Summary

Isolasjon, transfection, og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter

Published: October 10, 2020
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll for isolasjon, transfection og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter.

Abstract

Ex vivo kultur av voksne pattedyr kardiomyocytter (CMs) presenterer det mest relevante eksperimentelle systemet for in vitro studiet av hjertebiologi. Voksne pattedyr-CMs er terminalt differensierte celler med minimal proliferativ kapasitet. Den post-mitotiske tilstanden til voksne CMs begrenser ikke bare kardiomyocyte celle syklus progresjon, men begrenser også den effektive kulturen av CMs. Videre er den langsiktige kulturen i voksne CMs nødvendig for mange studier, for eksempel CM spredning og analyse av genuttrykk.

Musen og rotten er de to mest foretrukne laboratoriedyrene som skal brukes til kardiomyocyteisolering. Mens den langsiktige kulturen av rotte CMs er mulig, er voksne mus CMs utsatt for døden og kan ikke dyrkes mer enn fem dager under normale forhold. Derfor er det et kritisk behov for å optimalisere celleisolasjonen og den langsiktige kulturprotokollen for voksne murine CMs. Med denne modifiserte protokollen er det mulig å isolere og kultur både voksne mus- og rotte-CMs i mer enn 20 dager. Videre er siRNA transfection effektiviteten av isolert CM betydelig økt sammenlignet med tidligere rapporter. For voksen mus CM isolasjon benyttes Langendorff perfusjonsmetoden med en optimal enzymløsning og tilstrekkelig tid for fullstendig ekstracellulær matrisedissosiasjon. For å oppnå rene ventrikulære CMs, ble begge atria dissekert og forkastet før de fortsatte med disassociation og plating. Cellene ble spredt på en lamininbelagt plate, noe som tillot effektiv og rask feste. CMs fikk lov til å bosette seg for 4-6 h før siRNA transfection. Kulturmedier ble oppdatert hver 24 timer i 20 dager, og deretter ble CMs fikset og farget for hjertespesifikke markører som Troponin og markører for cellesyklus som KI67.

Introduction

Hjertesykdommer er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden. Nesten alle typer hjerteskader resulterer i et betydelig tap av voksne kardiomyocytter (CMs). Voksne pattedyrhjerter er ikke i stand til å reparere hjerteskaden på grunn av den senescent naturen til den voksne CM1. Dermed resulterer enhver fornærmelse mot det voksne pattedyrhjertet i et permanent tap av CMs, noe som fører til redusert hjertefunksjon og hjertesvikt. I motsetning til voksne pattedyr, kan små dyr som sebrafisk og newt hjerter regenerere hjerteskaden gjennom eksisterende CM-spredning2,,3,,4. En verdensomspennende innsats pågår for å finne en ny terapeutisk intervensjon for hjerteskade via både proliferative og ikke-proliferative tilnærminger. I de siste tiårene har ulike typer genetiske musemodeller blitt utviklet for å studere hjerteskade og reparasjon. Men ved hjelp av in vivo dyremodeller fortsetter å være en dyr tilnærming med den ekstra kompleksiteten for å tyde en celle-autonom mekanisme fra sekundære effekter. Dessuten er in vivo-systemer utfordrende å analysere CM-spesifikke effekter av en farmakologisk intervensjon som induserer kardiobeskyttende signalering fra CM.

Videre er den langsiktige kulturen av voksne CMs nødvendig for å utføre CM spredningsanalyser. CM spredningsanalyser krever minst 4-5 dager for celler som skal induseres i cellesyklusen og for å få nøyaktige data etter det. I tillegg er studier som benytter isolerte CMs for elektrofysiologiske studier, legemiddelscreening, toksisitetsstudier og Ca++ homeostasestudier alle behov for et forbedret kultursystem5,,6,,7. Videre viser nyere studier kardiobeskyttende betydning av cytokiner utskilles fra CMs (cardiokines)8,9. For å undersøke den terapeutiske rollen og molekylære mekanismen til disse kardiokinene under hjertereparasjon og regenerering, er det nødvendig med en langvarig kultur.

Voksen rotte CMs er robust nok for encellede isolasjon og langsiktig kultur i et in vitro system10,11,12. Imidlertid er voksne mus CMs av stor interesse for in vitro-analyser, på grunn av tilgjengeligheten av en rekke genmodifiserte musemodeller, noe som gjør det mulig å designe og utføre ulike innovative analyser som ikke er mulige med rotte CM13. I motsetning til voksen rotte CM isolasjon, er det ganske utfordrende å få en encellede suspensjon fra voksne musehjerter, og den langsiktige kulturen av voksne mus CMs i kultur er enda mer utfordrende.

