Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/61090
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg
* These authors contributed equally

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד מונוציט דם אנושי ראשי, כמו גם ההבידול שלהם לתוך מקרופאגים ותאים דנדריטיים והרכבה עם תאים אפיתל לתוך מודל ריאות אנושי רב תאי. תגובות ביולוגיות של cocultures המורכבים תאים חיסוניים מובדלים או חדוציטים מבודדים טריים או מופשרים, עם חשיפה לגירוייםדלקתיים, מושווים.

Abstract

מודל coculture תא alveolar אנושי מתואר כאן לסימולציה של מחסום רקמת האפיתל alveolar מורכב של תאים אפיתל alveolar סוג II ושני סוגים של תאים חיסוניים (כלומר, מקרופאגים נגזר ים אנושיים [MDMs] ותאים דנדרטיים [MDDCs]). פרוטוקול להרכבת הדגם הרב-תאי מסופק. תאי אפיתל Alveolar (קו תא A549) גדלים ומובדילים בתנאים שקועים על תוספות חדיר בארות דו-תאים, ולאחר מכן בשילוב עם MDMs מובחנים ו- MDDCs. לבסוף, התאים נחשפים לממשק אוויר נוזלי במשך מספר ימים. כמו תאים חיסוניים ראשוניים אנושיים צריך להיות מבודד ממעילים באפי אנושיים, תאים חיסוניים מובדילים מונוציטים טריים או מופשרים מושווים על מנת להתאים את השיטה בהתבסס על צרכים ניסיוניים. המודלים התלת מימדיים, המורכבים מתאי חומוס עם תאים חיסוניים חד-ממדיים או חד-ממדיים המופקים ממונוציטים, מראים עלייה משמעותית סטטיסטית בציטוקין (אינטרלודים 6 ו-8) המשחררים עם חשיפה לגירויים מעוררי דלק (lipopolysaccharide וגורם נמק גידולי α) בהשוואה לתאים לא מטופלים. מצד שני, אין הבדל משמעותי סטטיסטית בין שחרור ציטוקין שנצפה בcocultures. זה מראה כי המודל המוצג מגיב לגירויים דלקתיים בנוכחות MDMs ו MDDCs מובדלים מונוציטים טריים או הפשירים דם היקפי (PBMs). לכן, זהו כלי רב עוצמה לחקירות של תגובה ביולוגית חריפה לחומרים שונים, כולל תרופות תרסיסיות או ננו חומרים.

Introduction

במבחנה תרביות תא ריאות מציעות פלטפורמות חסכוניות, חזקות ומבוקרים היטב כדי להעריך את הסכנות של תרסיסים1. כמערכת תא מודל עבור פנאומוקיטים alveolar אנושי, קו התא אפיתל A549 מבודד אדנוקרצינומה ריאתית משמש לעתים קרובות2. תאים אלה מייצגים תאי אפיתל מסוג II מסוגווה מאזור alveolar 3 והם קו תא ריאות בשימוש נרחב עבור הערכתסיכון ורעילות 1,4,5,,6,,7,,8,,9,,10. קו התא A549 בעל תכונות רלוונטיות של תאי אפיתל מסוג II alveolar, כגון הנוכחות של גופים lamellar אופייני המכיל פוספוליפידיםארוזים בצפיפות 3.

זה כבר הראה כי כאשר התאים הם תרבותיים בממשק אוויר נוזלי (ALI), פעילי שטח משתחרר בצד האפי של תאי אפיתל חשופים לאוויר, הפחתת מתח פני השטח11,12,13. תכונה זו חשובה במיוחד בחקירות ננו-חומרים לנשימה ורעילות. לאחר שננו-חומרים/רעלים בשאיפה מופקדים באזור האלברים, הם מקיימים אינטראקציה ראשונה עם פעילי שטח ריאתיים ועקורים על ידי כוחות הרטבה לתוך ההיפופאה המימית, שם האינטראקציה עם תאיהריאות מתרחשת 14,15. למרות שתאי A549 יוצרים שכבת מונו-שכבה (שיכולה לבלוט יתר על פני שכבות בנקודות זמן מאוחרות יותר כאשר הם מעובדים ב-ALI) ולייצר פעילי שטח, חיסרון הוא היווצרות הצומת ההדוקה שלהם, וכתוצאה מכך ערכי התנגדות חשמלית טרנספיתלאליים נמוכים, אך עדיין מציגים מחסום פונקציונלי נגד חלקיקים בין-תאיים(ננו) טרנסלוקציה 16,17,18.

בריאות, יש מגוון רחב של אוכלוסיות תאים חיסוניים, כולל תאים פוגוציקים ומקצועיים אנטיגן הצגת (כלומר, מקרופאגים ותאים דנדריליים) כי ישירות לתקשר באמצעות מגע תא או איתות בין תאי כדי לשלוט ולשמור על הומואוסטזיס. מקרופאגים ותאים דנדריטיים הם אפקטים חיסוניים מולדים קריטיים ויוזמים של התגובה החיסונית אדפטיבית19. תאים דנדרטיים הממוקם בתוך או מתחת לאפיתל יכולים ליצור בלטות על פני האפיתל ללומן כדי לתפוס אנטיגן. מקרופאגים Alveolar ממוקמים על פני השטח apical של האפיתל ולפעול כתאי זקיף, המייצג את ההגנה התאית הראשונה נגד חומר זר, כמו גם זיהומים חיידקיים, ויראליים ופטריות. הפלסטיות phenotypic שלהם מאפשר אינדוקציה מהירה של תגובות דלקתיות בתגובה לגירויים כאלה, כמו גם מעבר לעורר תגובות אנטי דלקתיות (כלומר, מעכב)תגובות 20.

כדי לדמות את מחסום רקמת האפיתל האלוולרי האנושי, הקמנו מודל קוקולטורה משולשת עם תאי A549 בתוספת מקרופאגים נגזרים מדם אנושי (MDMs) ותאים דנדריטיים (MDDCs) בצדדים האפיים והבזליים,בהתאמה 17. טיפוח מודל זה ב-ALI דווח בעבר16, אפילו עד 72 שעות לאחר חשיפה21. תגובות חיסוניות חריפות חשיפות פחמן צינורות שופרו באופן משמעותי בתרבות התא חשוף ALI לעומת תנאיםשקועים 22. מודל coculture, תרבותי וחשף לחומרים שונים ב ALI, שימש בעבר כדי לחקור cytotoxicity, סטרס חמצוני ותגובות דלקתיות על חשיפות תחמוצת אבץ,23 חומרים הקשוריםגרפן 24,חלקיקי זהב 25,26,פחמן צינורות 21, ו אפר וולקני וחלקיקיםפליטה דיזל 27.

יתר על כן, התפקיד החשוב של מקרופאגים ותאים דנדרטיים כתאי אפקט חיסוני במודל ריאות אנושית במבחנה אושרה. בפרט, תגובה דלקתית מוגברת במודל נצפתה רק בנוכחות תאים חיסוניים בהשוואה למערכות monoculture7. חסרונות פוטנציאליים של שימוש בתאים חיסוניים ראשיים המופקים ממונוצייט הם הנגישות המוגבלת של PBMs, כמו גם וריאציה של תורם לתורם. כפתרון לחסרונות פוטנציאליים אלה, המוצג כאן הוא פרוטוקול המציג cryopreservation של PBMsמבודד טרי 28 עבור הרכבת מודל תרבות התא. מטרת מחקר זה היא להדגים את ההרכבה מודל רקמת אפיתל אדם 3D, כולל בידוד של PBMs ממעילי באפי אנושיים. ההיענות לגירויים דלקתיים מושווה למודל המורכב מ-MDMs ו-MDDCs הבדילים ממחשבי PBMs טריים או מובדלים ממחשבי PBM קפואים/מופשרות.

