Summary
قياس معدل ضربات القلب خلال التحدي الحراري يوفر نظرة ثاقبة في الاستجابات الفسيولوجية للكائنات الحية نتيجة للتغير البيئي الحاد. باستخدام جراد البحر الأمريكي(Homarus americanus)ككائن حي نموذجي ، يصف هذا البروتوكول استخدام الارتقان الرئوي كنهج غير باضع وغير قاتل نسبيًا لقياس معدل ضربات القلب في اللافقاريات المتأخرة.
Abstract
وتتزايد درجات الحرارة في المحيطات بسرعة نتيجة للتغيرات الواسعة النطاق في المناخات العالمية. وبما أن فسيولوجيا الكائنات الحية تتأثر بشدة بدرجة الحرارة البيئية، فإن هذا ينطوي على إمكانية تغيير الأداء الفسيولوجي الحراري في مجموعة متنوعة من الكائنات البحرية. باستخدام جراد البحر الأمريكي(Homarus americanus)ككائن حي نموذجي ، يصف هذا البروتوكول استخدام الارتقان الرئوي لفهم كيفية تغير أداء القلب في مرحلة متأخرة من الفيفقاريات تحت الضغط الحراري الحاد. يقدم البروتوكول تقنية طفيفة التوغل تسمح بجمع معدل ضربات القلب في الوقت الحقيقي أثناء تجربة زيادة درجة الحرارة. يتم التلاعب بسهولة البيانات لتوليد مؤامرة Arrhenius التي تستخدم لحساب درجة حرارة كسر Arrhenius (ABT) ، ودرجة الحرارة التي يبدأ معدل ضربات القلب في الانخفاض مع ارتفاع درجات الحرارة. يمكن استخدام هذه التقنية في مجموعة متنوعة من اللافقاريات في مرحلة متأخرة (أي سرطان البحر أو بلح البحر أو الروبيان). على الرغم من أن البروتوكول يركز فقط على تأثير درجة الحرارة على أداء القلب ، إلا أنه يمكن تعديله لفهم إمكانية حدوث إجهادات إضافية (مثل نقص الأكسجة أو فرط الكبة) للتفاعل مع درجة الحرارة للتأثير على الأداء الفسيولوجي. وبالتالي، فإن هذه الطريقة تنطوي على إمكانية تطبيقات واسعة النطاق لزيادة فهم كيفية استجابة اللافقاريات البحرية للتغيرات الحادة في البيئة.
Introduction
في العقود الأخيرة، أدت زيادة مدخلات غازات الاحتباس الحراري (أي ثاني أكسيد الكربون والميثان وأكسيد النيتروز) في الغلاف الجوي إلى أنماط واسعة النطاق من التغير البيئي1. محيطات العالم ترتفع بسرعة2,3, وهو الاتجاه الذي قد يكون له آثار شديدة على فسيولوجيا الكائنات الحية. درجة الحرارة يؤثر بشدة على معدلات الفسيولوجية، والكائنات الحية لديها نطاق درجة الحرارة الأمثل للأداء4،,5،,6. على هذا النحو، قد يواجه الأفراد صعوبات في الحفاظ على توصيل الأكسجين السليم إلى الأنسجة حيث تضل درجات الحرارة خارج هذا النطاق. وهذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في الأداء الهوائي في مواجهة ارتفاع درجات حرارة المحيطات5,7.
في بيئة المختبر ، فإن طريقة لفهم الآثار الفسيولوجية للتغيير البيئي هي فحص أداء القلب في سياق الإجهاد الحراري. وهذا يوفر نظرة ثاقبة كيف التعرض لظروف الاحترار المتوقعة قد يغير منحنيات الأداء5,6 فضلا عن إمكانية التأقلم اللدونة8. وقد تم تنفيذ مجموعة متنوعة من الأساليب بنجاح لقياس معدل ضربات القلب في اللافقاريات البحرية في السابق. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التقنيات تنطوي على إزالة جراحية أو التلاعب الرئيسي في الهيكل الخارجي وزرع طويل الأمد لأجهزة القياس9،10،11، مما يدخل إجهادًا إضافيًا لموضوع الاختبار ويزيد من الوقت اللازم للتعافي الناجح قبل التجريب. وعلاوة على ذلك، قد تقتصر التقنيات الأقل توغلا (مثل الملاحظة البصرية، وتصوير الفيديو) على مراحل تاريخ الحياة المبكرة عندما تكون الكائنات الحية كاملة أو شبه شفافة12. وعلاوة على ذلك، يمكن تقديم تحديات إضافية للباحثين الذين ليسوا على دراية جيدة في منهجيات أكثر تقدما من الناحية التكنولوجية (على سبيل المثال، الملاحظات عبر محولات الأشعة تحت الحمراء أو التروية دوبلر8،11).
يستخدم هذا البروتوكول جراد البحر الأمريكي(Homarus americanus)كنموذج اللافقاريات البحرية في مرحلة متأخرة لإثبات استخدام الارتقان الرئوي للمقاومة لتقييم التغيرات في معدل ضربات القلب خلال تجربة زيادة درجة الحرارة. الارتقاق الرئوي ينطوي على تمرير تيار كهربائي متذبذب (AC) عبر اثنين من أقطاب الكهربائية المتمركزة على جانبي التامور لقياس التغيرات في الجهد كما عقود القلب ويرتاح13,14. هذه التقنية هي طفيفة التوغل، كما أنها تستخدم استخدام الأقطاب الكهربائية الصغيرة (أي قطر 0.10-0.12 ملم) التي يتم زرعها بلطف تحت الهيكل الخارجي مباشرة. وأخيرا، فإنه يوفر تقييمات في الوقت الحقيقي لكل من معدل ضربات القلب ودرجة حرارة المياه خلال المنحدر من خلال استخدام مسجل البيانات.
كما يوفر البروتوكول تعليمات لحساب درجة حرارة كسر Arrhenius (ABT) ، ودرجة الحرارة التي يبدأ فيها معدل ضربات القلب في الانخفاض مع ارتفاع درجات الحرارة13،15. ABT بمثابة مؤشر غير فتاك من الحد الحراري للقدرة في مواضيع الاختبار التي يمكن تفضيلها على قياس الحد الأقصى الحراري الحرج (CTماكس، الحد الأعلى لوظيفة القلب5،6)،كما الحدود القاتلة غالبا ما تكون متطرفة ونادرا ما تواجهها في البيئة الطبيعية5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المعدات
- التفاف أنابيب واضحة ومرنة حول نفسها لإنشاء لفائف تبادل الحرارة التي هي تقريبا 8-10 سم في القطر ولها ملحقات 40-70 سم طويلة. تأمين لفائف باستخدام الشريط الكهربائي.
- إرفاق لفائف تبادل الحرارة إلى العرض الخارجي وتجهيزات العودة من حمام المياه التبريد / التدفئة المتداولة. تأكد من أن الاتصال آمن باستخدام المشابك الخرطومية.
- ملء بئر التبريد / التدفئة تعميم حمام المياه مع التناضح العكسي (RO) المياه وتوصيل سلك الطاقة في منفذ. تشغيل حمام الماء وتأكد من عدم وجود تسرب في اتصاله بلفائف تبادل الحرارة.
- قم بإعداد محول المعاوقة عن طريق توصيل كبل BNC الأسود بإخراج التيار المتردد على الوحدة وتوصيله بمسجل البيانات(جدول المواد)باستخدام منفذ القناة 1.
- قم بتوصيل مسبار الرتماج الحراري (مسجل درجة الحرارة) بجراب T-type، ثم قم بتوصيل جراب T-type بمنفذ القناة 2 الخاص بمسجل البيانات.
- قم بتوصيل سلك الطاقة الخاص بمسجل البيانات بمصدر طاقة وقم بتوصيل مسجل البيانات بكمبيوتر كمبيوتر باستخدام موصل كابل USB.
- ملء غرفة التأقلم والساحة التجريبية مع 7.5 لتر من مياه البحر الاصطناعية (الملوحة = 35 ppt، درجة الحموضة = 8.1، درجة الحرارة = ~ 12 درجة مئوية).
ملاحظة: يعتمد حجم ودرجة الحرارة وكيمياء المياه اللازمة لغرفة التأقلم وظروف البدء في الساحة التجريبية على التصميم التجريبي. الأهم من ذلك، يجب أن تكون هذه الحاويات كبيرة بما يكفي لغمر بشكل مريح موضوع الاختبار.
2. زرع الأقطاب الكهربائية
- وضع جراد البحر على صر البلاستيك الذي يناسب بسهولة في الساحة التجريبية بحيث يجعل الجسم بشكل مريح حرف Y الشكل في نهاية واحدة من المستطيل.
- تأمين بعناية مخالب جراد البحر والبطن إلى صر البلاستيك باستخدام ربطات الكابل الصغيرة. يجب أن تكون روابط الكابل ضيقة بما يكفي لمنع الحركة ولكن ها تسمح بمساحة للمقص الجراحي لإزالتها عند الانتهاء من التجربة.
- تجفف الكارابيس بمنشفة ورقية ونظّفها بكرة قطنية غارقة في الإيثانول بنسبة 70%.
- إنشاء ثقوب للأقطاب الكهربائية.
- باستخدام بت حفر صغير (على سبيل المثال، 1.6 مم)، ببطء وبعناية حفر يدوي اثنين من الثقوب الصغيرة (تقريبا) من خلال carapace على جانبي التامورة.
- الانتهاء من كل حفرة عن طريق إدراج بلطف إبرة تشريح معقمة.
- إذا كانت الإبرة لا تذهب بسهولة من خلال carapace، والاستمرار في الحفر باليد ببطء قبل محاولة الإبرة مرة أخرى.
ملاحظة: لتقليل الإجهاد في الحيوانات التجريبية، ينصح بشدة ممارسة هذه التقنية قبل التجريب. مع مرور الوقت، يمكن للمستخدمين بسهولة تحديد عن طريق الشعور عندما بت الحفر هو تقريبا على الرغم من كارابيس والتحول إلى الإبرة. الحفر اليدوي مناسب لجراد البحر وسرطان البحر ، خاصة إذا كان الهيكل الخارجي ناعمًا (أي أن الحيوان قد انصهر مؤخرًا). ومع ذلك، إذا كان موضوع الاختبار يحتوي على هيكل خارجي أكثر سمكًا أو قذيفة (أي ثنائي الصمام)، فإن أداة Dremel أكثر ملاءمة.
- الحصول على الأقطاب الكهربائية (36-38 G الأسلاك المغناطيسية، 0.10-0.12 مم القطر) وكشط قبالة قليلا صغيرة من العزل في طرف السلك باستخدام شفرة سكين تشريح. بعناية ثني غيض من كل سلك في خطاف صغير باستخدام ملقط وإدراج واحد في كل من الثقوب حفرت حديثا.
- تأمين كل الرصاص الأسلاك باستخدام قطرة صغيرة من الغراء سيانواكريلات والسماح لها لتجف لمدة 5-10 دقيقة.
ملاحظة: من الضروري استخدام الغراء لماماً، حيث أن إضافة الكثير سوف يعيد عزل السلك ويمنع تسجيل الإشارة. - بمجرد جفاف الغراء ، يؤدي إرفاق السلك إلى محول المعاوقة وتشغيله. ضع جراد البحر في غرفة التأقلم واسمح له بالتكيف مع الأقطاب الكهربائية المزروعة لمدة 15-20 دقيقة.
ملاحظة: الحركات السريعة أو التنافر، فضلا عن الغراء المجفف ة بشكل غير كامل، قد يسبب الأقطاب الكهربائية لتصبح منفصلة عن كارابيس. إذا حدث ذلك، العودة إلى الخطوة 2.6. - قم بتشغيل مسجل البيانات وافتح برنامج LabChart على الكمبيوتر. انقر فوق تجربة جديدة واترك شاشة عرض المخطط مفتوحة.
- في عرض المخطط، حدد موقع قائمة وظيفة القناة للقناة 1 من القسم الأيمن من الشاشة. اختيار مكبر للصوت الإدخال من القائمة وحدد AC اقتران. ستظهر الإشارة الواردة من موضوع الاختبار الآن على الشاشة في الوقت الفعلي.
ملاحظة: يمكن ضبط حساسية القناة عن طريق تحديد القائمة المنبثقة النطاق. ضبط النطاق حتى تبلغ قمم الإشارة 25% إلى 75% من النطاق الكامل. إغلاق مكبر الصوت الإدخال بالنقر فوق موافق. - على تحويل المعاوقة، قم بضبط الكسب (الحجم) والتوازن حتى يتم ملاحظة إشارة قوية على إخراج مسجل البيانات، بهدف الحفاظ على الرصيد بالقرب من الصفر.
- على القناة 2، حدد T-Type pod لتسجيل بيانات درجة الحرارة في الوقت الفعلي.
- عند إعداد كلتا القناتين بشكل صحيح، انقر فوق الزر "ابدأ"، وسيبدأ مسجل البيانات في تسجيل البيانات.
3. درجة الحرارة المنحدرة
- بعد فترة التأقلم، ضع صر البلاستيك مع جراد البحر المرفق بعناية في الساحة التجريبية وتعيين لفائف تبادل الحرارة على رأس صر.
- ضع مسبار الترمس بالقرب من جراد البحر ، وضمان غمره بالكامل قبل وضع الغطاء على الساحة التجريبية لتقليل الإجهاد البصري لموضوع الاختبار.
- ضبط التوازن حسب الحاجة ووضع تعليق على الناتج تفيد بأن المحاكمة قد بدأت.
- يمكن ويجب حفظ الإخراج بشكل دوري طوال التجربة.
- انقر فوق ملف وحدد حفظ كما لحفظ الإخراج في البداية إلى الكمبيوتر.
- عند الحفظ أثناء التجربة، انقر فوق ملف وحدد حفظ.