Voksen CM isolasjon fra mus og rotte hjerter ved hjelp av en Langendorff system har tidligere blitt etablert for å studere CMfunksjon 5,14,15. Her har vi beskrevet i detalj protokollene for voksen CM-isolasjon fra både rotter og mus, samt en modifisert langsiktig kultur, transinfeksjon og CM-spredning av isolerte celler.

Protocol

Alle eksperimenter bør utføres i samsvar med retningslinjene i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr publisert av U.S. National Institute of Health (NIH). Alle protokollene som vises i videoen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Cincinnati, College of Medicine. 1. Forberedelse før hjerteutvinning fra voksne mus (og rotter) Forbered den tilsvarende perfusjonen, enzymet og stoppløsningene, i henhold til oppskriftene gitt…

Representative Results

Den nåværende modifiserte protokollen muliggjør effektiv isolasjon og kultur av rotte og mus CMs in vitro. For rotte CM isolasjon ble totalt 3 voksne (12 uker gamle) hann Fischer 344 rotter brukt i prosedyren. Figur 1 viser kirurgisk apparat og isolasjonsoppsett som kreves i prosedyren; hver del er merket og beskrevet i figurlegenden. Kollagnase type 2 ble brukt til fordøyelsen, noe som gir en høy mengde høykvalitets CMs fra vellykket isolasjon (Figur 2A)….

Discussion

Det er et kritisk behov for å etablere en protokoll for voksen kardiomyocyte isolasjon og langsiktig kultur for å utføre cellespesifikke mekanistiske studier. Det er bare noen få rapporter som diskuterer voksne CM isolasjonsprotokoller, og enda færre av dem brukes til langsiktig kultur av voksne mus CM15,16,17. Det er vist at den voksne rotte CM har en høyere toleranse for in vitro kultur enn de voksne musene CM<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Institutt for patologi og laboratoriemedisin, University of Cincinnati, College of Medicine, til Dr. Onur Kanisicak; et stipend fra National Institutes of Health (R01HL148598) til Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak støttes av American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam støttes av American Heart Association postdoktorstipend (AHA_20POST35200267). Dr Malina J. Ivey støttes av et NIH T32-stipend (HL 125204-06A1).

Materials

2,3-Butane Dione monoxime Sigma-Aldrich B-0753
Blebbistatin APExBIO B1387
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3059
CaCl2 Sigma-Aldrich 449709
Cell culture plate Corning Costar 3526
Cell strainer BD Biosciences 352360
Cel-miR-67 Dharmacon CN-001000-01-50
Collagenase type2 Worthington LS004177
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-20
Disposable polystyrene weighing dishes Sigma-Aldrich Z154881-500EA
Dulbecco's Modified Eagle's medium Thermo Scientific SH30022.01
EdU Life Technologies C10337
Fetal bovine serum Corning 35-015-CV
Fine Point High Precision Forceps Fisherbrand 22-327379
Glucose Sigma-Aldrich G-5400
Hemocytometer Hausser Scientific 1483
Heparin Sagent Pharmaceuticals PSLAB-018285-02
HEPES Sigma-Aldrich H3375
High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps Fisherbrand 12-000-128
Hyaluronidase Sigma H3506
Insulin Sigma-Aldrich I0516-5ML
K2HPO4 Sigma-Aldrich P-8281
KCl Sigma-Aldrich 746436
Light Microscope Nikon
Lipofectamine RNAiMAX Life Technologies 13778-150
MgSO4 Sigma-Aldrich M-2643
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Fisher Scientific S318-500
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-CI
Pentobarbital Henry Schein 24352
Phosphate buffered saline Life Technologies 20012-027
Protease XIV Sigma-Aldrich P5147-1G
Selenium Sigma-Aldrich 229865+5G
siMeis2 Dharmacon s161030
siRb1 Dharmacon s128325
Straight Blunt/SharpDissecting Scissors Fisher Scientific 28252
Straight Very Fine Precision Tip Forceps Fisherbrand 16-100-120
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Transferrin Sigma-Aldrich T8158-100MG
Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor Fisherbrand 22-079-747
Water Bath Fisher Scientific 3006S

References

  1. van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
  2. Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
  3. Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
  4. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  5. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
  6. Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
  7. Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
  8. Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
  9. Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
  10. Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
  11. Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
  12. Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
  13. Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
  14. Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
  15. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
  16. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
  17. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
  18. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
  19. O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
  20. Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
  21. Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
  22. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).

Play Video

Cite This Article
Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (164), e61073, doi:10.3791/61073 (2020).

View Video