עבודה עם דגימות דם אנושיות שלא נבדקו כרוכה בטיפול ספציפי כדי למנוע העברה אפשרית של מחלות זיהומיות, כגון HIV (נגיף כשל חיסוני אנושי), צהבת B, ו הפטיטיס C. לכן, השימוש באמצעי הגנה אישיים כגון כפפות, שמלות, מסכות והגנה על העיניים הוא קריטי וחייב להיות בהתאם לעקרונות תרגול מעבדה טובים. הגנות אלה מפחיתות את הסיכון לחשיפת העור או ממברנות ריר לנוזלים שעלולים להיות זיהומיים. בנוסף, עבור אלה המעורבים בטיפול מעילי באפי PBMs, חיסון נגד נגיף הפטיטיס B הוא חובה, ורמות טטר דם של נוגדנים נגד הפטיטיס B חייב להיות מעל 100 IU / L (דרישות חקיקה ספציפיות למדינה צריך להיות מטופל). בנוסף, יש לבצע את כל העבודה במעבדות ברמה 2 של אבטחה ביולוגית (יש לטפל בדרישות חקיקה ספציפיות למדינה). יש לאמץ אמצעי זהירות סטנדרטיים של בריאות ובטיחות הקשורים לעבודה בסביבת מעבדה ולטיפול בתרבות התאים היונקים, לרבות טיפול בפסולת, בעת ניהול הפרוטוקול כולו.

Protocol

העבודה הכוללת מונוציטים ראשוניים מבודדים מדם אנושי אושרה על ידי הוועדה של המשרד הפדרלי לבריאות הציבור בשווייץ (מספר סימוכין: 611-1, Meldung A110635/2) עבור מכון אדולף מרקל.

1. בידוד מונוציטים בדם היקפי (PBMs) ממעילי באפי אנושיים

הערה: הסעיף הבא מתאר את הבידוד של תאים חיסוניים מתוך שקית אחת 50 מ"ל של מעיל באפי, שנרכש ממרכז העירוי השוויצרי בברן, שוויץ.