ملاحظة: على الرغم من أن برنامج LabChart يمكن استرداد الملفات في حالة إيقاف تشغيل برنامج عرضي (على سبيل المثال، انقطاع التيار الكهربائي)، فمن المستحسن حفظ الملفات النشطة كل 15-20 دقيقة أثناء التجربة لمنع فقدان البيانات.
- زيادة درجة حرارة المياه في الساحة التجريبية بمعدل ~ 1.5 درجة مئوية كل 15 دقيقة لتحقيق منحدر من 12 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية على مدى فترة 2.5 ساعة عن طريق ضبط درجة حرارة حمام المياه إعادة الدوران.
ملاحظة: يمتد التوزيع الجغرافي لجراد البحر الأمريكي على تدرج حراري 25 درجة مئوية، ويمكن للأفراد التكيف مع والبقاء على قيد الحياة في درجات حرارة تصل إلى 30 درجة مئوية16. على هذا النحو ، تم اختيار 30 درجة مئوية كالحد الأعلى لهذا المنحدر من درجة الحرارة ، لأنه يضمن أن جراد البحر تجربة سيناريو مجهدة لا تصل إلى الحد الأقصى الحراري الحرج13، مما قد يؤدي إلى الوفيات. تم اختيار معدل معين من الاحترار لأنه يقع ضمن مجموعة من معدلات الاحترار نفذت في الدراسات باستخدام الأنواع الأخرى8,14 فضلا عن البحوث السابقة على جراد البحر الأمريكي13,27. قبل تنفيذ هذا البروتوكول، من المهم أن 1) تحديد النطاق المناسب من درجات الحرارة لتجربة معينة و 2) إجراء منحدر درجة الحرارة قبل المحاكمة مع ساحة تجريبية فارغة، لأن هذا سوف يساعد على تحديد تعديل درجة الحرارة اللازمة للحمام المائي لتحقيق المنحدر المطلوب. وهذا قد تختلف أيضا اعتمادا على حجم المياه في الساحة. - في جميع أنحاء منحدر درجة الحرارة، سجل كلما حدث تعديل قد يؤثر على الإخراج.
- لاحظ أن الرصيد على محول المعاوقة من المحتمل أن يحتاج إلى تعديل طوال التجربة، وقد يؤدي ذلك إلى ارتفاع غير مقصود في الإخراج.
- كما تبدأ درجة الحرارة في الساحة التجريبية للوصول إلى مستويات خارج النطاق الحراري المفضل من موضوع الاختبار، قد يؤدي تقلصات العضلات اللاإرادية إلى "ارتفاع" خاطئ في الناتج. في حالة حدوث ذلك، قم بإجراء تعليق لتحديد مناطق الإخراج التي يجب إزالتها أثناء عملية تحويل البيانات.
- عند الانتهاء من المنحدر، وإزالة جراد البحر من الساحة التجريبية ووضعه في حمام الانتعاش (12 درجة مئوية) ل ~ 20 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، والاستمرار في رصد معدل ضربات القلب في جراد البحر حتى يعود إلى المستويات القاعدية.
- بعد 20 دقيقة، اضغط على زر الإيقاف على إخراج PowerLab وحفظ الملف. قم بإزالة الأقطاب الكهربائية بعناية وقطع روابط الكابلات بالمقص الجراحي قبل إعادة الاختبار إلى خزانه.
ملاحظة: بدلاً من وضع جراد البحر مباشرة في حمام الانتعاش، خيار آخر هو العودة ببطء الساحة التجريبية إلى درجة حرارة البداية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تبريد الساحة التجريبية بنسبة ~ 1.5 درجة مئوية كل 15 دقيقة على مدار 2.5 ساعة إضافية.
4- تحويل البيانات
- فتح لوحة البيانات. تعيين العمود A إلى وقت بالنقر المزدوج على العمود A والنقر على التحديد والنقطة النشطة على الجانب الأيسر من قائمة إعداد عمود لوحة البيانات. حدد الوقت من الجانب الأيمن من القائمة وأغلق النافذة بالنقر فوق موافق.
- تعيين العمود B إلى متوسط درجة الحرارة عن طريق النقر المزدوج على العمود B وتحديد خيار الإحصائيات من الجانب الأيسر من قائمة إعداد العمود B للوحة البيانات. حدد المتوسط من الجانب الأيمن من القائمة والقناة 2 كمصدر حساب في الجزء السفلي من نافذة القائمة. انقر فوق موافق لإغلاق النافذة.
- تحويل الجهد المسجل إلى يدق في الدقيقة الواحدة
- انقر نقرًا مزدوجًا على العمود C وحدد التحديد والنقطة النشطة على الجانب الأيسر من القائمة. حدد مدة التحديد من الجانب الأيمن من القائمة وانقر فوق موافق لإغلاق النافذة.
- انقر نقرًا مزدوجًا على العمود D وحدد القياسات الدورية على الجانب الأيسر من القائمة. حدد عدد الأحداث من الجانب الأيمن من القائمة، والقناة 1 كمصدر حساب. انقر فوق موافق لإغلاق النافذة. سيؤدي ذلك إلى حساب قمم البيانات لتحديد معدل ضربات القلب عبر جزء محدد من البيانات.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، حدد زر الخيارات من أسفل القائمة وقم بضبط إعدادات الكشف لقراءة البيانات بدقة أكبر. مسح من خلال ملف البيانات وتحديد ما إذا كانت خيارات الشكل "Sine" أو "Spikey" تؤدي إلى عدد القمم الرئيسية فقط لإخراج نبضات القلب. بالإضافة إلى ذلك، قم بضبط عتبة ضبط الكشف على الجانب الأيمن من القائمة لتجاهل الضوضاء في ملف الإخراج. - انقر نقرًا مزدوجًا على العمود E وحدد القياسات الدورية على الجانب الأيسر من القائمة. حدد متوسط معدل الدوري والقناة 1 كمصدر حساب. ضبط إعدادات الكشف وضبط الكشف لمطابقة إعدادات العمود D (إذا تم التلاعب بها في الخطوة 4.4.2). انقر فوق موافق لإغلاق النافذة. وهذا يوفر التقدير النهائي لمعدل ضربات القلب (كما يدق في الدقيقة) على جزء محدد من البيانات.
- عند إعداد الأعمدة، ارجع إلى ملف البيانات وسلط الضوء على الأقسام المطلوبة من الإخراج، مع حذف مناطق البيانات الخاطئة كما تم تحديدها بواسطة التعليقات في القسم 3.6.
- حدد الأوامر وأضف متعددة إلى لوحة البيانات.
- حدد الوقت من البحث باستخدام القائمة المنسدلة وسحب البيانات كل 30 ق عن طريق تحديد كل مربع وإدخال "30" ضمن القائمة حدد.
- انقر على خيار التحديد الحالي من الخطوة إلى القائمة وانقر فوق إضافة.
- العودة إلى شاشة لوحة البيانات وحدد ملف وحفظ كما لحفظ الإخراج كملف Excel.
ملاحظة: هنا، يتم الإبلاغ عن معدل ضربات القلب (في يدق في الدقيقة) كل 30 سنة بدلا من كل دقيقة على أساس البحوث السابقة8،,27. وهذا يساعد أيضا على التقاط أكثر دقة التغييرات في البيانات الجهد في الوقت الحقيقي التي تم جمعها. من الممكن تحديد البيانات في فترات زمنية أقصر أو أطول استنادًا إلى التفضيل الفردي.
5. حساب درجة حرارة كسر أرهينيوس
- افتح ملف البيانات في Excel ومعالجة الإخراج من برنامج LabChart.
- تحويل درجة الحرارة من مئوية إلى المتبادل من كلفن باستخدام المعادلة التالية: [1000/(درجة الحرارة درجة مئوية + 273.15 K)].
- الحصول على السجل الطبيعي لمعدل ضربات القلب: ln (BPM).
- إنشاء مؤامرة Arrhenius عن طريق رسم معدل ضربات القلب كدالة لدرجة الحرارة، وأعرب عن ln (BPM) مقابل المتبادلة (K)13،15.
- في SigmaPlot، تناسب البيانات مع الانحدار قطعة وتحديد نقطة التقاطع، وهو ABT.
- نسخ البيانات المحولة ولصقها في مصنف جديد. حدد خيار الإحصائيات من القائمة الرئيسية ومعالج الانحدار من القائمة المنسدلة.
- في إطار المعادلة، حدد قطعة من قائمة فئة المعادلة ومقطعين خطيين أسفل مربع اسم المعادلة. انقر فوق التالي.
- في إطار المتغيرات، حدد بيانات درجة الحرارة المحولة لتكون متغير t وبيانات معدل ضربات القلب المحولة لتكون متغير y، باستخدام الخيارات المنسدلة في قائمة الأعمدة المتغيرة. تأكد من تحديد XY Pair في القائمة "البيانات من" قبل النقر فوق التالي.
- بعد مراجعة إطار "احتواء النتائج"، انقر فوق التالي وحدد المربع لإنشاء تقرير في إطار خيارات الإخراج الرقمية. انقر فوق التالي.
- في إطار خيارات الرسم البياني، تحقق من خيار إنشاء رسم بياني جديد تحت قسم الرسم البياني للنتائج الملائمة، وإضافة معادلة إلى عنوان الرسم البياني ضمن قسم ميزات الرسم البياني. انقر فوق إنهاء.
- في صفحة إخراج النتائج، استرجع المعادلات وقيم المعلمة لمنطقتي الانحدار التدريجي، بالإضافة إلى الإخراج الإحصائي للانحدار (على سبيل المثال، R2وF-statistic و p-value).
- باستخدام قيم المعلمة والمعادلات التي تم إنشاؤها، قم بتعيين القطعين المتساويين لبعضهما البعض وحل هاوية المتغير "t" لتحديد ABT. تحويل هذه القيمة مرة أخرى إلى مئوية باستخدام المعادلة التالية: °C = (1000/t) - 273.15.
ملاحظة: يمكن أيضاً حساب ABT في بيئة الحوسبة الإحصائية R باستخدام حزمة "مجزأة"17 في برنامج SAS18، أو باستخدام روتين "الانحدار الخطي القطاعي" في Prism819.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول استخدام الارتقان الرئوي للمقاومة للحصول على بيانات في الوقت الحقيقي لمعدل ضربات القلب (في الجهد) ودرجة الحرارة أثناء تجربة زيادة درجة الحرارة. عند تبرّد هذه التقنية، فإن سعة الفولتية ودرجات الحرارة المسجلة تختلف بناءً على التصميم التجريبي والأنواع البؤرية. ومع ذلك ، فإن خرج الجهد المعروض في الوقت الحقيقي يتبع توزيع جيب عام عند تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح(الشكل 1A). مع زيادة درجة الحرارة في الساحة ، فإن التوزيع في الوقت الحقيقي للتغيرات في الجهد لتعكس زيادة وتيرة قمم الجهد (أي دقات القلب ؛ الشكل 1باء). مع استمرار ارتفاع درجة حرارة الساحة إلى مستويات خارج نافذة الأداء الأمثل لموضوع الاختبار ، يتغير التوزيع لتصوير تردد منخفض لقمم الجهد مع شكل يشبه الجيب الذي تقطعه قمم متفرقة و / أو لحظات من "بطانة مسطحة"(الشكل 1C).
بمجرد تحويل البيانات الخام باستخدام مكون لوحة البيانات في برنامج LabChart ، فإن التوزيع الناتج لمعدل ضربات القلب (في الدقات في الدقيقة) على مدار منحدر درجة الحرارة يتبع توزيعًا مكافئًا إذا نجحت التجربة(الشكل 2). كما يتم زيادة درجة الحرارة في الساحة، ومعدل ضربات القلب من موضوع الاختبار يزيد أيضا لتلبية مطالب حيوية مرتفعة المرتبطة درجات الحرارة أكثر دفئا. ومع ذلك ، مع استمرار ارتفاع درجة الحرارة وبدء اختبار الموضوع لتجربة معتدلة إلى شديدة الإجهاد الحراري ، يبدأ معدل ضربات القلب في الانخفاض أو يصبح غير منتظم حيث يبدأ هذا الموضوع في إظهار التسامح الحراري السلبي (على سبيل المثال ، بداية التنفس اللاهوائي ، قمع معدل الأيض ، وانخفاض النشاط5،7). عندما يتم تحويل معدل ضربات القلب وبيانات درجة الحرارة ويتم إنشاء مؤامرة أرهينيوس ، يمكن حساب النقطة التي يبدأ فيها معدل ضربات القلب في الانخفاض (ABT)(الشكل 3). ثم تتناسب مؤامرة Arrhenius مع الانحدار التدريجي باستخدام البرامج الإحصائية التي يمثل فيها تقاطع الخطين ABT.
الشكل 1: إخراج تمثيلي من مسجل بيانات LabChart. يتم عرض التغيير في الوقت الحقيقي في الجهد عبر أقطاب موضوع الاختبار باللون الأحمر ، ويتم عرض الإخراج في الوقت الحقيقي المصاحب لدرجة حرارة الساحة (°C) باللون الأزرق. في بداية التجربة تحت درجات حرارة أكثر برودة (على سبيل المثال، 13.1 درجة مئوية)، يجب أن يتبع الجهد توزيعًا عامًا يشبه الجيب(A). مع زيادة درجة الحرارة (على سبيل المثال، 23 درجة مئوية)، يجب زيادة تواتر قمم الجهد، ولكن يجب أن يظل التوزيع يشبه الجيب(B). وأخيراً، كما يتم دفع موضوع الاختبار خارج إطار الأداء الحراري الأمثل (على سبيل المثال، 28.5 درجة مئوية)، يجب أن تصبح قمم الجهد غير منتظمة مع انخفاض التردد(C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التوزيع المتوقع لمعدل ضربات القلب على مسار منحدر درجة الحرارة. يتم تحويل بيانات الجهد التي تم جمعها من قبل مسجل البيانات إلى معدل ضربات القلب في يدق في الدقيقة الواحدة (BPM) باستخدام مكون لوحة البيانات من البرنامج. عندما يتم إجراء المنحدر بشكل صحيح، يتم عرض توزيع مكافئ لمعدل ضربات القلب على نطاق درجة الحرارة التي تم اختبارها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مثال على مؤامرة أرهينيوس. بمجرد تحويل البيانات في لوحة البيانات وتصديرها ، يتم تحويلها لإنشاء مؤامرة Arrhenius. في هذا المثال، يتم احتواء البيانات مع الانحدار غير الخطي المجزأ في SigmaPlot، مما يؤدي إلى إنشاء معادلات للمقاطع اليسرى واليمنى (المنطقة 1 والمنطقة 2، على التوالي) من خط الانحدار، بالإضافة إلى مقاييس الخير للملاءمة. يتم حل تقاطع خطي الانحدار كـ ABT (النجم الأحمر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول استخدام الارتقان الرئوي للمقاومة لقياس التغيرات في معدل ضربات القلب في اللافقاريات في المراحل المتأخرة أثناء تجربة زيادة درجة الحرارة. الفائدة الأساسية من هذه التقنية مقارنة بالنهج المختبرية الأخرى9,10,11 هو أنه هو الحد الأدنى من الغازية ولا تنطوي على التلاعب الجراحي ة الرئيسية من الهيكل الخارجي, وبالتالي تقليل مقدار وقت الانتعاش اللازمة قبل التجريب. وعلاوة على ذلك ، فإن المعدات سهلة الاستخدام ، ويمكن ببساطة التلاعب بالبيانات الناتجة وتفسيرها في برنامج البرامج المقترح. في حين يتم استخدام جراد البحر الأمريكي هنا كموضوع نموذجي ، تم تنفيذ هذه التقنية بنجاح في بلح البحر الأزرق(Mytilus spp.14)ويمكن تعديلها بسهولة للاستخدام في اللافقاريات الأخرى في مرحلة متأخرة (أي السرطانات والجمبري والصمامات الثنائية الأخرى).
ومن الفوائد الإضافية للبروتوكول أنه يركز على حساب الـ ABT كمؤشر غير فتاك للحدود الحرارية. على الرغم من أن العديد من الدراسات تقدمCT ماكس كنقطة نهاية كبيرة عند تحديد الأداء الفسيولوجي الحراري5،8،20،21،22،23، نادرا ما تواجه الكائنات الحية درجات حرارة في هذا النطاق في البيئة الطبيعية5. وعلاوة على ذلك، كماماكس CT غالبا ما تكون درجة حرارة قاتلة، وذلك باستخدام هذا المقياس كنقطة النهاية المفضلة يمنع استخدام مواضيع الاختبار في التجارب إضافية أو متابعة بعد الإجهاد الحراري23. عند السعي لحساب ABT باستخدام هذا البروتوكول ، من الأهمية بمكان زيادة درجة الحرارة في الساحة التجريبية إلى درجة دفع الاختبار الخاضع للحد الفسيولوجي دون التسبب في الموت. لذلك ، يوصى بتحديد الحدود الحرارية المحتملة للأنواع المحورية من خلال دراسة تجريبية (عندما يكون ذلك ممكنًا) قبل تحديد النطاق الكامل لمنحدر درجة الحرارة التجريبي.
ويوصى أيضا أن الباحثين تحديد ومراقبة الاختلافات الطبيعية في معدل ضربات القلب القاعدية من الأنواع المحورية عندما يتم الحفاظ على درجة الحرارة في الساحة التجريبية عند مستوى ثابت وغير مجهدة قبل التجربة المنحدرة. وهذا مفيد بشكل خاص للأنواع المحورية التي لا تتوفر فيها معلومات معدل ضربات القلب في الأدبيات المنشورة. كما أنه بمثابة ممارسة وافرة من تقنيات زرع القطب. وقد يساعد ذلك الباحثين أيضًا في تحديد وقت التأقلم المناسب اللازم لضمان عدم وجود طفرات زائفة في معدل ضربات القلب بسبب التعامل مع الإجهاد في بداية التجربة.
على الرغم من أن البروتوكول يناقش استخدام النُصوغرافيا المعوقة في سياق الإجهاد الحراري وحده، إلا أنه يمكن استخدامه أيضًا لاستكشاف الآثار التفاعلية المحتملة للضغوطات الأخرى على علم وظائف الأعضاء الحراري. يمكن تقليل أداء الكائن الحي في وجود الضغوطات البيئية (أي نقص الأكسجة وفرط الكبة والملوثات و / أو التغيرات في الملوحة) ، والتي قد تضغط أيضًا نطاقات درجة الحرارة المثلى للأداء7،24،25،26. على هذا النحو ، يمكن تعديل هذا البروتوكول لاستكشاف كيفية التعرض لمختلف الضغوطات قبل ارتفاع درجة الحرارة قد يؤثر على الأداء.
على سبيل المثال، هارينغتون وهاملين27 تعرض الحدث H. أمريكانوس لظروف الحموضة الحالية أو المتوقعة في نهاية القرن (8.0 و 7.6، على التوالي) لمدة شهرين قبل تقييم أداء القلب خلال منحدر درجة الحرارة. وقد أظهرت جراد البحر المعرضة مسبقاً لبيئات أكثر حموضة انخفاضاً كبيراً في متوسط ABT مقارنة بتلك الموجودة في ظل ظروف الحموضة الحالية. وهذا يشير إلى أن انخفاض درجة الحموضة البيئة يقلل من الأداء الحراري ويمكن أن تزيد من خطر تلف الخلوية بسبب الإجهاد الحراري في درجات حرارة أقل27. ويمكن للجهود المقبلة أن تتوسع في الطريقة المعروضة هنا لتشمل التعرض المسبق لأي مجموعة من الضغوطات البيئية قبل اتباع هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول لقياس التغيرات في أداء القلب أثناء التعرض للإجهادات الحيوية، فضلا عن كيفية الحدود الحرارية يمكن أن تتغير وفقا لontogeny4،5.
ومن القيود الرئيسية على هذا البروتوكول أن المعدات على النحو المبين مقيدة للاستخدام في بيئة مختبرية، مما قد يحد من إمكانية تطبيقها على التجارب الميدانية التي تتطلب معدات أكثرتخصصاً 8. تتطلب هذه التقنية أيضًا ضبط النفس في مواضيع اختبار الموتيل العالي (مثل جراد البحر وسرطان البحر) للحد من إنتاج نقاط البيانات الزائفة الناتجة عن حركات العضلات غير القلبية. على الرغم من أن هذا قد يحد من السلوكيات الطبيعية أثناء منحدر درجة الحرارة، فإن تأثير القيود متناسق عبر جميع مواضيع الاختبار. الأهم من ذلك ، هناك احتمال تلف الأنسجة أو الوفاة في مواضيع الاختبار إذا تم تنفيذ الحفر العدواني أو المهمل أثناء زرع القطب. هذا يتناقض بشكل حاد مع التصوير الضوئي بالأشعة تحت الحمراء، وهي تقنية غير باضعة حقا يستخدم محول الأشعة تحت الحمراء الخارجية لتمرير الضوء من خلال التامور وسجل وظيفة القلب عن طريق تحويل الطاقة الخفيفة المنعكسة إلى الجهد8،28.
على الرغم من أن التصوير الضوئي بالأشعة تحت الحمراء يقلل من خطر التعامل مع الإجهاد مقارنة بالتصوير الرئوي للمقاومة ، فإن زرع الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح باستخدام الطريقة الموصوفة يؤدي إلى الحد الأدنى من الصدمة ، ويسمح بوقت التأقلم السريع ، ويؤدي إلى الشفاء السريع دون تحفيز الوفيات في مواضيع الاختبار بعد تجربة التكثيف27. كما لا يوجد فرق كبير في الناتج القلبي المسجلة من قبل كل من الطريقتين28،ويخلص إلى أن مقاومة pneumography هو تقنية موثوق بها والحد الأدنى الغازية لتقييم أداء القلب. وأخيراً، فإن الفوائد والمرونة العديدة للبروتوكول تنطوي على إمكانية توضيح كيفية تفاعل العوامل البيئية المختلفة مع درجة الحرارة للتأثير على الأداء الفسيولوجي في القشريات في مرحلة متأخرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر بول راوسون للمساعدة المختبرية والمؤسسة الوطنية للعلوم جائزة IIA-1355457 إلى ماين EPSCoR في جامعة ماين للحصول على أموال لشراء المعدات. وقد تم دعم هذا المشروع من قبل المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية، ومشروع هاتش رقم MEO-21811 من خلال محطة ماين للتجارب الزراعية والحرجية، وكذلك دائرة المصايد البحرية الوطنية التابعة للإدارة الوطنية للمحيطات والغلاف الجوي سالتونستال كينيدي غرانت #18GAR039-136. كما يشكر المؤلفون ثلاثة مراجعين مجهولين على تعليقاتهم على نسخة سابقة من هذه المخطوطة. منشور محطة التجارب الزراعية والغابات في ولاية ماين رقم 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P. Physiology and climate change. Science. 322 (5902), 690-692 (2008).
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
