב.
      5. תשמיד את מי ההעברה.
      6. כסה את התכנון עם מי מעיין נקיים.
      7. לאחר השעה 24 שעות, מוציאים את התכנון מכל פסולת מזון שגורשו על ידי העברתם למכל נקי כמתואר לעיל (שלבים 1.6.2.1-1.6.2.6).
  7. כדי לנקות מכולות וכלים המשמשים לאירוח פלנרי, אין להשתמש בסבון או בחומרי ניקוי. נקה פריטים אלה על ידי שטיפה היטב עם מים נקיים (מי ברז מקובלים) וייבושם במטלית נקייה או מגבת נייר.

2. הכנת תכנון לניסויים

  1. לאפשר לתכנון החדש להסתגל לסביבתם לפחות שבוע לפני הניסויים.
  2. תגווע ברעב במשך 5-10 ימים לפני הניסויים.
  3. לשנות את מי התרבות לפחות 1x במהלך תקופת הרעב.

3. מהירות הקטר פלנרית (pLmV) מבחן: התנהגויות ממריצות

  1. לפני הניסויים, ודאו שתכנון מורעב נוצר במלואו, עם ראש וזנב שלמים ופיגמנטים.
  2. הכן צלחת פטרי זכוכית או פלסטיק 10 ס"מ ומיכל מגורים למבחן pLmV לפני תחילת הניסוי.
    1. מניחים צלחת פטרי נקייה בקוטר 10 ס"מ לשימוש למבחן pLmV על נייר רשת טרום לא מופרך (עם ריבועים 0.5 ס"מ).
    2. הוסף 20 מ"ל של מי מעיין טהורים עבור פקדים, או מי מעיין המכילים את הריכוז המתאים של המוצר הטבעי נבדק, לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ לשימוש למבחן pLmV.
    3. מקם מצלמה (למשל, טלפון סלולרי או מצלמה ברזולוציה גבוהה) מעל צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ כדי להקליט את התנועלת הפלנרית על נייר הרשת במהלך הניסוי. דוכן טבעת היא דרך נוחה למקם את המצלמה במרחק שיכול להקליט את כל התצוגה של 10 ס"מ צלחת פטרי וקווי רשת.
    4. הכן מיכל מגורים עם 5-10 מ"ל של מי מעיין טהורים (פקדים), או מי מעיין המכילים את הריכוז המתאים של המוצר הטבעי שנבחן. מיכל דומה בקבוקון מבריק או קטן 5 ס"מ צלחת פטרי מתאים.
  3. השתמש במכחול קטן, נקי, שטוח או עגול בצבעי מים כדי להעביר בעדינות פלנרי מהמכל עם מי המעיין למכל המגורים, שיש לו 5-10 מ"ל של מי מעיין או מי מעיין טהורים המכילים את המוצר הטבעי שנבחן.
    הערה: בעת מניפולציה של תכנון עבור תסוואי pLmV, השתמש במכחול קטן, נקי, שטוח או עגול בצבעי מים (מספר 3-6). בעת הזזת פלנריים, יש להציב את המברשת מתחת לחיה כדי להרים אותה בעדינות. כדי להבטיח שהפלנריים לא ייפגעו בעת השימוש במברשת, אין לשכך את זיפים של המברשת מתחת לחיה. התפשטות מתוך הזיפים עלולה לפגוע בפלנרי אם הוא ייתפס בין הסיבים של המברשת.
    הערה: פיפטה העברה נשא רחב יכול לשמש גם להעברת planarian לתוך מיכל מגורים נקי ויבש.
    1. אם משתמשים בפיפטה, הסר עודף מים שהוזז עם התכנון ממכל המגורים באמצעות פיפטת ההעברה.
    2. בזהירות להוסיף את פתרון המגורים (כלומר, מי מעיין עבור פקדים או מי מעיין המכילים את ריכוז המוצר הטבעי נבדק) למכל המגורים המכיל את planarian.
  4. תקופות מגורים יהיו תלויות בדינמיקת הגירוי המוערכת עבור המוצר הטבעי שנבחן. זמן מגורים של 2 דקות הוכיח מקובל לזהות גירוי בעבודה זו1.
  5. לאחר תקופת המגורים של 2 דקות, השתמשו במכחול בצבעי מים כדי להעביר בעדינות את הפלנרי למרכז צלחת פטרי המוכנה ב-10 ס"מ לניסוי גירוי pLmV.
  6. הפעל את המצלמה כדי להקליט את התנועה של התכנון. שיא 10-11 דקות של וידאו.
  7. הכינו את מיכל המגורים ואת צלחת פטרי ב-10 ס"מ לניסוי pLmV עם פתרונות טריים לכל פלנרי.
  8. השתמש בפיפטות ייעודיות, כלים, מכולות ומברשות צבע עבור כל ריכוז ניסיוני של המוצר הטבעי שנבחן כדי למנוע חשיפה בשוגג של פלנריים לפתרון הלא נכון במהלך הניסויים.
  9. מכיוון שלכנים מציגים התנהגויות מלומדות, יש להשתמש בכל תכנון (שליטה או בדיקה) רקפעם אחת 21,22.

4. מהירות הקטר פלנרית (pLmV) מבחן: התנהגויות גמילה

  1. לפני הניסויים, ודאו שתכנון מורעב נוצר במלואו, עם ראש וזנב שלמים ופיגמנטים.
  2. הכינו צלחת פטרי ב-10 ס"מ (זכוכית או פלסטיק) לניסוי pLmV, צלחת פטרי ב-5 ס"מ (זכוכית או פלסטיק) לשטיפה של הפלנרית בעקבות המגורים, ומיכל מגורים לפני תחילת הניסוי.
    1. מניחים צלחת פטרי נקייה בקוטר 10 ס"מ לשימוש לניסוי pLmV על נייר רשת עם 0.5 ס"מ מרובעים).
    2. הוסף 20 מ"ל של מי מעיין טהורים לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ שישמש לניסוי pLmV.
    3. מקם מצלמה מעל צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ מוכנה כמו בשלב 3.2.3 כדי להקליט את התניתות הפלנרית מעל נייר הרשת במהלך הניסוי.
    4. הכן את מיכל השטיפה הפלנרי על ידי הוספת 5 מ"ל של מי מעיין בלבד לצלחת פטרי 5 ס"מ.
    5. הכן מיכל מגורים עם 5-10 מ"ל של מי מעיין טהורים (פקדים) או מי מעיין המכילים את המוצר הטבעי שנבחן. מיכל הדומה למבען מבריק או לצלחת פטרי קטנה בגודל 5 ס"מ (זכוכית או פלסטיק) מתאים.
  3. השתמש במכחול קטן, נקי, שטוח או עגול בצבעי מים כדי להעביר פלנרי מי מעיין למכל המגורים המוכן בעל 5-10 מ"ל של מי מעיין טהורים (פקדים) או מי מעיין המכילים את המוצר הטבעי שנבחן. מעבירים בעדינות את החיה מהמכל למכולה. ודא שהתכנון אינו פגום על-ידי המברשת.
    הערה: בעת מניפולציה של תכנון עבור תסוואי pLmV, השתמש במכחול קטן, נקי, שטוח או עגול בצבעי מים (מספר 3-6). בעת הזזת פלנריים, יש להציב את המברשת מתחת לחיה כדי להרים אותה בעדינות. כדי להבטיח שהפלנריים לא ייפגעו בעת השימוש במברשת, אין לשכך את זיפים של המברשת מתחת לחיה. התפשטות מתוך הזיפים עלולה לפגוע בפלנרי אם הוא ייתפס בין הסיבים של המברשת.
    הערה: פיפטה העברה נשא רחב יכול לשמש גם כדי להעביר את planarian לתוך מיכל מגורים נקי ויבש.
    1. אם משתמשים בפיפטה, יש להסיר עודפי מים עם התכנון ממכל המגורים באמצעות פיפטת ההעברה.
    2. בזהירות להוסיף את פתרון המגורים (כלומר, מי מעיין טהורים עבור פקדים או מי מעיין המכילים את המוצר הטבעי נבדק) למכל המגורים המכיל את planarian.
  4. תקופות מגורים לנסיגה יהיו תלויות בדינמיקת הגירוי המוערכת עבור המוצר הטבעי שנבחן; 2-5 דקות הוכיחו מספיק.
  5. לאחר תקופת ההתייזמן השתמשו במכחול בצבעי מים כדי להעביר בעדינות את הפלנרי לצלחת פטרי מוכנה ב-5 ס"מ המכילה מי מעיין כדי לשטוף כל מוצר טבעי ממכל המגורים. ודא שהתכנון אינו פגום על-ידי המברשת.
  6. העבר מיד את התכנון למרכז צלחת פטרי מוכנה ב-10 ס"מ המכילה מי מעיין לניסוי הנסיגה של ה-pLmV. ודא שהתכנון אינו פגום על-ידי המברשת.
  7. הפעל את המצלמה כדי להקליט את התנועה של התכנון. שיא 10-11 דקות של וידאו.
  8. הכינו את מיכל המגורים, מיכל השטיפה וצלחת פטרי ב-10 ס"מ לניסוי pLmV עם פתרונות טריים לכל פלנרי.
  9. השתמש בפיפטות ייעודיות, כלים, מכולות ומברשות צבע עבור כל ריכוז ניסיוני של המוצר הטבעי שנבחן כדי למנוע חשיפה בשוגג של פלנריים לפתרון הלא נכון במהלך הניסויים.
  10. מכיוון שלכנים מציגים התנהגויות מלומדות, השתמשו בכל תכנון (שליטה אובדיקה) רק פעם אחת 26,27.

5. ניתוח נתונים

  1. הכן טבלת איסוף נתונים כדי לתעד את אופן הפעולה ואת התנועבתיות של תיכנותים כאשר מספר קווי הרשת חצו עבור כל דקה במהלך הפעלת pLmV. הטבלה אמורה לאפשר את תיעד גם מספר הקווים המצטבר לדקה שחצה התכנון. כלול שורות עבור הערות וטבלת הגדרות כדי לעיין בהתנהגויות במהלך תקופת הניסוי, כגון 'לשוטט' ו'עצור' (ראה דיון).
  2. באמצעות הווידאו, ספור את מספר קווי הרשת המלאים שחצו התכנון לדקה למשך 10 דקות, והקליט מספר זה בטבלת הנתונים. התנהגות פלנרית טיפוסית מורכבת ממהירות רציפה, תנועה אופקית מכוונת קדימה, עם פניות תקופתיות וללא עצירות.
    1. התחילו לתזמן את הניסוי בנקודה שהפלנרית ירדה מהמכחול ששימש להעברתו לצלחת פטרי ב-10 ס"מ. הקלט את זמן ההתחלה הזה.
    2. כדי לקבוע מתי החיה חוצה ריבוע רשת מלא, התמקד בראש וציון קו אחד כאשר הראש חוצה באופן מלא ריבוע.
    3. כדי להבקיע רשת מלאה כאשר התולעת נעה סביב קצה הצלחת, דמיין מרחק של 0.5 ס"מ על-ידי התייחסות אל הקווים כשהם מתרחקים משוליים של הצלחת. אם התכנון חוצה את הפינה של תיבה, עיין בקו השני חצה כדי להבקיע קו רשת אחד. שוב, להתמקד בראש כדי להפוך את ההחלטות האלה.
    4. הפסק את הווידאו לאחר כל דקה כדי להקליט את הנתונים.
    5. בעת הפעלה מחדש של הווידאו כדי לספור את הדקה הבאה, אם ראש התולעת היה בין קווי רשת כאשר הווידאו הופסק, להקליט את הקו הראשון חצה כתיבה מלאה.
    6. ציון מספר קווי הרשת חצו במשך 10 דקות.
  3. אם בעל החיים מפסיק לנוע במהלך בדיקת pLmV ולא חוצה עוד קווי רשת במהלך זמן ההקלטה של 10 דקות, לתעד את ההתנהגות של planarian בתרשים התנהגותי (למשל, 'לשוטט' או 'להפסיק'). בעלי חיים המפסיקים את המסלול קדימה שלהם במהלך ה-pLmV assay במקום יש לשים לב והנתונים המוצגים כתדירות של המספר הכולל של בעלי חיים שנחשפו לריכוז רבגנט זה. התנהגות מפותלת או עוויתות (המכונה התנהגות C) מניעת כל תנועה קדימה במהלך תקופת המגורים מציין כי הריכוז של המוצר הטבעי אינו מתאים לשימוש ב- pLmV assay כי הודעה pLmV הוא מבוסס תנועתיות. ניתן לנתח התנהגויות מסוג C באמצעות ניתוח מסוג אחר (ראה דיון).
  4. במידת האפשר, בדוק ריכוזים ניסיוניים מרובים של המוצר הטבעי באמצעות לפחות 9-12 תולעים בימים שונים ובזמנים שונים של היום אם לקבוע את ההשפעה הכוללת של reagent על פיזיולוגיה פלנרית. עם זאת, אם החוקרים מנסים להפחית את השונות הנגרמת על ידי היממה, ניתן לערוך ניסויים עם תאורה קבועה בשעה מוגדרת ביום באמצעות תולעים המתורבבות עם מחזורי אור/כהה מתוזמנות וקביע זמני האכלה. יש לפחות שני ניסויים מעורבים בפרוייקט כדי לאפשר את האפשרות שיש אחד נתוני רשומה בודדים, בעוד הפרט השני סופר את קווי הרשת 'עיוור' לתנאים המשמשים לאיסוף נתונים. העובדה שאנשים שונים מעורבים באיסוף נתונים, כמו גם חישובים וניתוחים סטטיסטיים, מפחיתה גם הטיה אפשרית.
  5. חשב ספירות קווי רשת עבור כל ריכוז מוצר טבעי בכל יום ביחס לספירת בקרה עבור כל דקה, כך שניתן יהיה לשלב נתונים מימים, זמנים וניסויים שונים. ניתן להשתמש בממוצע בנתונים אלה ולאחר מכן לנתח אותם באמצעות מבחני T של סטודנט. ניתן להעריך ערכי P עבור כל בדיקה בדקה בהשוואה לבקרה ובין ריכוזי reagent. הערכות ANOVA באמצעות ערכות נתונים הנגזרות מריכוזים ניסיוניים שונים מספקות שיטת ניתוח נוספת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יש להשלים את המעבדה ואת הכנת סביבת העבודה להפעלת ערך ה-pLmV לפני תחילת הניסויים. זה כולל את הכנת מיכל המגורים, לשטוף את מיכל במידת הצורך (לניסועי גמילה), צלחת פטרי על נייר רשת למינציה, ומצלמה ממוקמת כראוי(איור 1). לאחר כל קטעי הווידאו נלקחים, מומלץ להשתמש גליון נתונים משותף כדי לתקנן איסוף נתונים ומצגת בין חוקרים (איור 2 ודמות 2 תוספת).

המצלמה להגדיר צריך לאפשר תצוגה ברורה של planarian ואת נייר הרשת כדי לאפשר הערכה מדויקת של ההתקדמות של בעל החיים למשך הניסוי (איור 3A ודמות 3A תוספת). איסוף הנתונים צריך לכלול את מספר קווי הרשת חצו, כמו גם את המספר הכולל המצטבר של קווים חצו לדקה של הניסוי (איור 3B). במהלך ניתוח pLmV, planarians יש מהירות רציפה, קדימה מכוון, תנועה אופקית, עם פניות תקופתיות, ולא להפסיק. בעת ההתחלה, יש להבקיע את תיבת הרשת המלאה הראשונה שנחצה ככזו, ולא כקו הראשון כפי שנקבע בסרטון לדוגמה. חשוב לתעד את זמן ההתחלה של תנועה כיוונית לאחר שהפלנרית תהיה חופשיה מהמכחול ששימש להעברתה לצלחת ה-pLmV, ולאחר מכן להמשיך בכל דקה לאחר מכן. אם תכנון הוא חלק מהדרך דרך תיבה בדקה, קו הרשת הבא שנחצה לאחר הפעלה מחדש של הווידאו יש לספור כתיבה מלאה.  כאשר החיה נעה סביב קצה המנה, יש להתייחס אל הקווים כשהם מתרחקים מהצלחת כדי לקבוע מרחק של 0.5 ס"מ. כאשר תולעים נתקלות בפינה של תיבה, עיין בקו השני חצה כדי להבקיע קו רשת אחד. תמיד להתמקד בראש כדי להפוך את ההחלטות האלה. אם התכנון מתחיל לכסות אזור צר, הנסוי צריך שוב לעקוב אחר ראש התולעת כדי לפקח על המרחק של תיבת רשת מלאה. דוגמה של אופן פעולה זה נכלל וידאו משלים(איור 3A תוספת).

כדי לתמל את התוצאות מכל ניסיון, יש לחשב ולתוות את ריצות ה- pLmV כמספר התיבות חצו ביחס להתקדמות של תולעת הבקרה התואמת (איור 3B). כל משתמש צריך להיות מאומן לבצע את ההסתה וספירת קווי רשת לפני תחילת בדיקות באמצעות reagents של עניין. כאמת מידה, באמצעות ההתניה הניסיונית, תכנון מי מעיין מכסה בדרך כלל כ-24 קופסאות ב-3 דקות (איור 4A; נתונים מ-4 משתמשים, ממוצע של 24.8 ± 4.8). יש לבחון מגוון ריכוזי רייגנטים כדי לקבוע את סוג הניתוח ההתנהגותי שישמש עבור כל אחד מהם. לניתוח pLmV, החוקרים צריכים לקבוע אם בעלי החיים להציג תנועתיות כאשר נחשפים (איור 4B). סוגים אחרים של ניתוחים התנהגותיים עשויים להיות יעילים יותר עבור סוגים שונים של התנהגויות (ראה דיון). ביחס לבקרת מי המעיין, נתוני ממריצים יסוימו מספר גדל והולך של קווי רשת חצו כאשר בעל החיים נע דרך מיכל ה-pLmV עם הריכוז הרצוי של הבדיקה של reagent במי מעיין, לאחר שהיה מותק באותו ריכוז של reagent הבדיקה. לעומת זאת, נתוני הנסיגה יתכננו מספר הולך ופוחת של קווי רשת חצו, יחסית לבקרת מי המעיין, כאשר התכנון עובר דרך מיכל pLmV שיש מי מעיין לבד, לאחר שהיה מותנה בריכוז הרצוי של ריאגנט מעורב במי מעיין (איור 4C ו 4D). במיוחד, נתוני גמילה באופן בלתי חוקי יכולים להוביל ספירת רשת פחות מאלה של הפקדים, כפי שנצפה בנתוני גמילה המושרה סמים על ידיקבוצות אחרות 2,6.

תכנון בקרת מי מעיין יעבור מעל קווי רשת למשך הניסוי. עם זאת, ייתכן שתכנון הבדיקה יפסיק לחצות קווי רשת במהלך הבדיקה. במקרה זה, יש לסמן נתונים אלה בנפרד מנתונים על תולעים ששומרות על התקדמותן בקווי הרשת. תיעוד נתונים אלה כאחוז מהמספר הכולל של בעלי חיים שנחשפו לריכוז רבאגנט מסוים זה היא דרך יעילה להמחיש את התדירות היחסית של ממצאים אלה(איור 5A-C, איור 5A תוספת ותוספת איור 5B). יש לכלול התנהגויות שלא מונעות מהפלנריים לחצות קווי רשת בניתוח ה-pLmV, גם אם תנועות אלה מונעות את ההתקדמות הקבועה של בעלי החיים.

Figure 1
איור 1: כיוונון מייצג עבור ה- pLmV assay.
יש להכין את מרחב המעבדה לפני תחילת ההתאסה. מוצגת התקנה טיפוסית עם צלחת פטרי 10 ס"מ הממוקמת מעל נייר רשת למינציה 0.5 ס"מ. מצלמת מסמך ממוקמת כך תצוגה ברורה של צלחת פטרי 10 ס"מ ניתן להקליט במחשב מקושר. עם זאת, כל מצלמה יכולה לשמש לתיעוד ההתקדמות של planarians במהלך הניסוי כולל מצלמת טלפון סלולרי ממוקם מעל הצלחת פטרי באמצעות דוכן טבעת. ברקע יש צלחת פטרי 5 ס"מ לשטוף תולעים לניסווני גמילה, כמו גם מכולות לבנות קטנות המשמשות למגורים planarians. כמו כן, ברקע מסומנים, מסורים מכחול בצבעי מים עגולים, פיפטות, ומנות פטרי עבור כל ריכוז מוצר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: גליון נתונים pLmV.
גליון נתונים מוכן כדי לתעד את מספר קווי הרשת חצו, יחסית המתאימה לנתוני שליטה, כמו גם אמצעי לספירה של כל התנהגות שימושית למטרות איסוף נתונים. ראה איור 2 תוספת עבור גרסת PDF להורדה של דמות זו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניסוי מייצג של pLmV וגליון נתונים.
(א)מצלמה צריכה להיות ממוקמת מעל צלחת פטרי 10 ס"מ המשמשת ל- pLmV assay כך planarian ואת הרשת המלאה 0.5 ס"מ מתחת לצלחת גלוי בבירור. יש להקליט את הפעלת pLmV המלאה (איור 3A תוספת), ו- (B) מספר קווי הרשת חצו כל דקה הממוקמים בטבלת נתונים מוכנה. יש לספר את קווי הרשת הכוללים המצטברים, ולאחר מכן יש להמיר אותם למספר הקווים המצטברים שחצו ביחס לתולעת בקרת מי המעיין המתאימה. הנתונים בטבלת ה איורים שסופקו(B)תואמים את הספירות באמצעות הווידאו המשלים(איור 3A תוספת). ספירות פקדים מתאימות אינן מוצגות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: גרפים מייצגים של נתוני ממריצים ונסיגה.
חוקרים צריכים להיות מאומנים להשתמש ולהבקיע את קווי רשת תסוואי pLmV באמצעות מי מעיין לבד לפני ניסויים. בדרך כלל, planarians לנסוע על 25 קווי רשת ב 3 דקות (A) נתונים מארבעה משתמשים מוצג, כל אחד עם 10 תולעי בקרת מי מעיין.  כדי להעריך את ההשפעה של reagent על תנובת תכנון, סדרה של ריכוזים נסקרים באמצעות תסוואי pLmV ואת המספר הכולל של קווי רשת חצו נבחנים יחסית ספירות הבקרה המתאימה ב 3 דקות. (ב)נתוני בקרה מיוצגים על-ידי מייצגי העץ הלבן. נתוני הבדיקה מיוצגים על-ידי הסורגים השחורים, כאשר הריכוזים המשמשים ב- mM. יחסית לנתוני בקרה יש להתוות כדי לייצג בצורה הטובה ביותר את הנתונים הנאספים. (ג)נתוני ממריצים המיוצגים על ידי הקו הכחול/יהלומים, יוצגו עלייה בקווי הרשת חצו, לעומת נתוני נסיגה (D), המיוצגים גם על ידי הקו הכחול/יהלומים, תסתכם במדרון יורד מערך התחלתי התחלתי, ביחס לנתוני הבקרה, כפי שמוצג על ידי הקו האדום/ריבועיםבשני (C ו-D). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: התבוננות ותיעוד של נתונים התנהגותיים.
תכנון ב- pLmV assay כי אינם לשמור על תנועה כיוונית במהלך הניסוי, אבל להפסיק עם התנהגויות אופייניות ולא עוד לנוע על הרשתות צריך להיערך. התנהגויות אופייניות עשויות לכלול תצוגות כ'נדנוע' (A ו- איור 5A תוספת), ו' stop ' (תוספת B ו- איור 5B). יש להציג נתונים התנהגותיים אלה כדי לתעד את התדירות של התנהגויות אלה בהשוואה לכל בעלי החיים שנחשפו לריכוז מוצר זה (C). מוצגים נתונים לדוגמה המתעדים את האחוזים של בעלי חיים לבקרת מי מעיין (Ci), ובעלי חיים שנחשפו לממריץ (Cii), לאחר משוטט (כחול), עצירה (אדום) או לא (ירוק) התנהגות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תנועתיות פלנרית פשוטה ונגישה מתוארת כדי לקבוע את ההשפעות ממריצות ונסיגה של מוצרים טבעיים. כמודל התנהגותי יש צורך בפרוטוקולים מחמירים לניקוד תנועה והגדרות ברורות של התנהגויות כלשהן כדי לתמלן תצפיות בין ניסויים שונים. הרעיונות שהוצגו מציעים הדגמה של איך זה יכול להיות מושגת. כל מעבדה המשתמשת בפרוטוקול זה צריכה להתאים את המידע המוצג כך שיתאים להשפעות של המוצר המסוים שנבחן. מומלץ להגדיר בזהירות את סביבת העבודה כדי להבטיח בדיקות יכול להיעשות בתנאים עקביים על ידי כל חוקר המעורב במחקר (איור 1). ניתן להרכיב גליונות הקלטה מתוקנת כדי לסייע בשמירה מדויקת על רשומות ואיסוף נתונים על תנועות והתנהגויות(איור 2 ואיור 3B).

בדיקות תנועית צריכות להיעשות בזמנים שונים של היום, באמצעות קבוצות שונות של planarians אם אפשר, כדי להסביר את הסטת פעילויות היממה הטבועה. בעוד ניתוחים אלה לא נערכו, מוצע כי החוקרים לפקח על איך השעון הביולוגי התכנון עשוי להשפיע על תנונית על ידי שמירה על תכנון באמצעות מחזור אור / כהה סטנדרטי (למשל, 12/12), ובזמן ביצוע תסנומת pLmV, להשתמש בתנאי תאורה סטנדרטיים ולהפעיל את הבדיקותבאותו הזמן של היום 32,33,,34. החוקרים צריכים לתרגל את המכניקה של תסחם pLmV וללמוד לספור קווי רשת כדי לתקנן הן את הטיפול של planarians ואת ההערכה של תנוענות פלנרית(איור 3). יש לעשות זאת באמצעות בקרות מי מעיין טהורות. בדרך כלל, לאחר 10-20 ריצות תרגול כאלה, הנתונים הופכים די סטנדרטיים עבור כל חברי המעבדה. יש לבחור לאחר זמן pLmV מוגדר כדי להשוות את ההתקדמות בלימוד ההסתה. החוקרים בדרך כלל צופים כ 24 קווי רשת חצו על ידי 3 דקות ב- pLmV assay במים מעיין בעקבות 2 דקות מגורים במים מעיין ( איור 4A ; נתוניםמייצגים עבור ארבעהחוקרים עם 10 בקרות מי מעיין אקראיים כל אחד; 24.8 ± 4.8 קווי רשת). לאחר שניים או שלושה חוקרים מיומנים ביצוע כל קבוצה של בדיקות יכול לשפר עוד יותר את האמינות של התוצאות כי כל השפעות ספציפיות למשתמש על השיטה ספירות ניתן לקחת בחשבון בניתוח השגיאה. בדרך זו, ניתן להחליף בדיקות וספירות בין החוקרים, כך שניתן לעשות ספירות "עיוורות" לתנאים הניסיוניים. כדי להקטין את הסיכוי להטיה, אנשים שונים יכולים לערוך בדיקות סטטיסטיות על נתוני הספירה ולבצע את הניתוחים הבאים. מחוץ לנוכחות המוצר שנבחן, יש להימנע מווריאציות סביבתיות באיכות המים כגון טמפרטורה ו-pH. מכיוון שהלנריים רגישים לאור, הגדרת הניסוי צריכה להבטיח שתאורת סביבת העבודה תיווה. לבסוף, מכיוון שתכנון יכול להפגין התנהגויות מלומדות, כל תולעת, כולל פקדים, צריכה לשמשרק פעם אחת 26,27.

זה שימושי יש רשימה ניסיונית במעבדה אם מספר ניסויים עובדים עם הבדיקה, במיוחד במעבדת מחקר לתואר ראשון, כדי למנוע מלכודות נפוצות שעלולות להתרחש בעת הפעלת בדיקת pLmV, אשר ישפיע על הערך הסטטיסטי של התוצאות. כל הפתרונות צריכים להיות בטמפרטורת החדר כי תנוענות פלנרית מופחתת בטמפרטורות נמוכות יותר. יש לנקוט טיפול כדי להבטיח כי הדגימות מורעבות 5-10 ימים לפני השימוש בהם, כי כל דגימה נוצרת במלואה, עם ראש וזנב פיגמנט לחלוטין. כמו כן מוצע כי מכחולים ייעודיים שטוחים או עגולים בצבעי מים (מספר 3-6), מכולות מגורים, וצמי פטרי ישמשו עבור כל ריכוז ניסיוני כדי להפוך את זרימת העבודה חלקה יותר עבור המתנסה. הטכניקה של העברת התכנון באמצעות מכחולים קטנים שטוחים או עגולים בצבעי מים צריכה להיות מתובלת בהרחבה על ידי החוקרים כדי להבטיח העברה יעילה של התולעים בין מכולות מבלי לגרום לפגיעה או מצוקה לבעלי החיים (ראה דיון לעיל; איור 4א). השימוש במכחולים אלה ממזער את העברת הנוזלים בין המכולות ומפחית את הלחץ הפוטנציאלי על התכנון. עם זאת, פלנריים יכולים להיפגע על ידי הזיפים אם הסיבים מפוזרים או משוחקים כאשר הם יוצרים קשר עם החיה.

מכיוון שאסאי pLmV מסתמך על נתונים התנהגותיים, חיוני להשתמש ב- data set גדול מספיק כדי להבטיח נתונים חזקים למרות שונות תגובת תולעת לתולעת מולדת. לכן, רוב המעבדות משתמשות בלפחות תשעה עד שתים עשרה מתכננים כדי לבדוק כל ריכוז של המוצר שנבחן, במיוחד משום שלמוצרים טבעיים לא תהיה השפעה כמו תרופותרגילות 1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,13,,14,,15,,16,,35,,36. מספר קווי הרשת שחצו בכל דקה מחושב ביחס לנתוני בקרת מי המעיין עבור כל בדיקה יום ושעה. נתונים אלה הם ממוצע עבור כל ריכוז בדיקה עבור כל דקה בהשוואה לנתוני הבקרה, כמו גם ריכוזים אחרים התואמים זמן באמצעות שני מבחני T של סטודנט ו- ANOVA.

ה-pLmV מיועד ללימודים של רייאגנטים המשפיעים על התנוניות של התכנון למשך זמן ההסתה. מחקרים מפורטים על תנועות פלנריות יכולים לערך באמצעות מספר הערכות אחרות המתוארות בספרות4,35,36,37,38. לכן, כדאי לערוך סדרה של ניסויי מגורים כדי לשים לב כיצד התכנון מגיב לריאגנט הבדיקה באמצעות מגוון ריכוזים והשוואות כל השפעה עם ההתנהגות של התולעים במעיין לפני היציאה לבדיקות התנהגותיות. בדרך זו, ניתן לבחור את הבדיקה ההתנהגותית המתאימה כדי ללמוד את הגינונים הפרטניים המושרה על ידי reagent על planarian. התכנון יכול להיות ממוקם בריכוזים שונים של reagent במשך 5-10 דקות כדי לקבוע אם ריכוז מאפשר להם לשמור על התנהגות השחייה האופיינית שלהם. התנהגויות שלא מאפשרות תנוי, כגון אלה הנובעות מסוג C, או התנהגות עוויתת או כמו התקף, היו המוקד של מחקרים באמצעות סוגים נפרדים של ניתוחים התנהגותיים שניתן להחיל על שיטה זו4,39,40. ניתן לבצע ניתוחי pLmV באמצעות מגוון ריכוזים לאחר זמני מגורים קצרים ומספר קווי הרשת הכוללים חצו ב-3 דקות בציון יחסית לפקדי מי מעיין לפני ניתוחי גירוי ונסיגה של קורס זמן (איור 4B)1,2,3,4,5. מומלץ לחוקרים לדגום פעמים אחרות, כגון 15, 30 ו- 60 דקות, כדי לראות אם דינמיקת הגירוי משתנה עם זמן החשיפה1. כפי שדווח, בתולעי בקרת מי מעיין שומרות על תנועה אופקית יציבה, מכוונת קדימה למשך 10 דקות1,4. לעומת זאת, תולעים שטופלו במוצר עלולות לעצור ולהפסיק את התנוניות הכיוונית שלהן במהלך ההסכם ולא לחצות עוד קווי רשת. החוקר יכול להחליט אם להגביל את אורך הריצה הניסיונית של ה-pLmV או להפיק אמצעי להערכת התנהגויות אלה כמתואר. עם זאת, חשוב להעריך את התדירות של התנהגויות אלה, מכיוון שהן מספקות נתונים נוספים המשפיעים על התנוניות. נתוני תנועתיות ותנועה נדונים בנפרד בתחום מכיוון ששילוב המידע מבלבל את ההערכה של נתונים אלה4,35,36,37,38. בדרך לדוגמה, שתי התנהגויות נצפו כאשר התולעים נעצרו ולא חצו עוד קווי רשת במהלך ההסכם. תנועות אלה נקראות "לשוטט" (איור 5א ו- איור 5A תוספת), ו' עצור' (איור 5B ו- איור 5B תוספת). התדירות של התנהגויות אלה מתועדת כאחוזים מכל בעלי החיים שנחשפו לריכוז המוצרים הספציפי יחד עם נתוני הבקרה (איור 5C). חשוב לציין, יש לכלול התנהגויות אקראיות שלא מונעות מהפלנרי לחצות קווי רשת בניתוח pLmV, גם אם תנועות אלה מונעות את ההתקדמות הקבועה של בעלי החיים (איור 4B, 3 mM ו 10 mM ברים). כפי שהוזכר, חוקרים תיארו מספר קטגוריות התנהגותיות כי הם מעבר להיקף של דיון זה של שיעור pLmV של פרוטוקול תנועית4,35,36,37,38.

ה-pLmV מסתמך על מסיסות המים של המוצר תחת חקירה. רבים של חומרים אלה, עם זאת, אינם מסיסים לחלוטין במים, ולכן, רק את החלקים מסיסים במים ניתן לבדוק על ידי תסיסה זו בעוד השאר יש לסנן מהפתרון כפי שנעשהבעבודה קודמת 1. אם ה-pLmV מנוהל באמצעות reagents solubilized באמצעות ממיסים אחרים מאשר מים, אלה דורשים שליטה שווה ערך נפח בנוסף לבקרת מי המעיין. בעוד שיטה זו לא היה בשימוש עם חומרים כאלה, פקדים וקטוריים כאלה סביר להתייחס כמבחן, ואת התנועתיות הבקיע ביחס פקדים כמו כל חומר בדיקה אחר. אמצעי אפשרי נוסף לבדוק חומרים לא מסיסים יהיה להאכיל אותם ל planarians על ידי ערבוב אותם לתוך ג'למזון. טכניקה זו משמשת כדי להציג siRNA ל planarians בגנים להפיל / RNAi ניסויים41. האכלה planarians מוצרים ביולוגיים siRNA, עם זאת, מציג סיבוכים לתוואי זה בכך planarians לא יהיה מורעב ולא ניתן להעביר למכל תסיסה תוך זמן סטנדרטי המבטיח חשיפה שווה או צריכה של המוצר תחת חקירה על ידי בעלי חיים ניסיוניים לפני הבדיקה.

לאחר דינמיקת ממריצים ונסיגה הוקמו באמצעות אסייג pLmV, ניסויים נוספים יכולים לכלול comodulators, המבוא של siRNA, כמו גם משנה מסלול ביולוגי או תרופות כדי לבדוק את ההגדלה או עיכוב של תופעות התנועתיות שנצפו בהשוואה לתוצאות הראשוניות שנאספו כאשר לא באמצעות אלהביואפנולטורים 1,,3. לדוגמה, הפחתת רגולציה של הביטוי של גן או הוספת מעכבי מסלול יכול להקטין את קצב התנועה, בעוד שאחרים עשויים לשנות את הדינמיקה של נסיגה. באמצעות ההתבוננות של תוצאות pLmV שהשתנו, ניסויים נוספים אלה יכולים לספק תובנה על הפיזיולוגיה הבסיסית המושפעת מוצר טבעי או ריאגנט בדיקה אחר5,42,43,44.

ההליך המתואר הוא מותנה לכל מעבדה המעוניינת לקבוע את ההשפעות ממריצות ונסיגה של מגוון של אפנונים ביולוגיים, כולל מוצרים טבעיים רבים. היתרונות של היישום של אסייג pLmV תכנון כוללים כמה זול וקל לתחזק בעלי חיים אלה, ושהם יכולים גם להיות נושאים עבור אחרים מבוססי תכנון אומר לספק הבנה רחבה של ההשפעות הפיזיולוגיות של המוצר תחת חקירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר במשרד של קידום מוסדי, ואת קרן מוריסוויל המכללה למענק פרסום כדי לתמוך בעבודה זו, כמו גם את SUNY מוריסוויל קולג'יט מדע וטכנולוגיה כניסה התוכנית (CSTEP) על הסיוע המתמשך שלהם ותמיכה של מחקר לתואר ראשון ב SUNY מוריסוויל. ברצוננו גם להודות לסופיה הוטצ'נס על הערות מועילות על הטכניקה המתוארת.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottled Water - 1 Gal. Poland Spring N/A Spring water for planarian culture and to prepare solutions
Brown Planaria (Dugesia tigrina) Carolina Biological Supply Company 132954 Brown planaria living (other species are acceptable)
Flat Paintbrush Royal Crafter's Choice 9159 Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers
Glass Petri Dish - 10 cm Kimax N/A 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay
Glass Petri Dish - 5 cm Kimax N/A 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation
Grid Paper Any N/A Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay
iPEVO Visualizer (software) iPEVO https://www.ipevo.com/software/visualizer Document camera software for video capture and recording
Metalware Set with Support Stand and Retort Ring Any N/A Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used
Organic Egg Any N/A Organic egg or beef liver for feeding planarains
Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL Beckman N/A Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation
Round Storage Container - 10 cm Ziploc N/A 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer
Round Water Paint Brush LOEW-Cornell N/A Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft
Transfer Pipette Any N/A Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians
USB Document Camera iPEVO CDVU-06IP Document camera (or other camera or cell phone camera)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
  2. Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
  3. Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
  4. Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
  5. Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
  6. Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
  7. Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
  8. Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
  9. Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
  10. Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
  11. Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
  12. Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
  13. Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
  14. Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
  15. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
  16. Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
  17. Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
  18. Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
  19. Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
  20. Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
  21. Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
  22. Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
  23. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
  24. Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
  25. de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
  26. Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
  27. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
  28. Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
  29. Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
  30. Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
  31. Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
  32. Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
  33. Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
  34. Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
  35. Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
  36. Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
  37. Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
  38. Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
  39. Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
  40. Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
  41. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
  42. Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
  43. Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
  44. Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).

Tags

ביוכימיה גיליון 159 פלנרי pLmV תנועה התנהגות ממריץ נסיגה
תסה תנוענות פלנרית כדי לאמוד את המאפיינים של מודולים ביולוגיים של מוצרים טבעיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voura, E. B., Pulquerio, C. H.,… More

Voura, E. B., Pulquerio, C. H., Fong, R. A. M. V., Imani, Z., Rojas, P. J., Pratt, A. M., Shantel, N. M., Livengood, E. J. A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products. J. Vis. Exp. (159), e61070, doi:10.3791/61070 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter