Her presenterer vi en protokoll for isolasjon, transfection og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter.
Ex vivo kultur av voksne pattedyr kardiomyocytter (CMs) presenterer det mest relevante eksperimentelle systemet for in vitro studiet av hjertebiologi. Voksne pattedyr-CMs er terminalt differensierte celler med minimal proliferativ kapasitet. Den post-mitotiske tilstanden til voksne CMs begrenser ikke bare kardiomyocyte celle syklus progresjon, men begrenser også den effektive kulturen av CMs. Videre er den langsiktige kulturen i voksne CMs nødvendig for mange studier, for eksempel CM spredning og analyse av genuttrykk.
Musen og rotten er de to mest foretrukne laboratoriedyrene som skal brukes til kardiomyocyteisolering. Mens den langsiktige kulturen av rotte CMs er mulig, er voksne mus CMs utsatt for døden og kan ikke dyrkes mer enn fem dager under normale forhold. Derfor er det et kritisk behov for å optimalisere celleisolasjonen og den langsiktige kulturprotokollen for voksne murine CMs. Med denne modifiserte protokollen er det mulig å isolere og kultur både voksne mus- og rotte-CMs i mer enn 20 dager. Videre er siRNA transfection effektiviteten av isolert CM betydelig økt sammenlignet med tidligere rapporter. For voksen mus CM isolasjon benyttes Langendorff perfusjonsmetoden med en optimal enzymløsning og tilstrekkelig tid for fullstendig ekstracellulær matrisedissosiasjon. For å oppnå rene ventrikulære CMs, ble begge atria dissekert og forkastet før de fortsatte med disassociation og plating. Cellene ble spredt på en lamininbelagt plate, noe som tillot effektiv og rask feste. CMs fikk lov til å bosette seg for 4-6 h før siRNA transfection. Kulturmedier ble oppdatert hver 24 timer i 20 dager, og deretter ble CMs fikset og farget for hjertespesifikke markører som Troponin og markører for cellesyklus som KI67.
Hjertesykdommer er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden. Nesten alle typer hjerteskader resulterer i et betydelig tap av voksne kardiomyocytter (CMs). Voksne pattedyrhjerter er ikke i stand til å reparere hjerteskaden på grunn av den senescent naturen til den voksne CM1. Dermed resulterer enhver fornærmelse mot det voksne pattedyrhjertet i et permanent tap av CMs, noe som fører til redusert hjertefunksjon og hjertesvikt. I motsetning til voksne pattedyr, kan små dyr som sebrafisk og newt hjerter regenerere hjerteskaden gjennom eksisterende CM-spredning2,,3,,4. En verdensomspennende innsats pågår for å finne en ny terapeutisk intervensjon for hjerteskade via både proliferative og ikke-proliferative tilnærminger. I de siste tiårene har ulike typer genetiske musemodeller blitt utviklet for å studere hjerteskade og reparasjon. Men ved hjelp av in vivo dyremodeller fortsetter å være en dyr tilnærming med den ekstra kompleksiteten for å tyde en celle-autonom mekanisme fra sekundære effekter. Dessuten er in vivo-systemer utfordrende å analysere CM-spesifikke effekter av en farmakologisk intervensjon som induserer kardiobeskyttende signalering fra CM.
Videre er den langsiktige kulturen av voksne CMs nødvendig for å utføre CM spredningsanalyser. CM spredningsanalyser krever minst 4-5 dager for celler som skal induseres i cellesyklusen og for å få nøyaktige data etter det. I tillegg er studier som benytter isolerte CMs for elektrofysiologiske studier, legemiddelscreening, toksisitetsstudier og Ca++ homeostasestudier alle behov for et forbedret kultursystem5,,6,,7. Videre viser nyere studier kardiobeskyttende betydning av cytokiner utskilles fra CMs (cardiokines)8,9. For å undersøke den terapeutiske rollen og molekylære mekanismen til disse kardiokinene under hjertereparasjon og regenerering, er det nødvendig med en langvarig kultur.
Voksen rotte CMs er robust nok for encellede isolasjon og langsiktig kultur i et in vitro system10,11,12. Imidlertid er voksne mus CMs av stor interesse for in vitro-analyser, på grunn av tilgjengeligheten av en rekke genmodifiserte musemodeller, noe som gjør det mulig å designe og utføre ulike innovative analyser som ikke er mulige med rotte CM13. I motsetning til voksen rotte CM isolasjon, er det ganske utfordrende å få en encellede suspensjon fra voksne musehjerter, og den langsiktige kulturen av voksne mus CMs i kultur er enda mer utfordrende.
Voksen CM isolasjon fra mus og rotte hjerter ved hjelp av en Langendorff system har tidligere blitt etablert for å studere CMfunksjon 5,14,15. Her har vi beskrevet i detalj protokollene for voksen CM-isolasjon fra både rotter og mus, samt en modifisert langsiktig kultur, transinfeksjon og CM-spredning av isolerte celler.
Det er et kritisk behov for å etablere en protokoll for voksen kardiomyocyte isolasjon og langsiktig kultur for å utføre cellespesifikke mekanistiske studier. Det er bare noen få rapporter som diskuterer voksne CM isolasjonsprotokoller, og enda færre av dem brukes til langsiktig kultur av voksne mus CM15,16,17. Det er vist at den voksne rotte CM har en høyere toleranse for in vitro kultur enn de voksne musene CM<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Institutt for patologi og laboratoriemedisin, University of Cincinnati, College of Medicine, til Dr. Onur Kanisicak; et stipend fra National Institutes of Health (R01HL148598) til Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak støttes av American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam støttes av American Heart Association postdoktorstipend (AHA_20POST35200267). Dr Malina J. Ivey støttes av et NIH T32-stipend (HL 125204-06A1).
2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
EdU | Life Technologies | C10337 | |
Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Light Microscope | Nikon | ||
Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |