Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor primaire menselijke bloed monocyten isolatie evenals hun differentiatie in macrofagen en dendritische cellen en assemblage met epitheliale cellen in een meercellige menselijke long model. Biologische reacties van coculturen bestaande uit immuuncellen onderscheiden van vers geïsoleerde of ontdooide monocyten, bij blootstelling aan pro-inflammatoire stimuli, worden vergeleken.
Abstract
Een menselijke alveolaire cel cocultuur model wordt hier beschreven voor simulatie van de alveolaire epitheelweefsel barrière bestaat uit alveolaire epitheel type II cellen en twee soorten immuuncellen (dat wil zeggen, menselijke monocyten afgeleide macrofagen [MDMs] en dendritische cellen [MDDC's]). Er is een protocol voor het samenstellen van het meercellige model aanwezig. Alveolaire epitheelcellen (A549-cellijn) worden gekweekt en gedifferentieerd onder ondergedompelde omstandigheden op doorlaatbare wisselplaten in tweekamerputten, vervolgens gecombineerd met gedifferentieerde MDM's en MDDC's. Ten slotte worden de cellen gedurende enkele dagen blootgesteld aan een lucht-vloeistofinterface. Aangezien menselijke primaire immuuncellen moeten worden geïsoleerd van menselijke buffy jassen, worden immuuncellen die zich onderscheiden van verse of ontdooide monocyten vergeleken om de methode op basis van experimentele behoeften op maat te maken. De driedimensionale modellen, samengesteld uit alveololische cellen met vers geïsoleerde of ontdooide monocyten-afgeleide immuuncellen, tonen een statistisch significante toename van cytokine (interleukineën 6 en 8) vrijkomen bij blootstelling aan proinflammatorische stimuli (lipopolysaccharide en tumor necrose factor α) in vergelijking met onbehandelde cellen. Aan de andere kant is er geen statistisch significant verschil tussen de cytokine-afgifte die in de coculturen wordt waargenomen. Hieruit blijkt dat het gepresenteerde model reageert op pro-inflammatoire stimuli in aanwezigheid van MDM's en MDDC's die zich onderscheiden van verse of ontdooide perifere bloedmonocyten (PBM's). Het is dus een krachtig instrument voor onderzoeken naar acute biologische respons op verschillende stoffen, waaronder aërosolen of nanomaterialen.
Introduction
In vitro longcelculturen bieden kosteneffectieve, robuuste en goed gecontroleerde platforms om de gevaren van aerosolen te beoordelen1. Als modelcelsysteem voor menselijke alveolaire pneumocyten wordt de epitheel A549-cellijn geïsoleerd van een longadenocarcinoom vaak gebruikt2. Deze cellen vertegenwoordigen plaveiselcellen van type II uit alveolaire regio3 en zijn een veelgebruikte longcellijn voor de beoordeling van gevaar en toxiciteit1,4,5,6,7,8,9,10. De A549-cellijn beschikt over relevante kenmerken van epitheel type II-cellen van alveolaire stoffen, zoals de aanwezigheid van karakteristieke lamellenlichamen die dicht verpakte fosfolipidenbevatten 3.
Het is aangetoond dat wanneer de cellen worden gekweekt op een lucht-vloeibare interface (ALI), oppervlakteactieve agent wordt vrijgegeven aan de apicale kant van lucht-blootgestelde epitheelcellen, het verminderen van oppervlaktespanning11,12,13. Deze functie is met name belangrijk bij onderzoeken naar het gevaar en de toxiciteit van nanomaterialen. Zodra ingeademde nanomaterialen/toxicanten in het alveolaire gebied worden gedeponeerd, werken ze eerst samen met longentegenwerkzaam en worden ze door bevochtigingskrachten verplaatst in de waterige hypophase, waar de interactie met longcellen plaatsvindt14,15. Hoewel A549-cellen een monolaag vormen (die op latere termijnen kunnen overgroeien tot meerlaags wanneer ze bij ALI worden gekweekt) en oppervlakteactieve stoffen produceren, is een nadeel hun onvoldoende strakke verbindingsvorming, wat resulteert in lage transepitheliale elektrische weerstandswaarden, maar nog steeds een functionele barrière vormt tegen intercellulaire (nano)deeltjestranslocatie 16,17,18.
In de longen is er een verscheidenheid aan immuuncelpopulaties, waaronder fagocytische en professionele antigeen-presenterende cellen (d.w.z. macrofagen en dendritische cellen) die rechtstreeks communiceren via celcelcontact of intercellulaire signalering om homeostase te controleren en te behouden. Macrofagen en dendritische cellen zijn kritische aangeboren immuuneffectors en initiatiefnemers van de adaptieve immuunrespons19. Dendritische cellen die zich binnen of onder het epitheel bevinden, kunnen uitsteeksels vormen over het epitheel naar het lumen om antigenen te vangen. Alveolaire macrofagen bevinden zich op het apicale oppervlak van het epitheel en fungeren als schildwachtcellen, die de eerste cellulaire verdediging tegen vreemd materiaal en bacteriële, virale en schimmelinfecties vertegenwoordigen. Hun fenotypische plasticiteit maakt het mogelijk om snel pro-inflammatoire reacties in reactie op dergelijke stimuli te krijgen en te verschuiven naar ontstekingsremmende (d.w.z. remmende) reacties20.
Om de epitheelweefselbarrière van de menselijke alveolaire te simuleren, hebben we een drievoudig cocultuurmodel opgezet met A549-cellen aangevuld met menselijke bloedmonocyten-afgeleide macrofagen (MDM's) en dendritische cellen (MDDC's) aan de apicale en basale zijden, respectievelijk17. Teelt van dit model bij ALI is eerder gemeld16, zelfs tot 72 uur na blootstelling21. Acute immuunresponsen op blootstelling aan koolstofnanobuisjes werd aanzienlijk verbeterd in de celcultuur die aan de ALI werd blootgesteld in vergelijking met ondergedompelde omstandigheden22. Het cocultuurmodel, gekweekt en blootgesteld aan verschillende materialen bij ALI, is eerder gebruikt om cytotoxiciteit, oxidatieve stress en ontstekingsreacties te onderzoeken op blootstelling aan zinkoxide,23 grafeengerelateerde materialen24, gouden nanodeeltjes25,26, koolstofnanobuisjes21en vulkanische as- en dieseluitlaten27.
Bovendien is de belangrijke rol van macrofagen en dendritische cellen als immuuneffectorcellen in een in vitro menselijk longmodel bevestigd. In het bijzonder werd een verhoogde proinflammatorische respons in het model alleen waargenomen in aanwezigheid van immuuncellen in vergelijking met monocultuursystemen7. Mogelijke nadelen van het gebruik van primaire monocyten-afgeleide immuuncellen zijn de beperkte toegankelijkheid van PBM's en donor-tot-donor variatie. Als een oplossing voor deze potentiële nadelen, hier gepresenteerd is een protocol de invoering van cryopreservatie van vers geïsoleerde PBMs28 voor de cel cultuur model assemblage. Het doel van deze studie is om de 3D menselijke alveolaire epitheelweefsel model assemblage aan te tonen, met inbegrip van de isolatie van PBM's van menselijke buffy jassen. Het reactievermogen op pro-inflammatorische stimuli wordt vergeleken met het model dat bestaat uit MDM's en MDDC's die zich onderscheiden van verse PBM's of onderscheiden van bevroren/ontdooide PBM's.
Werken met ongeteste menselijke bloedmonsters omvat specifieke zorg om de mogelijke overdracht van infectieziekten te voorkomen, zoals HIV (human immunodeficiency virus), hepatitis B en hepatitis C. Daarom is het gebruik van persoonlijke beschermende maatregelen zoals handschoenen, toga's, maskers en oogbescherming van cruciaal belang en moet het in overeenstemming zijn met goede laboratoriumpraktijken. Deze bescherming vermindert het risico van het blootstellen van de huid of slijmvliezen aan potentieel besmettelijke vloeistoffen. Bovendien is vaccinatie tegen het hepatitis B-virus verplicht voor degenen die betrokken zijn bij de behandeling van buffycoats en PBM's en bloedtiterniveaus van antilichamen tegen hepatitis B (landspecifieke wettelijke vereisten moeten worden aangepakt). Bovendien moeten alle werkzaamheden worden uitgevoerd in laboratoria op bioveiligheidsniveau 2 (landspecifieke wettelijke vereisten moeten worden aangepakt). Bij het uitvoeren van het gehele protocol moeten standaard gezondheids- en veiligheidsmaatregelen worden vastgesteld die verband houden met het werken in een laboratoriumomgeving en de behandeling van de celkweek van zoogdieren, met inbegrip van de verwerking van afval.
Protocol
Het werk met primaire monocyten geïsoleerd van menselijk bloed werd goedgekeurd door de commissie van het Federaal Bureau voor Volksgezondheid Zwitserland (referentienummer: 611-1, Meldung A110635/2) voor het Adolphe Merkle Instituut.
1. Isolatie van perifere bloedmonocyten (PBM's) van menselijke buffy jassen
OPMERKING: De volgende sectie beschrijft de isolatie van immuuncellen uit een zak van 50 mL van een buffy jas, gekocht bij het Zwitserse Transfusion Centre in Bern, Zwitserland.
- Bereiding van reagentia
- Bereid 100 mL magnetische scheidingsbuffer per buffylaag voor: 0,5% [w/v] runderserumalbumine (BSA; in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]) met 2 mM ethyleenediaminetetraaceticum (EDTA) en pas aan op pH = 7,2, steriel filter met 0,22 μm poriegrootte). Houd op 4 °C gedurende de hele procedure.
- Bereid het celkweekmedium (CCM): RPMI 1640 met 10% [v/v] foetaal runderserum (FBS), 1% [v/v] L-glutamine (hier, 2 mM L-glutamine) en 1% [v/v] penicilline-streptomycine (hier, 100 eenheden/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine).
OPMERKING: De vereiste hoeveelheid van elk reagens is afhankelijk van het aantal cellen dat in de volgende stappen moet worden gezaaid.
- Isolatie van PBM's
LET OP: Alle glas en plasticware moet voor gebruik worden gesteriliseerd. Om veiligheidsredenen wordt het gebruik van plastic hardware aanbevolen bij het hanteren van menselijke bloedmonsters om het risico op letsel met glaswerk te verminderen.- Gebruik een schaar om het slangeinde van de zak met de buffy jas open te snijden.
- Verdeel de buffy jas door het gieten van de inhoud van de zak door het kanaal van de zak rechtstreeks in twee conische centrifuge 50 mL buizen (~ 25 mL per stuk).
- Giet of pipet PBS voorzichtig in de buizen om 50 mL volumes te bereiken. Meng de inhoud door de buis 3x zachtjes ondersteboven te draaien.
- Verdeel het buffy coat-PBS mengsel in vier nieuwe 50 mL conische centrifuge buizen door pipet 25 mL van het mengsel in elke verse buis.
- Leg langzaam 13 mL dichtheidsgradiënt medium onder het buffy coat-PBS mengsel met behulp van een 10 mL serologische pipet. Maak de gevulde pipet los van de pipethouder en sluit de bovenste opening van de pipet onmiddellijk met een duim aan om extra lekken van het dichtheidsgradiëntmedium in het buffy coat-PBS-mengsel te voorkomen.
OPMERKING: Houd de bovenste opening met de duim, plaats de gevulde pipet aan de onderkant van de conische centrifuge buis, zodat de dichtheid gradiënt medium langzaam stroomt onder de buffy coat-PBS mengsel, waardoor ongeveer 1 mL van de dichtheid gradiënt medium in de pipet. - Herhaal stap 1.2.5 met de andere drie buizen met het buffy coat-PBS mengsel.
- Centrifugeren alle vier de buizen die de mengsels gedurende 20 minuten bij 1.000 x g en 25 °C bij een langzame remmodus bevatten. Gebruik houders met beschermende deksels voor centrifugatie.
- Open het deksel van elke buis, verwijder de bovenste laag met plasma en bloedplaatjes met behulp van een serologische pipet en gooi in een biohazard vloeistofafvalcontainer.
- Gebruik een serologische pipet voor het verzamelen van de perifere bloed mononucleaire cellaag, die verschijnt als een witachtige troebele kleine fractie (~ 2-3 mm in dikte) tussen het plasma en de dichtheid gradiënt middelgrote lagen. De pellet bevat rode bloedcellen aan de onderkant. Vermijd het overbrengen van erytrocyten die de onderste laag vormen. Herhaal dit voor alle vier de buizen.
OPMERKING: Perifere bloedmononucleaire cellen bestaan uit PBM's en lymfocyten. PBM's worden later tijdens de magnetische CD14+ scheiding gescheiden van lymfocyten. - Pool perifere bloed mononucleaire cellen van vier buizen in twee 50 mL buizen.
- Vul de twee buizen met PBS tot 50 mL en dek af met een deksel.
- Gooi de overgebleven erytrocyten en plasma uit de originele vier buizen in een biohazard vloeibaar afval container.
- Centrifugeren de twee buizen gedurende 8 minuten bij 500 x g en 18-20 °C bij een regelmatige centrifugesnelheid.
- Verwijder na centrifugatie de supernatant met een serologische pipet en gooi deze weg in een biohazard vloeistofafvalcontainer.
- Resuspend de cellen met 5 mL PBS met behulp van een serologische pipet.
- Bundel de celsuspensies in één kegelvormige centrifugebuis van 50 mL en vul tot 50 mL met PBS.
- Gebruik 5 μL van de celsuspensie om de cellen met een celteller te tellen met behulp van de trypanblauwe (45 μL) uitsluitingsmethode.
- Pipette 10 μL van de trypan blue-PBMs oplossing in een celtellerkamer en tel het aantal cellen per het standaard telprotocol. Gebruik vergelijking 1 om het totale celnummer, CT.
- Na het tellen van de cellen, centrifugeren de 50 mL buis zoals gedaan in stap 1.2.13.
- CD14 positieve selectie
- Open voorzichtig het deksel van elke buis en verwijder en gooi de supernatant weg met behulp van een serologische pipet zonder de pellet te storen.
- Voeg de berekende hoeveelheid (vergelijking 2) van magnetische scheidingsbuffer (hier, 80 μL buffer per 1 x 107 totale cellen) toe en resuspend de celpellet door de oplossing op en neer te pipetten.
- Bereken met behulp van vergelijking 3 (hier, 10 μL per 1 x10 7 totale cellen) het overeenkomstige volume van CD14+ magnetische kralen en pipet het juiste volume.
- Meng goed door op en neer te pipetten, sluit het deksel en broed de oplossing 15 minuten lang uit op 4 °C.
- Vul de buis bij incubatie tot 50 mL met magnetische scheidingsbuffer.
- Centrifuge zoals gedaan in stap 1.2.13.
- Aspirate en gooi de supernatant met behulp van een serologische pipet zonder verstoring van de cel pellet.
- Pipette de overeenkomstige hoeveelheid magnetische scheidingsbuffer (Vergelijking 4; hier, 500 μL buffer per 1 x 108 cellen) en meng voorzichtig door 3x op en neer te pipetten.
- Desinfecteer het magnetische scheidingsstation door het te spuiten en af te vegen met een steriliserend middel. Plaats in de laminaire stroomkap samen met de kolom voor magnetische scheiding.
- Plaats de magnetische scheidingskolom in het magnetisch veld en plaats een lege kegelvormige centrifugebuis van 50 mL direct onder de kolom voor het verzamelen van de was- en niet-gelabelde cellen (d.w.z. afval).
- Spoel de magnetische scheidingskolom door 3 mL magnetische scheidingsbuffer in de kolom te pipetten. Laat de kolom niet uitdrogen tijdens de procedure.
- Bereid een 15 mL conische centrifugebuis en pipet 1 mL magnetische scheidingsbuffer voor.
- Breng de celsuspensie (voorbereid in stap 1.3.8) aan op de magnetische scheidingskolom. Verzamel in de 50 mL conische centrifugebuis onder het filter niet-gelabelde cellen die erdoorheen zijn gegaan.
OPMERKING: Niet meer dan 2 x 109 cellen per kolom om te voorkomen dat de kolom wordt geblokkeerd. - Zodra het kolomreservoir leeg is (d.w.z. wanneer de cellen door de kolom zijn gegaan), past u 3 mL magnetische scheidingsbuffer toe met behulp van een serologische pipet en laat deze door de kolom gaan. Herhaal dit 3x.
- Verwijder de magnetische scheidingskolom van de magnetische scheidingsvorm door voorzichtig met de handen te trekken en plaats deze vervolgens in een buis van 15 mL met voor pipetted 1 mL magnetische scheidingsbuffer (bereid in stap 1.3.12).
- Voeg 5 mL magnetische scheidingsbuffer toe aan de kolom en spoel de magnetisch gelabelde cellen door de zuiger stevig in de kolom te duwen.
- Reagensvoorbereiding voor MDM- en MDDC-differentiatie
- Tel de cellen met een celteller met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode zoals uitgevoerd in stap 1.2.17.
- Bereken de vereiste volumes CCM of FBS voor verdere stappen als volgt: ofwel het volume CCM dat overeenkomt met een celdichtheid van 1 x10 6 cellen/mL (stap 1.5.1), ofwel het volume FBS dat overeenkomt met een celdichtheid van 6 x 106 cellen per 0,9 mL FBS (stap 1.6.3).
- Sluit het deksel, plaats de buis in de centrifuge, en centrifuge zoals gedaan in stap 1.2.13. Verwijder en gooi de supernatant weg zonder de celpellet te verstoren. Ga naar stap 1,5 voor celzaaien of stap 1,6 voor celbevriezing.
- PBM zaaien en differentiatie in MDMs en MDDC's
- Resuspend de celpellet in het berekende volume van CCM zoals berekend in stap 1.4.2 (hier, een uiteindelijke concentratie van 1 x 106 cellen/mL) door 3x op en neer te pipetten.
- Pipette het aantal cellen dat bestemd is om zich te onderscheiden in MDMs en MDDC's in afzonderlijke kegelvormige centrifugebuizen met behulp van een serologische pipet.
- Pipette differentiëren factoren aan de CCM met PBM's en meng goed door pipetting op en neer. Differentiërende factoren worden als volgt toegepast:
- Voor MDDC's: definitieve concentratie van 10 ng/mL interleukine-4 (IL-4) en 10 ng/mL granulocyte-macrophage kolonie-stimulerende factor (GM-CSF).
- Voor MDM's: definitieve concentratie van 10 ng/mL macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF).
- Pipette de cel suspensies in CCM met de toegevoegde differentiërende factoren in 6 putplaten door het verdelen van 3 mL van de suspensie per put (komt overeen met 3 x 106 cellen / goed, dat wil zeggen, 1 x 106 cellen / mL).
- Plaats de 6 putplaten in een celkweek incubator (37 °C, 5% CO2)en laat ze 6 dagen differentiëren zonder de CCM te verversen.
OPMERKING: Differentiatie varieert van 5-8 dagen, afhankelijk van de lokale beschikbaarheid van buffy jassen en experimentele setup, op voorwaarde dat de differentiatie efficiëntie wordt bepaald met behulp van de juiste technieken (verwijzen naar de discussie sectie).
- PBM bevriezing
- Resuspend de celpellet in een cryoprotectief medium (hier FBS en dimethylsulfoxide [DMSO; cytotoxisch]) bij een verhouding van 9:1 (v/v) door een volume voorverwarmde FBS te pipetten. Dit komt overeen met een uiteindelijke celconcentratie van 6 x 106 cellen/mL, rekening houdend met een verdere toevoeging van 10% DMSO (v/v).
- Markeer het gewenste aantal cryovials in de laminaire stroomkap (d.w.z. de datum, isolatiecode en het aantal cellen registreren).
- Pipette 0,9 mL celsuspensie in zuivere FBS (hier, 6 x 106 cellen in 0,9 mL FBS) voor elke cryovial. Vervolgens, langzaam pipette 0.1 mL van DMSO en meng de ophanging goed door het draaien van de cryovials op en neer 3x.
- Breng de cryovials over op een celvriezencontainer en zet deze onmiddellijk op -80 °C voor 24 uur.
- Na 24 uur, verwijder de cryovials uit de -80 °C vriezer en container en plaats ze in de vloeibare stikstof tank geschikt voor celopslag.
- PBM ontdooien en differentiatie in MDMs en MDDC's
- Verwarm alle benodigde reagentia tot 37 °C in een waterbad (~20-30 min).
- Bereid het juiste aantal van 6 putplaten voor die overeenkomen met het aantal ontdooide cellen (hier één plaat per 1,8 x 107 cellen, d.w.z. 3 cryovials). Pipette 2 mL CCM aan elke put onder aseptische omstandigheden. Plaats platen in de couveuse (5 % CO2, 37 °C) gedurende 15 minuten om de pH in evenwicht te brengen.
- Neem de vereiste hoeveelheid cryovials met bevroren cellen uit een vloeibare stikstoftank en draai ze voorzichtig in een waterbad van 37 °C (1-2 min) om een uniforme ontdooiing van de celsuspensie te garanderen.
- Verwijder het cryoviale uit het waterbad en ontsmet met een steriliserend middel, zodat het middel niet interageert met het deksel en de O-ring.
LET OP: Hierbij moeten alle stappen onder aseptische omstandigheden worden voltooid. - Bereid het juiste aantal van 15 mL conische centrifugebuizen voor die overeenkomen met het aantal te ontdooien cryovials (hier, 6 x 106 cellen/buis). Pipette 9 mL van voorverwarmde CCM in elke buis.
- Pipette langzaam (drop-by-drop) de inhoud van de cryovial in een buis met CCM. Sluit het deksel, herhaal voor elke buis, en centrifuge op 200 x g gedurende 5 min bij een regelmatige centrifuge snelheid.
- Gooi de supernatant weg zonder de pellet te storen.
- Resuspend de pellet van elke buis (die cellen bevat uit een cryoviale) in 2 mL van voorverwarmde CCM door pipet op en neer met behulp van een serologische pipet (celdichtheid die overeenkomt met 3 x 106 cellen / mL).
- Van elke buis, pipet de geresuspended cellen in twee putten (1 mL per put) van een 6 put plaat met 2 mL van eerder voorbereid CCM om een celdichtheid van 3 x 106 cellen / goed te bereiken (wat overeenkomt met een uiteindelijke concentratie van 1 x 106 cellen / mL). Herhaal dit voor alle andere buizen.
- Ga verder met differentiatie zoals beschreven in punt 1.5.3.
- Plaats de 6 putplaten in een celkweek incubator (37 °C, 5% CO2)en laat ze 6 dagen differentiëren zonder de CCM te verversen.
2. Triple cell cocultuur model van menselijke alveolaire epitheelweefsel
OPMERKING: In deze sectie vindt u instructies over volumes en celnummers die overeenkomen met 12putplaatjes. Figuur 1 geeft een overzicht van een voorgestelde tijdlijn voor modelassemblage.
- Epitheelcel (A549-cellijn) zaaien
- Kweek de epitheelcellen volgens de aanbevelingen van de leverancier (ATTC). Kortom, subcultuur de cellen in CCM op 80% cel samenvloeiing (ongeveer, 2x-3x per week).
OPMERKING: Subcultuur A549 voor ten minste vier passages vóór de samenstelling van het cocultuurmodel, met A549-cellen in een doorgangsbereik van 5-25. - Pipette 1.5 mL van voorverwarmde CCM in 12 putplaten (het aantal putten komt overeen met het gewenste aantal modellen).
- Plaats individuele 12 goed celcultuur inserts in putten van een 12 goed plaat met behulp van gesteriliseerde pincet.
- Maak de cellen los van een kolf volgens het subteeltprotocol (d.w.z. verwijder het middel met behulp van een loskoppelmiddel door centrifugatie zoals gedaan in stap 1.2.13). Resuspend in het juiste volume CCM dat overeenkomt met de uiteindelijke celconcentratie van A549 (hier, 50 x10 4 cellen/mL; 0,5 mL celsuspensie per wisselplaat, d.w.z. 25 x 104 cellen/insert, wat overeenkomt met de zaaidichtheid van 27,8 x 104 cellen/cm2).
- Pipette 0,5 mL van de celsuspensie (d.w.z. 25 x 104 cellen/insert) in de apicale kant van de wisselplaat met behulp van een pipet van 1 mL.
- Bedek de platen met deksels en leg ze gedurende 4 dagen in een celkweek incubator (37 °C, 5 % CO2).
OPMERKING: Controleer regelmatig de samenvloeiing van A549-cellen onder een fasecontrastmicroscoop.
- Kweek de epitheelcellen volgens de aanbevelingen van de leverancier (ATTC). Kortom, subcultuur de cellen in CCM op 80% cel samenvloeiing (ongeveer, 2x-3x per week).
- MDDC zaaien
- Aspirate CCM met niet-gekoppelde cellen in de 6 putplaten met MDDC's.
- Voeg 1 mL verse voorverwarmde CCM toe aan elke put.
- Gebruik een celschraper, los (schraap) aanhanger MDDC's van elke put, voorzichtig wassen de putten met de bestaande 1 mL van CCM 3x, en combineer ze in een conical centrifuge buis.
- Tel de cellen met een celteller met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode met behulp van 10 μL celsuspensie en 10 μL trypanblauwe oplossing.
- Centrifuge de cel suspensie zoals gedaan in stap 1.2.13.
- Bereken het CCM-volume dat nodig is voor resuspensie (vergelijking 5):
Vereiste MDDC-dichtheid = 42 x 104 cellen/mL; voor elke wisselplaat zijn 6,3 x 104 cellen nodig, wat overeenkomt met een ingezaaide celdichtheid van 7 x 104 cel/cm2 (hier 150 μL toegevoegd aan 0,9 cm2 in stap 2.2.10.).
CCM-volume voor celhersuspensie (Vm; Vergelijking 5):
- Voorzichtig aanzuigen en gooi de CCM uit de bovenste kamer van 12 putplaten met groeiende A549 op de inzetstukken.
- Plaats de inzetstukken met A549 cellen in een ondersteboven positie in een steriele petrischaal met behulp van gesteriliseerde pincet. Bereid een kegelvormige centrifugebuis (50 mL) met PBS en bevochtig een celschraper.
- Schraap A549-cellen van het basale oppervlak van de wisselplaat (d.w.z. het bovenste deel op de omgekeerde positie), die door de poriën van de wisselplaten moet groeien.
LET OP: Spoel de schraper met PBS (bereid in een buis) tussen het schrapen van individuele monsters en houd het nat gedurende de hele procedure. - Bij centrifugatie (stap 2.2.5) de supernatant aanzuigen en weggooien, dan de MDDC-pellet opnieuw in de berekende hoeveelheid CCM (stap 2.2.6) en pipet op en neer 3x.
- Pipette 150 μL van de celsuspensie bovenop elke wisselplaat, zodat het gehele basale oppervlak van de wisselplaat gelijkmatig bedekt is met de vloeistof en geen bellen bevat.
- Bedek de schotel met een deksel en plaats in een cel cultuur incubator voor 70 min. Aspirate de CCM uit de celkweekplaten (waar de inzetstukken in eerste instantie zijn geplaatst), gooi het in een biohazard vloeibaar afval, en pipet 1,5 mL verse CCM in elke put. Bedek de plaat met een deksel en plaats in de celincubator (37 °C, 5% CO2).
LET OP: Niet langer dan de hierboven genoemde periode om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. - Na de incubatie, zorgvuldig te houden elke insert met gesteriliseerde pincet en leg ze op de platen met CCM in een gewone positie. Bedek de plaat met een deksel en breng deze terug naar de celincubator (37°C, 5% CO2).
- Macrofaag (MDM) zaaien
- Neem 6 goed platen met voorgedifferentieerde MDMs. Plaats ze van de cel incubator naar een laminaire flow hood.
- Aspirate en gooi CCM met niet-verbonden MDMs geteeld in 6 goed platen, en pipet 1 mL van verse voorverwarmde CCM in elke put.
- Verwijder met behulp van een celschraper aanhangende MDM's voorzichtig uit afzonderlijke putten (zoals gedaan in stap 2.2.3 voor de MDDC's).
- Pipette 10 μL trypanblauw in een put of buis en voeg 10 μL van de MDM-ophanging toe om de uiteindelijke verdunning van 1:1 (v/v) te bereiken. Tel het aantal MDM's met het juiste telprotocol.
- Centrifuge de cel suspensie zoals gedaan in stap 1.2.13.
- Bereken het vereiste volume (vergelijking 6):
Vereiste MDM-dichtheid = 2,5 x 104 cellen/mL in CCM (hier vereist elke wisselplaat 1,25 x 104 cellen in CCM van 0,5 mL, wat overeenkomt met een ingezaaide celdichtheid van 1,4 x 104 cel/cm2).
(6) - Bij centrifugatie, aspiraat en gooi de supernatant, redisperse de MDM pellet in de berekende hoeveelheid CCM (stap 2.3.6), en pipet op en neer 3x.
- Voorzichtig pipette 0,5 mL van de MDM suspensie (bereid in stap 2.3.7) op de wand van de celcultuur wisselplaten met A549 en MDDC's (niet direct op epitheelcellen) met behulp van een 1 mL pipet. Dek platen af met deksels en plaats in een couveuse van de celkweek (37 °C, 5 % CO2) voor 24 uur.
- Overdracht van cocultuurmodel naar lucht-vloeibare interface (ALI)
- Aan het einde van de incubatietijd van 24 uur (±2 uur) van het geassembleerde model in een celkweek incubator, besmetting en gooi CCM uit zowel apicale als basale delen van celkweekinserts en uit de putten.
- Til met gesteriliseerde pincetten individuele inzetstukken uit de putten en pipet 0,6 mL verse voorverwarmde CCM naar elke put met behulp van een pipet van 1 mL. Voeg CCM niet toe aan de apicale kant van de wisselplaat.
- Dek platen af met deksels en plaats in een couveuse van de celkweek (37 °C, 5 % CO2) voor 24 uur voorafgaand verder gebruik.
(6)3. Blootstelling aan geselecteerde positieve controles (bekende stimuli voor het induceren van pro-inflammatoire respons)
OPMERKING: Blootstelling van de cocultuurmodellen aan een bekende pro-inflammatorische stimulus endotoxine lipopolysaccharide (LPS)7 en proinflammatorische cytokine tumor necrose factor α (TNF-α)7 wordt gebruikt om de reactiesnelheid van het model te illustreren. Bovendien wordt blootstelling aan een wasmiddel (Triton X-100) gebruikt om de gevoeligheid van een lactaatdehydrogenase (LDH) te bevestigen.
- Bereid de positieve controleoplossingen voor: LPS-voorraad (1 mg/mL in gedestilleerd water), TNF-α-voorraad (100 μg/mL in gedestilleerd water) en Triton-X 100 (2% [v/v] in PBS).
- Na 24 uur incubatie van de cocultuur model bij ALI voorwaarden, aspirate en gooi de supernatant uit het basale compartiment. Met behulp van gesteriliseerde pincet, til individuele inzetstukken uit de putten en pipet 0,6 mL van verse voorverwarmde CCM in elke put.
- Bereid individuele positieve controles werken oplossingen door verdunnen van de voorraden in CCM in conische centrifuge buizen als volgt: 1 μg/mL LPS, 1 μg/mL TNF-α, en 0,2% Triton-X 100. De volumes komen overeen met het aantal geteste wisselplaten (hier, 100 μL/insert). Meng de oplossingen goed door 3x op en neer te pipetten.
- Breng 100 μL van elke positieve regeloplossing aan door langzaam op de wand van de celcultuurwisselplaat te pipetten. Bedek de putplaat met een deksel en plaats in de celkweek incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 24 uur. Bij incubatie de vloeistof aan de apicale kant van de wisselplaat aanzuigen en weggooien door afzonderlijke wisselplaten met een pincet vast te houden.
- Verzamel CCM in de basale compartimenten en bewaar bij 1) 4 °C voor verdere LDH-analyse, waarbij celmembraanbreuk-gemedieerde cytotoxiciteit en/of 2) worden aangegeven bij -80 °C voor verdere analyse van eiwitvrijgave via enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA). Voer de tests volgens de kit leverancier aanbevelingen.
- Bij het verwijderen van CCM, was de inzetstukken met PBS 3x en bevestig de cellen op celcultuur inserts in 4% [w / v] paraformaldehyde (in PBS, 15 min bij kamertemperatuur) door ervoor te zorgen beide insert kanten zijn goed bedekt met PFA oplossing. Vervolgens wassen 3x met PBS om PFA te verwijderen. Bewaar de monsters ondergedompeld in PBS op 4 °C voor verdere immunostaining (een voorbeeld van deze methode is eerder beschreven17).
Representative Results
Menselijke longcocultuur modellen, samengesteld uit alveolaire epitheelcellen en immuuncellen, werden samengesteld uit verse of bevroren MDDC's en MDMs voorlopers (hier, menselijke perifere bloed-afgeleide monocyten). Zoals voorgesteld in figuur 1, werden A549 cellen 3 dagen na het eerste deel met monocytenisolatie/ontdooien gezaaid. Na 6 dagen van differentiatie verschenen de gedifferentieerde MDM's rondevormig, terwijl MDDC's een meer langwerpige vorm vorm vorm vormden met waarneembare uitsteeksels. Ze verschenen ook als agglomeraten, vooral wanneer ze werden onderscheiden van verse monocyten (figuur 2, figuur 3). Epitheelcellen vormden een dichte cellaag van cellen na 3 dagen groei op membraaninsert(figuur 4), toen de coculturen werden geassembleerd. Na 24 uur van de montage en een extra 24 uur van wordt onderworpen aan ALI voorwaarden, de coculturen werden voorbereid op blootstellingen.
Responsiviteit van de 3D-celkweekmodellen werd onderzocht bij blootstelling aan bekende proinflammatorische stimuli met behulp van een pseudo-ALI-benadering, zoals eerder beschreven29. De proinflammatorische stimuli, LPS en TNF-α, werden in lage volumes (100 μL) toegevoegd aan het apicale oppervlak van het luchtbelichte celmodel. Tegelijkertijd werd de afwezigheid van membraanbreuk als maatstaf voor cytotoxiciteit beoordeeld via LDH-test. Een aanzienlijke toename van de LDH-afgifte in CCM van het basale compartiment werd waargenomen bij blootstelling aan de positieve controle voor membraanbreuk, een wasmiddel Triton-X 100 (figuur 5). Deze resultaten bleken responsiviteit van het model op een cytotoxische stof, terwijl er geen toename van LDH-afgifte werd waargenomen bij apicale stimulatie met TNF-α of LPS.
Een mogelijke reden voor de verschillende gemeten waarden van LDH in de monsters die met verse of eerder bevroren PBM's zijn samengesteld, kan aan de monsteropslag worden toegeschreven. Monsters van verse PBM's werden langer opgeslagen bij -80 °C; daarom kan de activiteit van LDH-enzym dalen. Met name is LDH slechts 4 dagen stabiel in CCM; daarom wordt aanbevolen om de test uit te voeren de laatste 2 dagen na het verzamelen van de supernatants. Als alternatief is het mogelijk om de supernatants direct na het verzamelen te bevriezen. Het is echter belangrijk om te overwegen dat bevriezing de enzymatische activiteit van LDH kan verminderen.
De afscheiding van proinflammatorische bemiddelaars (hier, TNF-α en interleukins 6 [IL-6] en 8 [IL-8]) in de basale CCM werd gekwantificeerd via ELISA. Statistisch significante (p < 0,05, one-way ANOVA) stijgingen in de release van IL-6 en IL-8 werden waargenomen in zowel LPS- en TNF-α- behandelde monsters in vergelijking met de respectieve onbehandelde cellen, evenals in de celcultuur modellen samengesteld uit beide PBMs bron (figuur 6). Hoewel de concentraties (pg/mL) van alle geteste cytokinen in het basale CCM hoger waren in de coculturen die uit verse PBM's bestonden, waren de verschillen tussen de twee coculturen en monoculturen niet statistisch significant (p > 0,05) (figuur 6). Om de toegevoegde waarde van cocultuurmodellen met betrekking tot een 2D-epitheelcelcultuur te bevestigen, werden a549 monoculturen ook blootgesteld aan LPS of TNF-α. Zoals verwacht was de introductie van alle onderzochte bemiddelaars uit A549 monoculturen lager in vergelijking met beide coculture modellen; hoewel, het verschil tussen hen was niet statistisch significant (p > 0,05, one-way ANOVA).
Cellulaire morfologie van de 3D-epitheliale weefselbarrière van de mens werd beoordeeld via confocale laserscanny (LSM). Om de samenstelling van elk model te visualiseren, werden macrofagen binnen de cocultuurmodellen (MDM's) bevlekt met volwassen macrofaagmarkering 25F9. MDDC's werden gekleurd met CD83, wat een belangrijke marker is voor geactiveerde dendritische cellen30. Wat de cellulaire morfologie betreft, werd geen verschil waargenomen tussen de cocultuurmodellen die MDM's en MDDC's van verse PBM's gebruiken in vergelijking met die met ontdooide PBM's. In lps- en TNF-α-blootgestelde coculturen, beide samengesteld uit verse en bevroren immuuncellen, werd een verstoorde epitheliale laag in LSM-beelden waargenomen, wat niet het geval was in onbehandelde cellen(figuur 7, figuur 8).
Figuur 1: Schematische tijdlijn van het protocol. Presentatie van het 3D cocultuurmodel preparatuur, montage en toepassing (blootstelling aan een geteste stof). ALI = lucht-vloeibare interface, MDDC's = monocyten-afgeleide dendritische cellen, MDM's = monocyten-afgeleide macrofagen, PBM's = perifere bloedmonocyten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: MDM's en MDDC's onderscheiden zich van verse PBM's. Fasecontrastmicroscopiebeeld van gedifferentieerde (A) MDMs en (B)MDDC's uit verse PBM's (6 dagen na celisolatie). MDM's zijn ronde vormig, terwijl MDDC's vaak worden waargenomen als agglomeraten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: MDM's en MDDC's onderscheiden zich van bevroren PBM's. Fasecontrastmicroscopiebeeld van gedifferentieerde (A) MDMs en (B) MDDC's uit ontdooide PBM's (6 dagen na ontdooiing). MDMs zijn rondvormig, maar sommige langwerpige cellen kunnen worden waargenomen. MDC's verschijnen ook ronde vormig met uitsteeksels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Epitheelcellen groei op membraan inserts. Fase-contrast microscopie beeld van confluent A549 groeien op een membraan insert 4 dagen na het zaaien, de vorming van een dichte laag cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Cytotoxiciteitsresultaten onderzocht via membraanbreukgebaseerde (LDH) test. De gegevens worden gepresenteerd als een vouwtoename ten opzichte van onbehandelde cellen (gemiddelde ± SD, n = 3, sterretje duidt statistisch significante toename ten opzichte van onbehandelde cellen, **p < 0,01, ****p < 0,0001). In groene modellen zijn MDM's en MDDC's van verse PBM's vertegenwoordigd en in paarse modellen die zijn samengesteld uit ontdooide PBM's worden vertegenwoordigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Proinflammatorische reacties in de coculturen en monoculturen. De proinflammatoroire bemiddelaars (TNF-α, IL-6 en IL-8) brengen in de cocultures uit na een 24-uurs uitdaging met LPS of TNF-α. De gegevens worden gepresenteerd ten opzichte van onbehandelde cellen (gemiddelde ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). In groene modellen zijn MDM's en MDDC's van verse PBM's vertegenwoordigd en in paarse modellen die zijn samengesteld uit ontdooide PBM's worden vertegenwoordigd. Grijs vertegenwoordigt A549 monoculturen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Morfologie van coculturen bestaande uit verse immuuncellen. LSM-afbeeldingen van apicale en basale zijden van het cocultuurmodel met xz-projecties van apicale zijden van het model met behulp van MDMs en MDDC's van verse PBM's. Cyan vertegenwoordigt nuclei (DAPI), magenta vertegenwoordigt cytoskelet (rhodamine-phalloidin), wit vertegenwoordigt MDMs (25F9), en groen vertegenwoordigt MDDC's (CD 83). De witte pijl geeft MDM aan, terwijl de groene pijl MDDC aangeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Morfologie van coculturen bestaande uit bevroren immuuncellen. LSM-afbeeldingen van de apicale kant van het cocultuurmodel met overeenkomstige xz-projecties, en basale zijde van het model met MDMs en MDDCs van ontdooide PBM's. Cyan vertegenwoordigt kernen (DAPI), magenta vertegenwoordigt cytoskelet (rhodamine-phalloidin), wit vertegenwoordigt MDMs (25F9), en groen vertegenwoordigt MDDC's (CD 83). De witte pijl geeft MDM aan, terwijl de groene pijl MDDC aangeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De opkomende productie van nieuwe materialen, waaronder chemicaliën en geneesmiddelen, verhoogt geleidelijk de behoefte aan voorspellende in vitro modellen. Om te voldoen aan de drie principes van vervanging, vermindering en verfijning van dierproeven32, zijn in vitro celmodellen krachtige instrumenten geworden met betrekking tot het vervangings- en reductieaspect voor het ophelderen van mechanismen van de werking van een geneesmiddel of materiaal8,9,10,11. Hier gepresenteerd is een gedetailleerd protocol van het assembleren van de meercellige model met behulp van immuuncellen die ofwel vers geïsoleerd of ontdooid van eerder bevroren monocyten. Ook beschreven is de teelt van het model bij ALI. Ten slotte illustreert het protocol een voorbeeld van blootstelling aan pro-inflammatoire stimuli en vergelijkt het de respons van de twee modellen die verse of bevroren monocyten bevatten.
Er zijn verschillende studies uitgevoerd om de toegevoegde waarde van de verbeterde complexiteit van de onder ALI-omstandigheden geteelde en blootgestelde modellen te bevestigen en te rechtvaardigen in vergelijking met conventionele blootstelling onder water7,22,31. Observatie van de hogere proinflammatoire respons in coculturen in vergelijking met monoculturen van epitheliale cellen bevestigen een eerdere studie. De studie gebruikte het gepresenteerde cocultuurmodel (gestimuleerd met LPS) en toonde een hogere respons op genexpressieniveaus van TNF en IL1B in vergelijking met het A549 monocultuur equivalent model7. Aan de andere kant vertoonden beide modellen hogere variaties binnen de gemeten pro-inflammatorische afgiftewaarden in vergelijking met A549-monoculturen. Dit kan worden verklaard door het gebruik van immuuncellen van verschillende donoren (buffy coats) binnen biologische herhalingen (d.w.z. één herhaling, één donor), zoals eerder getoond7. Indien gewenst kunnen de variaties tussen de replica's worden overwonnen door 1) met behulp van ontdooide PBM's van dezelfde donor of 2) het bundelen van PBM's van verschillende donoren voorafgaand aan het bevriezen van de cellen, dan vervolgens het latere gebruik van dezelfde pool in elke herhaling. Het opnemen van meer biologische herhalingen wordt ook aanbevolen.
De celbevriezingstechniek kan als een kritieke stap worden beschouwd; het is echter een veel voorkomende laboratoriumprocedure voor het behoud van cellen voor fenotypische en functionele analyse. Verschillende studies hebben aangetoond dat de kwaliteit van bevroren PBM's van vitaal belang is voor hun overleving, en een passende vriestechniek is de sleutel tot het succes van latere tests met dezelfde cellen28,32. Wijziging van het protocol kan worden uitgevoerd door het bevriezen van PBM's, die flexibiliteit biedt in de experimentele setup, omdat de beschikbaarheid van buffy jassen meestal beperkt is. Een ander voordeel van het gebruik van bevroren PBM's (in verschillende flesjes) ten opzichte van vers geïsoleerde, is dat ze ook na 1 jaar in latere experimenten kunnen worden gebruikt. Dit vermindert het potentiële probleem van donor-tot-donor variabiliteit als dit een gewenste of vereiste parameter is in een experimenteel.
Resultaten van een interlaboratoriumvergelijking die na maximaal 13 maanden is uitgevoerd, tonen aan dat PBM's, wanneer ze op de juiste wijze worden opgeslagen in een vloeibare stikstoftank, gedurende een lange periode kunnen worden gebruikt zonder enig effect op de levensvatbaarheid van cellen of celterugwinning33. Langere opslagtijden (meer dan 1 jaar) kunnen mogelijk zijn na zorgvuldige validatie van de levensvatbaarheid van de cel en de reactiesnelheid van de cel voordat u een experiment uitvoert. Ook moet de temperatuur in de vloeibare stikstoftank te allen tijde stabiel blijven. De belangrijkste factor die van invloed was op de levensvatbaarheid van cryopreserved PBM's bleek de DMSO-concentratie te zijn, met een optimale concentratie van 10%-20 % (v/v)28. Om potentieel schadelijke effecten van bevriezing tot een minimum te beperken, worden vaak verschillende bronnen van eiwitten, FBS of BSA (met een breed concentratiebereik van 40% tot 100 %34)aan het vriesmedium toegevoegd als natuurlijke beschermende componenten die de celoverleving kunnen verhogen.
Vanwege het hoge cytotoxische potentieel van DMSO wordt het aanbevolen om eerst PBM's in FBS te verspreiden en vervolgens DMSO toe te voegen aan PBM's die al in FBS zijn verspreid. Met name hoewel hogere FBS-concentraties (>40%) geen verbetering van de levensvatbaarheid van de cel, op hetzelfde moment, ze hebben geen schade toebrengen aan de cellen28. Niettemin, bevriezing monocyten is een mogelijke aanpak voor het overwinnen van kwesties van beperkte buffy jas beschikbaarheid. Als echter het gebruik van MDDC's en MDM's uit verse PBM's gewenst is, kunnen de immuuncellen 5-8 dagen na isolatie5-8 dagenna isolatie7,16,17,35,,36,37worden gedifferentieerdengebruikt . Als experimentele planning dit toelaat, wordt ten minste 6 dagen differentiatie in zowel MDDC's als MDM's aanbevolen. Echter, consistentie tussen de verschillende herhalingen in hetzelfde experiment, samen met routine-inspecties van hun specifieke oppervlak marker uitdrukkingen, zijn van cruciaal belang. Het reactievermogen op een pro-inflammatorische stimulus, zoals LPS, na de differentiatietijd moet ook regelmatig worden gecontroleerd.
Veel onderzoeken met behulp van de A549 cellijn zijn uitgevoerd op ALI, hetzij als een monocultuur of in combinatie met andere celtypes (macrofagen, dendritische cellen, of fibroblasten) in 3D cocultuur model22,24,29,38. Met behulp van dit 3D-cocultuurmodel zijn de cytotoxiciteit, oxidatieve stress of pro-ontstekingseffecten van (nano)materialen onderzocht tot 72 uur 1,1717,21,24,29. De gelijkenis van het model met in vivo weefsel is eerder onderzocht op basis van confocale laserscanning van het model16. Bij het samenstellen van het model is het belangrijk om zowel celproliferatie (die A549 in het hier gepresenteerde model kan beïnvloeden) als de prestaties van de primaire (niet zich vermenigvuldigende) immuuncellen (hier, MDDC's en MDMs) te overwegen. Het is ook belangrijk om te bedenken dat niet alle cd14 positieve monocyten zich onderscheiden in MDDC's en MDM's, en dat de cellen aanwezig kunnen zijn in zowel bijgevoegde als zwevende vormen. Op basis van de aard van de cocultuurassemblage (hier moeten beide celtypen zich hechten aan de bestaande epitheellaag), wordt het aanbevolen om alleen de aanhangende subpopulaties van beide immuunceltypen te gebruiken. Bovendien hebben routinematige analyses van monocyten, MDDC en MDM monocultuur responsiviteit op LPS en expressie van specifieke oppervlaktemarkers (CD14, CD163, CD86, CD93 of CD206, niet getoonde gegevens) gesuggereerd dat 6 en 7 dagen differentiatie de optimale tijdpunten zijn.
Hoewel een realistisch aantal alveolaire epitheelcellen in menselijke longen overeenkomt met ~ 160.000 cellen/cm2,is het aantal A549-cellen dat in het model wordt geteld ~ 1.000.000 cellen/cm2 na 9 dagen gekweekt op de wisselplaat16,18. De beperkingen van dit in vitromodel moeten dus in overweging worden genomen. Ten eerste werd de dichtheid van epitheelcellen vastgesteld op basis van hun vermogen om een samenvloeiende laag op het groeiende membraan te vormen. Het is ook belangrijk om te vermelden dat de A549 een epitheliale type II-cel vertegenwoordigt met een kuboïdale vorm, in tegenstelling tot epitheliale type I-cellen, die plat en verspreid zijn. Anderzijds werd op basis van de literatuur het vereiste aantal immuuncellen vastgesteld en in dit protocol gepresenteerd als celnummer/oppervlakte39,40,41. De celdichtheid van MDCDC's in het bereik van 400 cellen/mm2 (4 cellen/cm2)16 is vergelijkbaar met de steady-state celdichtheid van 500-750 cellen/mm2 (5- 7 cellen/cm2) gerapporteerd uit in vivo studies39. De dichtheid van MDM's in dit model is binnen hetzelfde bereik van in vivo situatie in de menselijke alveolator regio40.
Volwassen macrofaagmarkering (25F9) werd waargenomen zowel in de apicale kant (waar MDM's aanwezig zijn) als basale zijde (d.w.z. op de plaats van dendritische cellen). Translocatie van immuuncellen via het membraan wisselt poriën is mogelijk en is ook waargenomen met behulp van dit model16, die de waargenomen verschillen in kleuringsintensiteiten kan verklaren. Een andere mogelijke verklaring is echter dat de volwassen macrofaagmarker ook kan worden uitgedrukt op dendritische cellen, maar de uitdrukking is zeer donorspecifiek42. Ook is de intensiteit van de 25F9-expressie veel hoger in MDM's(figuur 7, figuur 8). Beide pro-epitlamerende stimuli (LPS en TNF-α) beïnvloedden de integriteit van de longepitheelbarrière in beide coculturen (figuur 7, figuur 8). Dit werd verwacht op basis van eerdere publicaties43,44 waaruit blijkt dat proinflammatory cytokines en bacteriële producten verstoren de integriteit van epitheelbarrières.
Het 3D meercellig model van het humane alveolaire epitheel, opgericht en eerder gekenmerkt17, heeft gediend als een krachtig en nuttig instrument voor de beoordeling van biologische reacties (d.w.z. acute proinflammatorische reacties, oxidatieve stressrespons, deeltjesdistributie en cellulaire communicatie) in vitro21,24,25,45. De resultaten bevestigen de verantwoordelijkheid van cocultuurmodellen op pro-inflammatorische stimuli (hier, LPS en TNF-α). De respons werd iets verhoogd bij het gebruik van immuuncellen van verse PBM's; Er was echter geen statistisch significant verschil tussen coculturen die verse vs. ontdooide PBM's gebruikten. Bovendien waren de proinflammatoire reacties van beide cocultuurmodellen hoger dan die van epitheliale celmonoculturen die onder dezelfde (ALI)-omstandigheden werden gekweekt. Samengevat beschrijft het protocol de assemblage van een 3D-epitheelweefselcocultuurmodel met verse of ontdooide PBM's voor differentiatie in MDMs en MDDC's. Het is aangetoond dat beide modellen zeer responsief zijn op pro-inflammatoire stimuli; daarom kunnen ze dienen als krachtige instrumenten voor mogelijke risico- en toxiciteitsbeoordelingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Miguel Spuch-Calvar bedanken voor de cocultuurregeling in figuur 3 en dr. Bedia Begum Karakocak voor kritische lezing. Deze studie werd ondersteund door het PATROLS-project, het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. B.D. bedankt de stichting Peter und Traudl Engelhorn voor financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchmark microplate reader | does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland | ||
| Cell culture Incubator | does not have to be specific | ||
| Cell freezing container (for example Mr. Frosty) | does not have to be specific | ||
| Centrifuge | does not have to be specific | ||
| Confocal laser scanning microscope | does not have to be specific, for example | Zeiss LSM 710 meta | |
| Heamatocytometer, or automatic cell counter | does not have to be specific | ||
| Laminar bio-safety hood class II | does not have to be specific | ||
| MultiStand Macs (Macs Cell Separator) | Miltenyi, Germany | 130-042-303 | |
| pH meter | does not have to be specific | ||
| Phase contrast inverted light microscope | does not have to be specific | ||
| Pipette boy, pipettors (different volumes) | do not have to be specific | ||
| Scissors | do not have to be specific | ||
| Vacuum pump | does not have to be specific | ||
| Water bath | does not have to be specific | ||
| Disposable small equipment/glassware | Catalogue Number | ||
| 15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes | does not have to be specific | ||
| 6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile | Falcon, Switzerland | 353046 and 353043 | |
| Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size | Falcon, Switzerland | 353181 | |
| Cell scrapper | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 353085 | |
| Cryovials | do not have to be specific | ||
| Glass autoclaved Petri Dishes | do not have to be specific | ||
| LS Columns | Miltenyi, Germany | 130-042-401 | |
| Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 10040-446 | |
| Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) | does not have to be specific | ||
| Sterile pipettes | do not have to be specific | ||
| Chemicals | |||
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | A7030-100g | |
| CD14+ MicroBeads human - magnetic beads | Miltenyi, Germany | 130-097-052 | |
| Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red | Gibco, Switzerland | 25300054 | |
| Density gradient medium Lymphoprep | Alere Technologies AS, Norway | 1114547 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich, Switzerland | D2438 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | E6758-100g | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco, Switzerland | 10270-106 | |
| Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-093-864 | |
| Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-095-373 | |
| Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-096-485 | |
| L-glutamine | Gibco, Switzerland | 25030-024 | |
| Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli | Sigma-Aldrich, Switzerland | 4524-5mg | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | 158127 | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco, Switzerland | 15140-122 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Switzerland | 10010-015 | |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) | Gibco, Switzerland | 42401-018 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Switzerland | T8787 | |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma Aldrich, Switzerland | ||
| Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | Immunotools | 11343015 | |
| Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response | |||
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche, Switzerland | 11644793001 | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY206 | |
| Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY208 | |
| Immunostaining | |||
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL | Sigma-Aldrich, Switzerland | 10236276001 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL | Abcam, UK | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL | Agrisera, Sweden | AS09 633 | |
| Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL | eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland | 14-0115-82 | |
| Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM | Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland | R415 | |
| Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution | Abcam, UK | ab244204 |
References
- Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
- Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
- Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
- Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438 (2016).
- Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
- Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
- Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
- Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950 (2017).
- Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
- Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
- Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
- Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
- Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
- Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999 (2019).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
- Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
- Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
- Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
- Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
- Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
- Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67 (2016).
- Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
- Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
- Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12 (2013).
- Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
- Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176 (2009).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
- Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
- Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303 (2006).
- Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
- Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
- Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
- Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
- Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
- Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
- Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
- Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).