  1. הכנת ריאגנטים
    1. הכן 100 מ"ל של מאגר הפרדה מגנטית לכל מעיל באפי: 0.5% [w/v] אלבומין סרום של נקבובית (BSA; בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט [PBS]) עם חומצה אתילנדיאמין טטריאטית של 2 מ'ם (EDTA), והתאם ל-pH = 7.2, מסנן סטרילי עם גודל פורה של 0.22 μm). שמור על 4 °C לאורך כל ההליך.
    2. להכין את תא תרבות בינוני (CCM): RPMI 1640 עם 10% [v / v] סרום שורי עובר (FBS), 1% [v / v] L-גלוטמין (כאן, 2 מ'מ ל-גלוטמין), ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (כאן, 100 יחידות/פניצילין מ"ל ו-100 סטרפטומיצין μg/mL).
      הערה: הכמות הנדרשת של כל reagent תלויה במספר התאים שיש לזרוע בשלבים הבאים.
  2. בידוד PBMs
    הערה: יש לחטא את כל כלי הזכוכית וכלי הפלסטיק לפני השימוש. מטעמי בטיחות, מומלץ להשתמש בכלי פלסטיק בעת טיפול בדגימות דם אנושיות כדי להפחית את הסיכון לפציעה בכלי זכוכית.
    1. השתמש במספריים כדי לחתוך את קצה הצינור של התיק המכיל את מעיל באפי.
    2. פזרו את מעיל הבאפי על ידי שפיכת תכולת התיק דרך צינור האוורור של התיק ישירות לשני צנטריפוגות חסויות 50 מ"ל (כ-25 מ"ל כל אחד).
    3. שופכים בעדינות או פיפטה PBS לתוך הצינורות כדי להגיע לנפחים של 50 מ"ל. מערבבים את התוכן על ידי הפיכת הצינור בעדינות הפוך 3x.
    4. מחלקים את תערובת המעיל-PBS באפי לארבעה צינורות צנטריפוגה חרובים חדשים של 50 מ"ל על ידי התזת 25 מ"ל של התערובת בכל צינור טרי.
    5. לאט להניח 13 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינוני מתחת לתערובת מעיל באפי-PBS באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. נתק את הפיפטה המרובה ממחזיק הפיפטה וחבר מיד את הפתח העליון של הפיפטה באגודל כדי למנוע דליפה נוספת של מדיום מעבר הצבע של הצפיפות לתוך תערובת המעיל-PBS של באפי.
      הערה: החזקת הפתח העליון עם האגודל, מניחים את הפיפטה הממולאה בתחתית צינור הצנטריפוגה החרוט, כך שמדיום הצפיפות ההדרגתי זורם באיטיות מתחת לתערובת המעיל-PBS של באפי, ומשאיר כ-1 מ"ל של מדיום הדרגתי בצפיפות בתוך הפיפטה.
    6. חזור על שלב 1.2.5 עם שלושת הצינורות האחרים המכילים את תערובת מעיל-PBS באפי.
    7. צנטריפוגה כל ארבעת הצינורות המכילים את תערובות במשך 20 דקות ב 1,000 x g ו 25 ° C במצב בלימה איטית. השתמש במחזיקים עם מכסי מגן עבור צנטריפוגה.
    8. פתחו את המכסה של כל צינור, הסירו את השכבה העליונה המכילה פלזמה ותזיות דם באמצעות פיפטה סרולוגית, והיפטרו במיכל פסולת נוזלית ביולוגית.
    9. השתמש פיפטה סרולוגית לאיסוף שכבת תא מונו-נו-נוקלארי בדם היקפי, המופיעה כשבר קטן וערעור לבנבי (כ-2-3 מ"מ בעובי) בין הפלזמה לשכבות הבינוניות של הצפיפות. הכדור מכיל כדוריות דם אדומות בתחתית. הימנע מהעברת אריתרושיטים הנוצרים את השכבה התחתונה ביותר. חזור על זה עבור כל ארבעת הצינורות.
      הערה: תאים חד-קוטביים בדם היקפיים מורכבים PBMs לימפוציטים. PBMs יופרדו בליטות לימפוציטים מאוחר יותר במהלך הפרדת CD14+ מגנטי.
    10. תאים מונו-נו-מקלרתיים בדם היקפי בריכה מארבעה צינורות לתוך שתי צינורות 50 מ"ל.
    11. מלאו את שני הצינורות ב-PBS עד 50 מ"ל ומכסים במכסה.
    12. השליכו את שאריות האריתרושיטים והפלזמה מארבעת הצינורות המקוריים במיכל פסולת נוזלית ביולוגית.
    13. צנטריפוגה שני צינורות במשך 8 דקות ב 500 x g ו 18-20 ° C במהירות צנטריפוגה רגילה.
    14. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט עם פיפטה סרולוגית וזרק אותו במיכל פסולת נוזלית מסוכנת ביולוגית.
    15. תוסתה מחדש את התאים עם 5 מ"ל של PBS באמצעות פיפטה סרולוגית.
    16. מאגר מתלי התא לתוך צינור צנטריפוגה חרלי 50 מ"ל ולמלא 50 מ"ל עם PBS.
    17. השתמש 5 μL של מתלה התא כדי לספור את התאים עם מונה תא באמצעות שיטת אי-הכללה טריפאן כחול (45 μL).
    18. פיפטה 10 μL של פתרון טריפאן כחול PBMs לתא מונה תא ולספור את מספר התאים לפי פרוטוקול ספירה סטנדרטי. השתמש במשוואה 1 כדי לחשב את מספר התא הכולל, CT.
      Equation 1
    19. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה צינור 50 מ"ל כפי שנעשה בשלב 1.2.13.
  3. בחירה חיובית CD14
    1. פתחו בעדינות את המכסה של כל שפופרת, ואז הסירו והשליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה סרולוגית מבלי להפריע לדור.
    2. הוסף את הכמות המחושבת (משוואה 2) של מאגר הפרדה מגנטית (כאן, 80 μL של מאגר לכל 1 x10 7 תאים בסך הכל) ולעוסת מחדש את גלולת התא על-ידי pipetting הפתרון למעלה ומטה.
      Equation 2
    3. חשב באמצעות משוואה 3 (כאן, 10 μL לכל 1 x 107 תאים בסך הכל) את אמצעי האחסון המתאים של CD14+ חרוזים מגנטיים פיפטה את אמצעי האחסון המתאים.
      Equation 3
    4. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ומטה, סוגרים את המכסה ומדגירה את הפתרון ב-4°C למשך 15 דקות.
    5. בעת הדגירה, מלאו את הצינור עד 50 מ"ל עם מאגר הפרדה מגנטי.
    6. צנטריפוגה כפי שנעשה בשלב 1.2.13.
    7. שאף וזרוק את supernatant באמצעות פיפטה סרולוגית מבלי להפריע כדורי התא.
    8. פיפטה את הכמות המתאימה של מאגר הפרדה מגנטית (משוואה 4; כאן, 500 μL של מאגר לכל 1 x10 8 תאים) ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ומטה 3x.
      Equation 4
    9. חיטו את תחנת ההפרדה המגנטית על ידי ריסוס וניגוב שלה עם חומר חיטוי. מניחים את מכסה המנוע של זרימת ה למינאר יחד עם העמודה להפרדה מגנטית.
    10. מקם את עמודת ההפרדה המגנטית בשדה המגנטי והציב צינור צנטריפוגה צנטריפוגה חריק של 50 מ"ל ישירות מתחת לעמודה לאיסוף התאים השטיפה והתאים ללא תווית (כלומר, פסולת).
    11. שטיפה של עמודת ההפרדה המגנטית על-ידי התזת מאגר הפרדה מגנטי של 3 מ"ל בעמודה. אל תיתן לעמודה להתייבש לאורך כל ההליך.
    12. הכן צינור צנטריפוגה חורט 15 מ"ל ופיפטה 1 מ"ל של מאגר הפרדה מגנטית.
    13. החל את מתלה התא (מוכן בשלב 1.3.8) על עמודת ההפרדה המגנטית. בצינור צנטריפוגה חרלי 50 מ"ל מתחת למסנן, לאסוף תאים ללא תיוג שעברו דרך.
      הערה: אל תחרוג מ- 2 x10 9 תאים לכל עמודה כדי להימנע מחסימת העמודה.
    14. ברגע שמאגר העמודות ריק (כלומר, כאשר התאים עברו דרך העמודה), החל 3 מ"ל של מאגר הפרדה מגנטי באמצעות פיפטה סרולוגית ותן לו לעבור דרך העמודה. חזור על זה 3x.
    15. הסר את עמודת ההפרדה המגנטית מהמפריד המגנטי על-ידי משיכתו בעדינות בידיים, ולאחר מכן מקם אותה בצינור של 15 מ"ל המכיל מאגר הפרדה מגנטית ב-1.3.12 מ"ל (שהוכן בשלב 1.3.12).
    16. הוסף 5 מ"ל של מאגר הפרדה מגנטית לעמודה ושטוף את התאים המסויגים מגנטית על-ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה.
  4. הכנת ריאגנטים עבור בידול MDM ו-MDDC
    1. ספור את התאים עם מונה תא באמצעות שיטת אי-הכללת trypan blue כפי שנעשה בשלב 1.2.17.
    2. חשב את אמצעי האחסון הדרושים של CCM או FBS לקבלת שלבים נוספים באופן הבא: אמצעי האחסון של CCM המתאים לצפיפות תא של 1 x10 6 תאים/מ"ל (שלב 1.5.1), או אמצעי האחסון של FBS המתאים לצפיפות תא של 6 x 106 תאים לכל 0.9 mL של FBS (שלב 1.6.3).
      Equation 5
    3. סגור את המכסה, הנח את הצינור צנטריפוגה, וצנטריפוגה כפי שנעשה בשלב 1.2.13. הסר וזרוק את חומר העל מבלי להפריע לתא. המשך לשלב 1.5 עבור זריעת תאים או שלב 1.6 להקפאת תאים.
  5. זריעה והבידול PBM ל- MDMs ו- MDDCs
    1. תולה מחדש את גלולת התא בנפח המחושב של CCM כפי שחושב בשלב 1.4.2 (כאן, ריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל) על-ידי התפתלויות למעלה ואחורה פי 3.
    2. פיפט מספר התאים שנועדו להבדיל בין MDMs ו- MDDCs בצינורות צנטריפוגה חסונים נפרדים באמצעות פיפטה סרולוגית.
    3. פיפטה מבדילה גורמים ל-CCM עם PBMs ומערבבים היטב על-ידי התזת למעלה ולמעלה. גורמים מבדילים מוחלים באופן הבא:
      1. עבור MDDCs: ריכוז סופי של 10 ng/mL interleukin-4 (IL-4) ו 10 ng/mL גרנולוקייט-מקרופאג' מושבה מגרה גורם (GM-CSF).
      2. עבור MDMs: ריכוז סופי של 10 ng/mL מקרופאג' מושבה מגרה גורם (M-CSF).
    4. פיפטה מתלים התא ב CCM עם הגורמים ההבדיל הוסיף לתוך 6 לוחות גם על ידי הפצת 3 מ"ל של המתלה לכל באר (מתאים 3 x 106 תאים / טוב, כלומר, 1 x 106 תאים / מ"ל).
    5. מניחים את 6 לוחות הבאר באינקובטור של תרבות התא (37°C, 5% CO2) ותנו להםלהבדיל במשך 6 ימים מבלי לרענן את ה-CCM.
      הערה: ההבידול נע בין 5 ל-8 ימים בהתאם לזמינות המקומית של מעילי באפי והתקנה ניסיונית, בתנאי שעילות ההבידול נקבעת באמצעות הטכניקות המתאימות (עיין בסעיף הדיון).
  6. הקפאת PBM
    1. תולה מחדש את גלולת התא במדיום cryoprotective (כאן, FBS ודימתיל sulfoxide [DMSO; cytotoxic]) ביחס של 9:1 (v/v) על ידי pipetting נפח של FBS חחום מראש. זה מתאים לריכוז תא סופי של 6 x 106 תאים /מ"ל, בהתחשב בתוספת נוספת של 10% DMSO (v/v).
    2. סמן את המספר הרצוי של cryovials במכסה המנוע זרימה למינאר (כלומר, להקליט את התאריך, קוד בידוד, ומספר התאים).
    3. פיפט 0.9 מ"ל של מתלה תא FBS טהור (כאן, 6 x 106 תאים ב 0.9 מ"ל של FBS) לכל cryovial. לאחר מכן, לאט פיפטה 0.1 מ"ל של DMSO ולערבב את המתלים היטב על ידי הפיכת cryovials למעלה ומטה 3x.
    4. מעבירים את ההקפאה למכל הקפאת תאים ומיד הגדר אותו ל- -80 °C למשך 24 שעות.
    5. לאחר 24 שעות, להסיר את cryovials מן -80 ° C מקפיא ומיכל ולמקם אותם לתוך מיכל חנקן נוזלי מתאים לאחסון תאים.
  7. הפשרה והבידול של PBM ל- MDMs ו- MDDCs
    1. מחממים את כל הריאגנטים הנדרשים ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים (כ-20-30 דקות).
    2. הכן את המספר המתאים של 6 לוחות באר המתאימים למספר התאים הפשרת (כאן, צלחת אחת לכל 1.8 x10 7 תאים, כלומר 3 cryovials). פיפטה 2 מ"ל של CCM לכל באר בתנאים אפטיים. מניחים את הלוחות באינקובטור (5% CO2, 37°C) למשך 15 דקות כדי לאפשר ל-pH להתאזן.
    3. קח את הכמות הנדרשת של cryovials עם תאים קפואים ממכל חנקן נוזלי ומערבבים אותם בעדינות באמבט מים 37 °C (1-2 דקות) כדי להבטיח הפשרה אחידה של מתלי התא.
    4. הסר את cryovial מאמבט המים ולחטא עם חומר מחטא, להבטיח כי הסוכן אינו אינטראקציה עם המכסה וטבעת O.

      הערה: בהן, יש להשלים את כל השלבים בתנאים אפטיים.
    5. הכן את המספר המתאים של צינורות צנטריפוגה חרובים 15 מ"ל המתאימים למספר cryovials להיות הפשיר (כאן, 6 x 106 תאים / שפופרת). פיפטה 9 מ"ל של CCM חנום מראש לתוך כל צינור.
    6. פיפטה לאט (טיפה אחר טיפה) את התוכן של cryovial לתוך צינור המכיל CCM. סגור את המכסה, חזור על כל שפופרת, וצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות במהירות צנטריפוגה רגילה.
    7. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לדור.
    8. תולה מחדש את הכדור מכל צינור (המכיל תאים מ cryovial אחד) ב 2 מ"ל של CCM חחום מראש על ידי pipetting למעלה ומטה באמצעות פיפטה סרולוגית (צפיפות תאים המתאימה 3 x 106 תאים / מ"ל).
    9. מכל שפופרת, פיפטה התאים resuspend לתוך שתי בארות (1 מ"ל לבאר) של צלחת 6 באר המכילה 2 מ"ל של CCM מוכן בעבר להגיע לצפיפות תא של 3 x 106 תאים / גם (מתאים לריכוז הסופי של 1 x 106 תאים / מ"ל). חזור על זה עבור כל הצינורות האחרים.
    10. המשך עם בידול כמתואר בסעיף 1.5.3.
    11. מניחים את 6 לוחות הבאר באינקובטור של תרבות התא (37°C, 5% CO2) ותנו להםלהבדיל במשך 6 ימים מבלי לרענן את ה-CCM.

2. מודל תלת-תאי של רקמת אפיתל אנושית

הערה: סעיף זה מספק הוראות על אמצעי אחסון ומספרי תאים המתאימים ל- 12 תוספות לוחות באר. איור 1 מסכם ציר זמן מוצע להרכבת מודל.

  1. זריעת תא אפיתל (קו תא A549)
    1. תרבות תאי האפיתל על פי המלצות לספק (ATTC). בקצרה, תת-תרבות התאים ב CCM ב 80% confluency תא (כ, 2x-3x בשבוע).
      הערה: תת-תרבות A549 עבור לפחות ארבעה קטעים לפני הרכב מודל coculture, באמצעות תאי A549 בטווח מעבר של 5-25.
    2. פיפטה 1.5 מ"ל של CCM חם מראש לתוך 12 צלחות באר (מספר הבארים מתאים למספר הרצוי של דגמים).
    3. מניחים בודדים 12 גם תרבות התא מוסיף לתוך בארות של צלחת 12 היטב באמצעות פינצטה עיקור.
    4. נתק את התאים מבוקון בהתאם לפרוטוקול תת-טיבציה (כלומר, באמצעות חומר נתק, הסר את הסוכן בצנטריפוגה כפי שנעשה בשלב 1.2.13). תוסף מחדש בנפח המתאים של CCM המתאים לריכוז התא הסופי של A549 (כאן, 50 x10 4 תאים/מ"ל; 0.5 מ"ל של מתלי תא לכל הוספה, כלומר 25 x10 4 תאים/הוספה, אשר מתאים לצפיפות זריעה של 27.8 x 104 תאים/cm 2).
    5. פיפט 0.5 מ"ל של מתלה התא (כלומר, 25 x10 4 תאים/הוספה) לתוך הצד האפאלי של ההוספה באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
    6. מכסים את הצלחות במכסים וממקמים אותן באינקובטור של תא (37°C, 5% CO2) למשך4 ימים.
      הערה: בדוק באופן קבוע את ההתקנלויות של תאי A549 תחת מיקרוסקופ של ניגודיות פאזה.
  2. זריעת MDDC
    1. שאפף CCM עם תאים לא מחוברים ב 6 לוחות באר המכילים MDDCs.
    2. הוסף 1 מ"ל של CCM חנום מראש טרי לכל באר.
    3. השתמש מגרד תא, לנתק (לגרד) MDDCs דבק מכל באר, בעדינות לשטוף את הבארים עם 1 מ"ל הקיים של CCM 3x, ולשלב אותם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט אחד.
    4. לספור את התאים עם מונה תא באמצעות שיטת אי-הכללה כחול trypan באמצעות 10 μL של מתלה תא ו 10 μL של פתרון כחול trypan.
    5. צנטריפוגה מתלה התא כפי שנעשה בשלב 1.2.13.
    6. חשב את אמצעי האחסון CCM הדרוש עבור הפעלה מחדש (משוואה 5):
      צפיפות MDDC נדרשת = 42 x 104 תאים/מ"ל; כל הוספה דורשת 6.3 x 104 תאים, אשר תואם צפיפות תא זריעה של 7 x 104 תא / ס"מ2 (כאן, 150 μL הוסיף על 0.9 ס"מ2 בשלב 2.2.10.).
      אמצעי אחסון CCM עבור הפעלה מחדש של תאים (Vm; משוואה 5):
      Equation 8
    7. שאפף בעדינות וזרוק את ה-CCM מהתא העליון של 12 לוחות באר עם A549 גדל על התוססים.
    8. מניחים את התוסוסים עם תאי A549 בתנוחה הפוכה בצלחת פטרי סטרילית באמצעות פינצטה מחטאת. הכן צינור צנטריפוגה חרוטי (50 מ"ל) עם PBS ולהטות מראש מגרד תא.
    9. לגרד את תאי A549 מפני השטח הבסאלי של המוסף (כלומר, החלק העליון בעמדה הפוכה), אשר צריך לגדול דרך הנקבוביות של תוספות.
      הערה: לשטוף את המגרד עם PBS (מוכן בצינור) בין גירוד דגימות בודדות ולשמור אותו רטוב לאורך כל ההליך.
    10. עם צנטריפוגה (שלב 2.2.5), לשאוף ולהיפטר supernatant, לאחר מכן להסב מחדש את גלולת MDDC בכמות המחושבת של CCM (שלב 2.2.6) ו pipette למעלה ולרדת 3x.
    11. Pipette 150 μL של מתלה התא על גבי כל הוספה כך כל משטח בסיס של הכנס מכוסה באותה מידה עם הנוזל ולא מכיל בועות.
    12. מכסים את המנה במכסה ומכסים באינקובטור של תא למשך 70 דקות. שאיפה CCM מצלחת תרבות התא (שם התוסוסים הונחו בתחילה), להשליך אותו בפסולת נוזלית מסוכנת ביולוגית, ופיפטה 1.5 מ"ל של CCM טרי לתוך כל באר. מכסים את הצלחת במכסה וממקם באינקובטור התא (37°C, 5% CO2).
      הערה: אין לחרוג מזמן הזמן שהוזכר לעיל כדי להימנע מייבוש התאים.
    13. לאחר הדגירה, החזק בזהירות כל תוסף עם פינצטה עיקור והמקם אותם על הצלחות המכילות CCM בתנוחה רגילה. מכסים את הצלחת במכסה ומחזירים אותה לאקובטור התא (37°C, 5% CO2).
  3. זריעת מקרופאג' (MDM)
    1. קח 6 לוחות היטב המכילים MDMs מוערך מראש.
    2. שאפשר והשלך CCM עם MDMs לא מחובר גדל 6 צלחות גם, ו pipette 1 מ"ל של CCM מראש מחמם טרי בכל באר.
    3. באמצעות מגרד תאים, הסר בעדינות MDMs דבק מבארות בודדות (כפי שנעשה בשלב 2.2.3 עבור MDDCs).
    4. פיפטה 10 μL של טריפאן כחול לתוך באר או צינור ולהוסיף 10 μL של השעיית MDM כדי להשיג את דילול הסופי של 1:1 (v / v). ספור את מספר ה- MDMs באמצעות פרוטוקול הספירה המתאים.
    5. צנטריפוגה מתלה התא כפי שנעשה בשלב 1.2.13.
    6. חשב את אמצעי האחסון הנדרש (משוואה 6):
      צפיפות MDM נדרשת = 2.5 x 104 תאים/מ"ל ב- CCM (כאן, כל הוספה דורשת 1.25 x 104 תאים ב- 0.5 מ"ל CCM, המתאים לצפיפות תא זרע של 1.4 x 104 תא/ס"מ2).
      Equation 10(6)
    7. עם צנטריפוגה, לשאוף ולהיפטר supernatant, להציף את גלולת MDM בכמות המחושבת של CCM (שלב 2.3.6), ופיפט למעלה ומטה 3x.
    8. בזהירות פיפטה 0.5 מ"ל של מתלה MDM (מוכן בשלב 2.3.7) על הקיר של תרבות התא מוסיף עם A549 ו MDDCs (לא ישירות על תאי אפיתל) באמצעות פיפטה 1 מ"ל. מכסים לוחות עם מכסים וממקמים באינקובטור של תרבות התא (37°C, 5% CO2)למשך 24 שעות.
  4. העברת מודל coculture לממשק אוויר נוזלי (ALI)
    1. בתום תקופת הדגירה של 24 שעות (±2 ש') של הדגם המורכב באינקובטור של תרבות התא, שואפים ומשליכים CCM מחלקים אפיים ובזליים של תוספות תרבות התאים ומהבארות.
    2. באמצעות פינצטה עיקור, להרים תוספות בודדות מן הבארות פיפטה 0.6 מ"ל של CCM מראש טרי לכל באר באמצעות פיפטה 1 מ"ל. אל תוסיף CCM לצד האפאלי של ההוספה.
    3. מכסים לוחות עם מכסים וממקמים באינקובטור של תרבות התא (37°C, 5% CO2)לשימוש נוסף של 24 שעות מראש.

3. חשיפה לפקדים חיוביים נבחרים (גירויים ידועים לגירוי תגובה דלקתית)

הערה: חשיפה של מודלים coculture לגורם נמק גידול גירוי פרו-דלקית ידוע α7 (TNF-α)7 משמש כדי להמחיש את ההיענות של המודל. יתר על כן, חשיפה לחומר ניקוי (Triton X-100) משמש כדי לאשר את הרגישות של dehydrogenase lactate (LDH) אסא.

  1. הכינו את פתרונות הבקרה החיוביים: מניית LPS (1 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים), מניית TNF-α (100 μg/mL במים מזוקקים) ו-Triton-X 100 (2% [v/v] ב-PBS).
  2. ב-24 שעות הדגירה של מודל הקוקולטורה בתנאי ALI, שואפים ומשליכים את הסופרנטנט מתא הבסאלי. באמצעות פינצטה סטרילית, הרם תוספות בודדות מהבארות ופיפטה 0.6 מ"ל של CCM מחומם מראש טרי לתוך כל באר.
  3. הכן פתרונות עבודה של בקרות חיוביות בודדות על-ידי דילול המניות ב-CCM בצינורות צנטריפוגה חרוץ כדלקמן: 1 μg/mL LPS, 1 μg/mL TNF-α ו- 0.2% Triton-X 100. אמצעי האחסון תואמים למספר התוסוסים שנבדקו (כאן, 100 μL/insert). מערבבים היטב את הפתרונות על-ידי התפתלות כלפי מטה פי 3.
  4. להחיל 100 μL של כל פתרון שליטה חיובית על ידי pipetting לאט על הקיר של הוספת תרבות התא. מכסים את צלחת הבאר במכסה וממקם באינקובטור של תא (37°C, 5% CO2)למשך 24 שעות. עם הדגירה, שאף והשלך את הנוזל בצד האפאלי של התוסף על ידי החזקת תוספות בודדות באמצעות פינצטה.
  5. לאסוף CCM בתאי בסיס ולאחסן ב 1) 4 ° C לניתוח LDH נוסף, הציון קרום התא cytotoxicity בתיווך, ו / או 2) חנות ב -80 °C לניתוח נוסף של שחרור חלבון באמצעות אנזים מקושר אימונוסורבנט (ELISA). הפעל את ההתייברויות בהתאם להמלצות ספק הערכה.
  6. עם הסרת CCM, לשטוף את התוספים עם PBS 3x ולתקן את התאים על תרבית התא מוסיף 4% [w / v] paraformaldehyde (ב PBS, 15 דקות בטמפרטורת החדר) על ידי הבטחת שני הצדדים להוסיף מכוסים היטב עם פתרון PFA. לאחר מכן לשטוף 3x עם PBS כדי להסיר PFA. אחסן את הדגימות השקועות ב- PBS ב- 4 °C לצורך חיסון נוסף (דוגמה לשיטה זו תוארהבעבר 17).

Representative Results

מודלים של תותבת ריאות אנושית, המורכבים מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון, הורכבו מ-MDDCs טריים או קפואים ומחשבי אב חסות MDMs (כאן, מונוציטים הנגזרים מדם היקפי אנושי). כפי שהוצג באות 1,תאי A549 נזרעו 3 ימים לאחר הסעיף הראשון שכלל בידוד/הפשרה חד-צייטיים. לאחר 6 ימים של בידול, MDMs מובחן הופיע עגול בצורת, בעוד MDDCs יצרו צורה מוארך יותר עם בלטים נצפים. הם גם הופיעו כאגלומרטים, במיוחד כאשר הם מובדילים ממונוציטים טריים (איור 2, איור 3). תאי אפיתל יצרו שכבת תאים צפופה של תאים לאחר 3 ימים של צמיחה על ממברנה תוספות (איור 4), כאשר cocultures הורכבו. לאחר 24 שעות של הרכבה ו-24 שעות נוספות של חשיפה לתנאי ALI, התוכנו התוכנות לחשיפה.

ההיענות של מודלים תרבות תא 3D נחקרה עם חשיפה לגירויים מדלקתיים ידועים באמצעות גישה פסאודו-ALI, כמתוארקודם לכן 29. הגירויים הדלקתיים, LPS ו-TNF-α, נוספו בכמויות נמוכות (100 μL) על פני השטח האפאליים של דגם התא החשוף לאוויר. במקביל, היעדר קרע קרום כמדד של cytotoxicity הוערך באמצעות LDH assay. עלייה משמעותית בשחרור LDH ב CCM של תא הבסת נצפתה עם חשיפה לשליטה חיובית לקרע קרום, טריטון-X 100 דטרגנט(איור 5). תוצאות אלה הוכיחו את ההיענות של המודל לחומר cytotoxic, בעוד אין עלייה בשחרור LDH נצפתה על גירוי apical עם TNF-α או LPS.

ניתן לייחס סיבה אפשרית לערכים המדודים השונים של LDH בדגימות המורכבות עם PBMs טריים או קפואים בעבר לאחסון לדוגמה. דגימות מ- PBMs טריים אוחסנו למשך זמן רב יותר ב- -80 °C; לכן, הפעילות של אנזים LDH עלולה לרדת. במיוחד, LDH יציב רק עד 4 ימים ב CCM; לכן, מומלץ לבצע את ההתאסה ביומיים האחרונים לאחר איסוף הסופרנטנטים. לחלופין, ניתן להקפיא את supernatants מיד לאחר האיסוף. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי הקפאה יכולה להקטין את הפעילות האנזימטית של LDH.

הפרשת מתווכים דלקתיים (כאן, TNF-α ו interleukins 6 [IL-6] ו 8 [IL-8]) לתוך CCM בסיס היה לכמת באמצעות ELISA. מבחינה סטטיסטית משמעותי (p < 0.05, ANOVA בכיוון אחד) עליות בשחרור IL-6 ו IL-8 נצפו הן LPS- ו TNF-α- שטופלו בהשוואה לתאים לא מטופלים בהתאמה, כמו גם במודלים תרבות התא שנאספו ממקור PBMs(איור 6). למרות ריכוזים (pg/mL) של כל ציטוקינות שנבדקו CCM בסיס היו גבוהים יותר cocultures מורכב PBMs טרי, ההבדלים בין שתי cocultures monocultures לא היו משמעותיים סטטיסטית (p > 0.05) (איור 6). כדי לאשר את הערך המוסף של מודלים coculture ביחס לתרבות תא אפיתל 2D, מונוקולטורה A549 נחשפו גם LPS או TNF-α. כצפוי, שחרורם של כל המתווכים שנחקרו מ-A549 monocultures היה נמוך יותר בהשוואה לשני המודלים של coculture; למרות שההבדל ביניהם לא היה משמעותי סטטיסטית (p > 0.05, ANOVA חד-כיוון).

מורפולוגיה תאית של מחסום רקמת האפיתל האלברול האנושי 3D הוערך באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (LSM). כדי לדמיין את ההרכב של כל דגם, מקרופאגים בתוך מודלים coculture (MDMs) היו מוכתמים עם סמן מקרופאג בוגר 25F9. MDDCs היו מוכתמים CD83, שהוא סמן חשוב עבור תאים דנדריטייםמופעלים 30. לגבי מורפולוגיה תאית, לא נצפה הבדל בין מודלים coculture באמצעות MDMs ו MDDCs מ PBMs טרי בהשוואה לאלה באמצעות PBMs מופשרים. ב-LPS- ו-TNF-α-חשוף cocultures, שניהם מורכבים תאים חיסוניים טריים וקפואים, שכבה אפיתל משובשת בתמונות LSM נצפתה, אשר לא היה המקרה בתאים לא מטופלים (איור 7, איור 8).

Figure 1
איור 1: ציר זמן סכמטי של הפרוטוקול. הצגת מודל 3D coculture הכנה, הרכבה, ויישום (חשיפה לחומר נבדק). ALI = ממשק נוזלי אוויר, MDDCs = תאים דנדריטיים נגזר מונוציטים, MDMs = מקרופאגים נגזר מונוציטים, PBMs = מונוציטים דם היקפי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: MDMs ו- MDDCs הבדילו ממחשבי PBMs טריים. תמונת מיקרוסקופית ניגודיות שלב של MDMs מובדיל (A) ו - (B) MDDCs מ PBMs טרי (6 ימים לאחר בידוד התא). MDMs הם עגולים, בעוד MDDCs נצפים לעתים קרובות כמו agglomerates. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: MDMs ו- MDDCs מובדילים ממחשבי PBMs קפואים. תמונת מיקרוסקופית ניגודיות שלב של MDMs מובדיל (A) ו - (B) MDDCs מ PBMs מופשרים (6 ימים לאחר הפשרה). MDMs הם עגולים, אבל כמה תאים מוארך ניתן לצפות. MDDCs מופיעים גם עגול בצורת עם בלטים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: גידול תאי אפיתל בממברנה. תמונת מיקרוסקופ ניגודיות שלב של A549 confluent גדל על ממברנה להוסיף 4 ימים לאחר זריעה, ויוצרים שכבה צפופה של תאים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות Cytotoxicity נחקרו באמצעות ממברנה מבוססי קרע (LDH) תסיסה. הנתונים מוצגים כעלייה קיפול על תאים לא מטופלים (ממוצע ± SD, n = 3, כוכבית מציינת עלייה משמעותית סטטיסטית בהשוואה לתאים לא מטופלים, **p < 0.01, ****p < 0.0001). במודלים ירוקים מיוצגים MDMs ו-MDDCs ממחשבי PBMs טריים, ובדגמים סגולים המורכבים מ- PBMs מופרשרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תגובות מדלקות בקולטות ובמונוקולטורה. המתווכים הדלקתיים (TNF-α, IL-6 ו-IL-8) משחררים את התותחות באתגר של 24 שעות עם LPS או TNF-α. הנתונים מוצגים יחסית לתאים לא מטופלים (ממוצע ± SD, n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). במודלים ירוקים מיוצגים MDMs ו-MDDCs ממחשבי PBMs טריים, ובדגמים סגולים המורכבים מ- PBMs מופרשרים. גריי מייצגת מונוקולטורה A549. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: מורפולוגיה של תותבות המורכבות מתאי מערכת החיסון הטריים. תמונות LSM של צדדים אפיים ובזליים של מודל coculture עם הקרנת xz של צדדים apical של המודל באמצעות MDMs ו MDDCs מ PBMs טרי. החץ הלבן מציין MDM, בעוד החץ הירוק מציין MDDC. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: מורפולוגיה של תותבות המורכבות מתאי מערכת חיסוניים קפואים. תמונות LSM של הצד האפאלי של מודל coculture עם הקרנות xz המתאים, וצד בסיס של המודל באמצעות MDMs ו- MDDCs מ PBMs המופשרים. החץ הלבן מציין MDM, בעוד החץ הירוק מציין MDDC. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

ייצור מתפתח של חומרים חדשניים, כולל כימיקלים ותרופות, מגביר בהדרגה את הצורך בדגמי במבחנה חזוי. כדי לציית לשלושת העקרונות של החלפה,הפחתה, ועידון של ניסויים בבעלי חיים 32, במודלים של תאים במבחנה הפכו כלים רבי עוצמה לגבי היבט החלפה וצמצום עבור מנגנונים הבהרה של פעולה של תרופה או חומר8,9,10,11. מוצג כאן פרוטוקול מפורט של הרכבת המודל הרב תאי באמצעות תאים חיסוניים כי הם גם מבודד טרי או הפשיר מונוציטים קפואים בעבר. כמו כן מתואר הטיפוח של המודל ב-ALI. לבסוף, הפרוטוקול ממחיש דוגמה של חשיפה לגירויים דלקתיים ומשווה את התגובה של שני הדגמים המכילים מונוציטים טריים או קפואים.

מחקרים שונים בוצעו כדי לאשר ולהצדיק את הערך המוסף של המורכבות המשופרת של הדגמים שגדלו ונחשפו בתנאי ALI בהשוואהלחשיפה שקועה קונבנציונלית 7,22,31. התבוננות של התגובה הדלקתית גבוהה יותר בcocultures לעומת monocultures של תאים אפיתל לאשר מחקר קודם. המחקר השתמש במודל coculture שהוצג (מגורה עם LPS) והראה תגובה גבוהה יותר ברמות ביטוי גנים של TNF ו IL1B בהשוואה למודל המקבילה מונוקולטורה A5497. מצד שני, שני הדגמים הראו וריאציות גבוהות יותר בתוך ערכי שחרור מגשרדלקתי נמדד לעומת מונוקולטורה A549. ניתן להסביר זאת על ידי שימוש בתאים חיסוניים מתורמים שונים (מעילי באפי) בתוך חזרות ביולוגיות (כלומר, חזרה אחת, תורם אחד), כפי שהוצגקודם לכן 7. אם תרצה, ניתן להתגבר על הווריאציות בין המשכפלים על-ידי 1) באמצעות PBMs מפשירים מאותו תורם או 2) אחסון PBMs מתורמים שונים לפני הקפאת התאים, ולאחר מכן שימוש עוקב של אותה בריכה בכל חזרה. כמו כן מומלץ לכלול חזרות ביולוגיות נוספות.

טכניקת הקפאת התאים יכולה להיחשב כצעד קריטי; עם זאת, זהו הליך מעבדה נפוץ לשימור תאים לניתוח פנוטיפיק ופונקציונלי. מחקרים שונים הראו כי האיכות של PBMs קפוא חיוני להישרדותם, טכניקה הקפאה מתאימה היא המפתח להצלחה של בדיקות עוקבות עם אותם תאים28,32. שינוי הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי הקפאת PBMs, אשר מספק גמישות בהתקנה ניסיונית, כמו הזמינות של מעילי באפי מוגבלת בדרך כלל. יתרון נוסף של שימוש PBMs קפוא (בכמה בקבוקונים) על פני אלה מבודדים טריים הוא כי הם יכולים לשמש בניסויים הבאים גם לאחר 1 שנה. זה מקטין את הבעיה הפוטנציאלית של השתנות תורם לתורם אם זה פרמטר רצוי או נדרש בנסיון.

תוצאות של השוואה בין-עבודה שבוצעה לאחר עד 13 חודשים להראות כי PBMs, כאשר מאוחסנים כראוי במיכל חנקן נוזלי, ניתן להשתמש על פני תקופה ארוכה ללא כל השפעה על הכדאיות שלהתא או שחזור תא 33. זמני אחסון ארוכים יותר (מעל שנה) עשויים להיות אפשריים לאחר אימות קפדני של יכולת הכדאיות של התא והיענות לתא לפני ביצוע ניסוי. כמו כן, הטמפרטורה במיכל החנקן הנוזלי חייבת להישאר יציבה בכל עת. הגורם העיקרי המשפיע על הכדאיות של PBMs cryopreserved נמצא הריכוז DMSO, עם ריכוז אופטימלי של 10%-20 % (v / v)28. כדי למזער השפעות מזיקות של הקפאה, מקורות שונים של חלבונים, FBS או BSA (עם מגוון רחב של ריכוז מ 40% עד 100 %34) מתווספים לעתים קרובות למדיום ההקפאה כרכיבי הגנה טבעיים שיכולים להגדיל את הישרדות התא.

בשל הפוטנציאל ציטוקסי גבוה של DMSO, מומלץ תחילה לפזר PBMs ב FBS, לאחר מכן להוסיף DMSO PBMs כבר מפוזר FBS. במיוחד, למרות ריכוזי FBS גבוהים יותר (>40%) לא הראו כל שיפור בכדאיות התא, באותו זמן, הם לא לגרום נזק לתאים28. אף על פי כן, הקפאת מונוציטים היא גישה אפשרית להתגבר על בעיות של זמינות מוגבלת של מעיל באפי. עם זאת, אם יש צורך בשימוש ב-MDDCs וב-MDMs מ-PBMs טריים, ניתן להבדיל את תאי החיסון ולהשתמש בהם 5-8 ימיםלאחר הבידוד 7,16,17,35,36,37. אם תכנון ניסיוני מאפשר, מומלץ לפחות 6 ימים של בידול הן ב- MDDCs והן ב- MDMs. עם זאת, עקביות בין חזרות שונות באותו ניסוי, יחד עם בדיקות שגרתיות של ביטויי סמן פני השטח הספציפיים שלהם, הם קריטיים. ההיענות לגירוי דלקתי, כגון LPS, לאחר זמן ההבידול יש גם לבדוק באופן קבוע.

חקירות רבות באמצעות קו התא A549 בוצעו ב ALI, או כמונוקולטורה או בשילוב עם סוגי תאים אחרים (מקרופאגים, תאים דנדריטוניים, או פיברובלסטים) לתוך מודל 3D coculture22,24,29,38. באמצעות מודל זה coculture 3D, cytotoxicity, סטרס חמצוני, או השפעות דלקתיות של (ננו-)חומרים נחקרו עד 72 שעות1,17,,21,,24,,29. הדמיון של המודל ברקמת vivo נחקר בעבר בהתבסס על הדמיה לייזר confocal של מודל16. בעת הרכבת המודל, חשוב לשקול הן את התפשטות התאים (אשר יכול להשפיע על A549 במודל המוצג כאן) כמו גם את הביצועים של התאים החיסוניים העיקריים (לא משגשגים) (כאן, MDDCs ו- MDMs). חשוב גם לקחת בחשבון כי לא כל מונוציטים חיוביים CD14 להבדיל MDDCs ו- MDMs, כי התאים יכולים להיות נוכחים הן בטפסים מצורפים מושהים. בהתבסס על אופי ההרכבה coculture (כאן, שני סוגי התא צריך לצרף לשכבה האפיתל הקיימת), מומלץ להשתמש רק תת אוכלוסיות של שני סוגי תאים חיסוניים. בנוסף, ניתוחים שגרתיים של מונוציטים, תגובתיות מונוקולטורה MDDC ו- MDM ל- LPS, וביטוי של סמני משטח ספציפיים (CD14, CD163, CD86, CD93 או CD206, נתונים לא מוצגים) הציעו כי 6 ו 7 ימים של בידול הם נקודות הזמן האופטימליות.

למרות מספר ריאליסטי של תאי אפיתל alveolar בריאות אנושיות מתאים ~ 160,000 תאים / ס"מ2, מספר תאי A549 שנספרו במודל הוא ~ 1,000,000 תאים / ס"מ2 לאחר 9 ימים תרבותיעל להוסיף 16,18. לכן, זה במגבלות מודל המבחנה צריך להיחשב. ראשית, הצפיפות של תאי אפיתל הוקמה בהתבסס על יכולתם ליצור שכבה confluent על קרום גדל. חשוב גם לציין כי A549 מייצג תא אפיתל סוג II עם צורה cuboidal, בניגוד לתאי אפיתל סוג I, שהם שטוחים והחוצה. מצד שני, המספר הנדרש של תאים חיסוניים נקבע בהתבסס על הספרות והוצג בפרוטוקול זה כמספר תא/ שטח פנים39,40,41. צפיפות התא של MDDCs בטווח של 400 תאים/מ"מ2 (4 תאים/ס"מ2)16 דומה לצפיפות התא במצב יציב של 500-750 תאים למ"מ2 (5- 7 תאים/ס"מ2) שדווחו במחקריvivo39. הצפיפות של MDMs במודל זה היא באותו טווח של מצב vivo באזור alveolar האנושי40.

כתמים סמן מקרופאג בוגר (25F9) נצפתה הן בצד apical (שבו MDMs נוכחים) כמו גם בצד בסיס (כלומר, באתר של תאים דנדריטיים). טרנסלוקציה של תאים חיסוניים דרך הממברנה מכניסה נקבוביות אפשרית, נצפתה גם באמצעות מודלזה 16, מה שעשוי להסביר את ההבדלים שנצפו בעוצמות הכתמים. עם זאת, הסבר אפשרי נוסף הוא כי סמן מקרופאג בוגר יכול לבוא לידי ביטוי גם על תאים דנדריטיים, אבל הביטוי הוא מאוד תורם ספציפי42. כמו כן, עוצמת הביטוי 25F9 גבוהה בהרבה ב- MDMs(איור 7, איור 8). שני הגירויים הדלקתיים (LPS ו- TNF-α) השפיעו על שלמות מחסום האפיתל הריאתי בשתי התותבות(איור 7, איור 8). זה היה צפוי בהתבסס עלפרסומים קודמים 43,44 מראה כי ציטוקינות דלקתית ומוצרים חיידקיים לשבש את שלמות של מחסומים אפיתל.

המודל הרב-תאי תלת-מימדי של האפיתל האנושי, שהוקם ומאופייןבעבר 17, שימש ככלי רב עוצמה ושימושי להערכת תגובות ביולוגיות (כלומר, תגובות דלקתיות חריפות, תגובת סטרס חמצוני, חלוקת חלקיקים ותקשורתסלולרית) במבחנה 21,24,,25,,45. התוצאות מאשרות את האחריות של מודלים coculture לגירויים proinflammatory (כאן, LPS ו TNF-α). התגובה הוגדלה מעט בעת שימוש בתאים חיסוניים PBMs טריים; עם זאת, לא היה הבדל משמעותי סטטיסטית בין cocultures באמצעות PBMs טרי לעומת הפשיר. יתר על כן, התגובות הדלקתיות של שני מודלים coculture היו גבוהים יותר מאלה של מונוקולטורה של תאים אפיתל מעובד תחת אותם (עלי) תנאים. לסיכום, הפרוטוקול מתאר את ההרכבה של מודל coculture רקמות אפיתל אנושי 3D באמצעות PBMs טרי או הפשיר עבור בידול לתוך MDMs ו MDDCs. הוא מוצג כי שני הדגמים מגיבים מאוד לגירוייםדלקתיים; לכן, הם יכולים לשמש ככלים רבי עוצמה עבור הערכות סיכון ורעילות פוטנציאליות.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לד"ר מיגל ספוק-קאלבר על תוכנית החיים בדמות 3 ולד"ר בגם בגום קראקובאק על הקריאה הביקורתית. מחקר זה נתמך על ידי פרויקט PATROLS, תוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי לשנת 2020 במסגרת הסכם מענק מס' 760813, ועל ידי קרן אדולף מרקל. בי.די. מודה לקרן פיטר וטראודל אנגלהורן על התמיכה הכספית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchmark microplate reader does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland
Cell culture Incubator does not have to be specific
Cell freezing container (for example Mr. Frosty) does not have to be specific
Centrifuge does not have to be specific
Confocal laser scanning microscope does not have to be specific, for example Zeiss LSM 710 meta
Heamatocytometer, or automatic cell counter does not have to be specific
Laminar bio-safety hood class II does not have to be specific
MultiStand Macs (Macs Cell Separator) Miltenyi, Germany 130-042-303
pH meter does not have to be specific
Phase contrast inverted light microscope does not have to be specific
Pipette boy, pipettors (different volumes) do not have to be specific
Scissors do not have to be specific
Vacuum pump does not have to be specific
Water bath does not have to be specific
Disposable small equipment/glassware Catalogue Number
15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes does not have to be specific
6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile Falcon, Switzerland 353046 and 353043
Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size Falcon, Switzerland 353181
Cell scrapper does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 353085
Cryovials do not have to be specific
Glass autoclaved Petri Dishes do not have to be specific
LS Columns Miltenyi, Germany 130-042-401
Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 10040-446
Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) does not have to be specific
Sterile pipettes do not have to be specific
Chemicals
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Switzerland A7030-100g
CD14+ MicroBeads human - magnetic beads Miltenyi, Germany 130-097-052
Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red Gibco, Switzerland 25300054
Density gradient medium Lymphoprep Alere Technologies AS, Norway 1114547
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich, Switzerland D2438
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Switzerland E6758-100g
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco, Switzerland 10270-106
Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-093-864
Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade Miltenyi, Germany 130-095-373
Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-096-485
L-glutamine Gibco, Switzerland 25030-024
Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli Sigma-Aldrich, Switzerland 4524-5mg
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Switzerland 158127
Penicilin-Streptomycin Gibco, Switzerland 15140-122
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Switzerland 10010-015
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) Gibco, Switzerland 42401-018
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Switzerland T8787
Trypan blue solution (0.4%) Sigma Aldrich, Switzerland
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) Immunotools 11343015
Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche, Switzerland 11644793001
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY206
Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY208
Immunostaining
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL Sigma-Aldrich, Switzerland 10236276001
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL Abcam, UK ab150115
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL Agrisera, Sweden AS09 633
Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland 14-0115-82
Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland R415
Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution Abcam, UK ab244204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
  2. Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
  3. Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
  4. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
  5. Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
  6. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438 (2016).
  7. Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
  8. Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
  9. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  10. Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
  11. Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950 (2017).
  12. Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
  13. Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
  14. Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
  15. Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
  16. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
  17. Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
  18. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
  19. Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999 (2019).
  20. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  21. Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
  22. Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
  23. Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
  24. Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
  25. Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
  26. Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
  27. Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67 (2016).
  28. Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
  29. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
  30. Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
  31. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12 (2013).
  32. Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
  33. Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176 (2009).
  34. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
  35. Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
  36. Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
  37. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303 (2006).
  38. Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
  39. Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
  40. Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
  41. Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  42. Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
  43. Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
  44. Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
  45. Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).

Tags

ביולוגיה גיליון 159 תותביות ריאות אנושיות קוקולטות אנושיות תלת-מיוד ממשק נוזלי אוויר בידוד מונוציטים של דם היקפי אנושי מקרופאגים ראשוניים ותאים דנדריטים תאים חיסוניים עיקריים
מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barosova, H., Drasler, B.,… More

Barosova, H., Drasler, B., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment. J. Vis. Exp. (159), e61090, doi:10.3791/61090 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter