Summary
在热挑战期间测量心率有助于深入了解由于急性环境变化而对生物体的生理反应。该协议使用美国龙虾（霍马鲁斯美洲）作为模型有机体，将阻抗肺造像描述为一种相对非侵入性和非致命的方法，以测量晚期无脊椎动物的心率。
Abstract
由于世界气候的广泛变化，海洋温度正在迅速上升。由于生物生理学受到环境温度的严重影响，这有可能改变各种海洋生物的热生理性能。该协议使用美国龙虾（霍马鲁斯美洲）作为模型有机体，描述了使用阻抗肺造影来了解晚期无脊椎动物的心脏性能在急性热应力下如何变化。该协议提出了一种微创技术，允许在温度升高实验中实时收集心率。数据很容易纵，以生成一个 Arrhenius 图，用于计算 Arrhenius 破碎温度（ ABT ），心率开始下降的温度随着温度的升高而下降。这种技术可用于各种晚期无脊椎动物（即螃蟹、贝类或虾）。虽然该协议只关注温度对心脏性能的影响，但可以修改，以了解额外的压力因素（例如缺氧或重卡过激）与温度相互作用以影响生理性能的可能性。因此，该方法有可能广泛应用，以进一步了解海洋无脊椎动物如何应对环境的急剧变化。
Introduction
近几十年来，温室气体（即二氧化碳、甲烷和一氧化二氮）对大气的投入增加，导致环境变化模式普遍。世界海洋正在迅速变暖22，3，3这一趋势可能对生物生理学产生严重影响。温度严重影响生理速率，生物体具有最佳温度范围，性能为,4、5、6。,6因此，当温度偏离此范围时，个人在保持适当的氧气输送到组织方面可能会遇到困难。这有可能导致在海洋温度上升5，77时，有氧表演下降。
在实验室环境中，了解环境变化的生理影响的方法是在热应力背景下检查心脏性能。这提供了洞察暴露于预测的变暖条件如何改变性能曲线55，66以及适应可塑性8的可能性。已经成功地实施了多种方法，以测量海洋无脊椎动物的心率。然而，许多这些技术涉及手术切除或主要操纵外骨骼和延长植入测量装置9,9，10，11，,11这给测试对象带来了额外的压力，并增加了在实验前成功恢复所需的时间。此外，侵入性较低的技术（如视觉观察、摄像学）可能仅限于早期生命史阶段，此时生物体可能是完全或半透明的12。此外，对于对技术更先进的方法（例如，通过红外传感器或多普勒灌注88、1111进行观测）的研究人员来说，可能还会面临额外的挑战。
该协议使用美国龙虾（霍马鲁斯美洲）作为晚期海洋无脊椎动物模型，以证明在温度升高实验中使用阻抗肺功能学来评估心率变化。阻抗肺活造术涉及在位于心外两侧的两个电极上传递振荡电流（AC），以测量心脏收缩时电压的变化，并放松13，14。13,该技术具有微创性，因为它使用小电极（即直径为0.10~0.12毫米），这些电极被轻轻地植入外骨骼下方。最后，它使用数据记录器提供在斜坡期间心率和水温的实时评估。
该协议还提供了计算Arrhenius破碎温度（ABT）的说明，即心率随着温度升高13、15,15开始下降的温度开始下降。ABT作为测试受试者容量热极限的非致命指标，可能比测量临界热最大值（CT最大值，心脏功能55，66的上限）更受青睐，因为致命极限往往是极端的，在自然环境中很少遇到。
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Protocol
1. 设备设置
- 环绕清晰、可塑性管绕自身，形成直径约8~10厘米、长40~70厘米的热交换线圈。使用电气胶带固定线圈。
- 将热交换线圈连接到冷却/加热循环水槽的外部电源和回管。使用软管夹确保连接安全。
- 用反渗透 （RO） 水填充冷却/加热循环水槽的井，并将电源线插入出口。打开水浴，确保与热交换线圈连接时没有泄漏。
- 通过将黑色 BNC 电缆插入装置上的交流输出，并使用通道 1端口将其连接到数据记录器（材料表），从而设置阻抗转换器。
- 将热电偶探头（温度记录器）插入 T 型吊舱，然后将 T 型吊舱插入数据记录器的通道 2端口。
- 将数据记录器的电源线插入电源，并使用 USB 电缆连接器将数据记录器连接到 PC 计算机。
- 用7.5升的人工海水填充适应室和实验场（盐度=35 ppt，pH = 8.1，温度=+12°C）。
注：适应室所需的水的体积、温度和化学以及实验场的起始条件取决于实验设计。重要的是，这些容器必须足够大，以便舒适地淹没测试对象。
2. 电极的植入
- 将龙虾放在塑料栅格上，轻松放入实验竞技场，使身体在矩形的一端舒适地制作 Y 形。
- 使用小电缆扎带小心地将龙虾的爪子和腹部固定到塑料碎栅上。电缆扎扎应足够紧，以防止移动，但允许手术剪刀的空间，以删除他们完成实验。
- 用纸巾擦干甲壳，用浸在70%乙醇的棉球清洗。
- 为电极创建孔。
- 使用小钻头（例如 1.6 mm），缓慢而小心地用手钻两个小孔（几乎）穿过心形的两侧的卡克拉佩。
- 通过轻轻插入无菌解剖针完成每个孔。
- 如果针头不易穿过甲壳体，请继续缓慢地用手钻，然后再尝试针头。
注意：为了尽量减少实验动物的压力，强烈建议在实验前练习这种技术。随着时间的推移，用户可以轻松地通过感觉钻位几乎通过卡触和切换到针。手钻适合龙虾和螃蟹，特别是如果外骨骼是软的（即动物最近蜕变）。但是，如果测试对象具有较厚的外骨骼或壳体（即双壳体），则德雷梅尔工具更合适。
- 获取电极（36~38 G 磁丝，直径 0.10–0.12 毫米），并使用解剖刀刃刮掉导线尖端的少量绝缘层。小心地将每根导线的尖端弯曲成一个小钩子，使用钳子，并将一根插入到每个新钻孔中。
- 使用一小滴氰丙烯酸酯胶水固定每个导线导线，使其干燥 5-10 分钟。
注：谨慎使用胶水至关重要，因为添加过多会重新连接导线并防止信号被记录。 - 胶水干燥后，将导线连接到阻抗转换器并打开。将龙虾放入适应室，使其适应植入电极 15-20 分钟。
注：快速或不和谐的运动，以及不完全干燥的胶水，可能会导致电极脱离甲壳。如果发生这种情况，返回到步骤 2.6。 - 打开数据记录器并打开计算机上的 LabChart 软件。单击"新建实验"，使图表视图屏幕保持打开状态。
- 在图表视图中，从屏幕的右侧部分找到通道 1 的频道功能菜单。从菜单中选择输入放大器，然后选择交流耦合。来自测试主体的传入信号现在将实时显示在屏幕上。
注： 可以通过选择"范围"弹出式菜单来调整通道的灵敏度。调整范围，直到信号峰值达到全量刻度的 25%-75%。单击"确定"关闭输入放大器。 - 在阻抗转换器上，调整增益（大小）和平衡，直到数据记录器输出上观察到强信号，目的是使平衡保持在接近零的水平。
- 在第 2 通道上，选择 T 型窗格以记录实时温度数据。
- 正确设置两个通道后，单击"开始"按钮，数据记录器将开始记录数据。
3. 温度上升
- 适应期过后，将塑料栅格与附着的龙虾小心地放入实验场，并将热交换线圈放在栅格顶部。
- 将热电偶探头放在龙虾附近，确保在将盖子放在实验竞技场上之前将其完全浸没，以减少对测试对象的视觉压力。
- 根据需要调整余额，并评论输出，说明试验已经开始。
- 在整个实验中，可以而且应该定期保存输出。
- 单击"文件"并选择"保存为"以最初将输出保存到计算机。
- 在实验期间保存时，单击"文件"并选择"保存"。
注：尽管 LabChart 软件可以在意外程序关闭（例如断电）时恢复文件，但建议在实验期间每 15-20 分钟保存一次活动文件，以防止数据丢失。
- 通过调整循环水浴的温度，每15分钟以±1.5°C的速度提高实验场的水温，在2.5小时期间达到12°C至30°C的斜坡。
注：美国龙虾的地理分布跨越25°C的热梯度，个体可以在高达30°C16的温度下适应和生存。因此，30°C被选为这个温度上升的上限，因为它确保龙虾经历一个压力情况，没有达到临界热最大值13，这可能导致死亡。选择具体的变暖速度是因为它属于使用,其他物种8、14以及先前对美国龙虾13、27的研究所实施的变暖速率范围。,14 27在实施此协议之前，重要的是 1） 确定给定实验的适当温度范围，2） 使用空实验场进行审前温度斜坡，因为这将有助于确定水浴的必要温度调整以实现所需的斜坡。这可能也因竞技场中的水量而异。 - 在整个温度斜坡中，每当发生可能影响输出的调整时，都会记录。
- 请注意，在整个实验过程中可能需要调整阻抗转换器上的天平，否则可能会导致输出出现意外峰值。
- 当实验场的温度开始达到测试对象首选热范围以外的水平时，非自愿的肌肉收缩可能导致输出中出现错误的"尖峰"。如果发生这种情况，请进行注释，以确定在数据转换过程中应删除的输出区域。
- 坡道完成后，将龙虾从实验竞技场中取出，放入回收浴（12°C）中，温度为+20分钟。如果需要，继续监测龙虾的心率，直到它恢复到基底水平。
- 20 分钟后，点击 PowerLab 输出上的"停止"按钮并保存文件。小心地取出电极，用手术剪刀切割电缆扎带，然后再将测试对象返回到其固定水箱。
注：而不是把龙虾直接放入回收浴，另一个选择是慢慢地使实验场恢复到其起始温度。这是通过在额外的2.5小时过程中每15分钟冷却实验场1.5°C来实现的。
4. 数据转换
- 打开数据板。通过双击列 A并单击数据板 A 列设置菜单左侧的选择和活动点，将 A 列设置为时间。从菜单的右侧选择时间，然后单击"确定"关闭窗口。
- 双击列 B并从数据板列 B 设置菜单的左侧选择"统计信息"选项，将列 B 设置为平均温度。从菜单的右侧选择平均值，选择通道 2作为菜单窗口底部的计算源。单击"确定"关闭窗口。
- 将记录的电压转换为每分钟节拍
- 双击C 列，然后选择菜单左侧的选择和活动点。从菜单的右侧选择"选择持续时间"，然后单击"确定"以关闭窗口。
- 双击D 列并选择菜单左侧的循环测量。从菜单的右侧选择事件计数，将通道 1作为计算源。单击"确定"关闭窗口。这将计算数据的峰值，以确定所选数据部分的心率。
注：如果需要，从菜单底部选择"选项"按钮，然后调整"检测设置"以更准确地读取数据。扫描数据文件并确定"Sine"或"Spikey"形状选项是否仅导致检测信号输出的主要峰值计数。此外，调整菜单右侧的检测调整阈值以忽略输出文件中的杂色。 - 双击E 列，然后选择菜单左侧的循环测量。选择平均循环速率，选择通道1作为计算源。调整检测设置和检测调整以匹配列 D 的设置（如果在步骤 4.4.2 中操作）。单击"确定"关闭窗口。这提供了对所选数据部分心率（作为每分钟节拍）的最终估计。
- 设置列后，返回到数据文件并突出显示输出所需的部分，省略第 3.6 节中注释标识的错误数据区域。
- 选择命令和多个添加到数据板。
- 通过选中"每个"框并在"选择"菜单下输入"30"，从"使用下拉菜单查找时间"中选择时间，并每隔 30 s 提取一次数据。
- 单击"单步执行"菜单中的"当前选择"选项，然后单击"添加"。
- 返回到数据板屏幕并选择"文件"并另存为"以保存输出为 Excel 文件。
注：在这里，心率报告（以每分钟节拍）每30秒，而不是每分钟根据以前的研究8,8，27。这也有助于更准确地捕获实时收集的电压数据的变化。可以根据个人偏好选择较短或更长时间间隔的数据。
5. 计算阿赫尼乌斯破碎温度
- 在 Excel 中打开数据文件并操作 LabChart 软件的输出。
- 使用以下方程将温度从摄氏度转换为开尔文的对等温度：[1000/（温度 +C = 273.15 K）]。
- 获取心率的自然日志：ln（BPM）。
- 通过绘制心率作为温度函数生成 Arrhenius 图，表示为 ln（BPM） 与互惠 （K）13、15。
- 在 SigmaPlot 中，将数据与分段回归拟合，并确定交点（即 ABT）。
- 复制转换后的数据并将其粘贴到新的工作簿中。从主菜单中选择"统计信息"选项，从下拉列表中选择回归向导。
- 在"方程"窗口中，从"方程类别"菜单中逐块选择，在"方程名称"框中选择 2 个线段线性。单击"下一步"。
- 在"变量"窗口中，使用"变量列"菜单中的下拉选项，选择转换的温度数据为t变量，转换后的心率数据为y变量。在单击"下一步"之前，请确保在"数据来自"菜单中选择XY 对。
- 查看"拟合结果"窗口后，单击"下一步"，并在"数字输出选项"窗口中选中"创建报表"复选框。单击"下一步"。
- 在"图形选项"窗口中，选中"拟合结果图"部分下的"创建新图形"选项，并在"图形要素"部分下将公式添加到图形标题。单击"完成"。
- 在"结果"输出页上，检索逐段回归两个区域的方程和参数值，以及回归的统计输出（例如 R2、F统计和 p 值）。
- 使用生成的参数值和方程，将两个线段设置相等，并求解变量"t"以确定 ABT。 使用以下方程将此值转换回摄氏度：°C = （1000/t） - 273.15。
注：ABT也可以在R统计计算环境中计算，使用程序SAS 18中的包"分段"17，或使用18Prism819中的"段线性回归"例程计算。
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Representative Results
该协议描述了在温度升高实验中使用阻抗肺造影来获取心率（电压）和温度的实时数据。当穿孔此技术时，记录的电压和温度的振幅将因实验设计和焦点物种而异。但是，当协议正确实现时，实时显示的电压输出遵循一般正则分布（图 1A）。随着竞技场温度的升高，电压的实时分布变化，以反映电压峰值（即心跳）的频率增加;图1B。随着竞技场温度继续升高到测试主体最佳性能窗口以外的水平，分布变化描绘了电压峰值频率降低，其类似等子形的形状被零星的峰值和/或"平衬"瞬间打断（图1C）。
一旦使用 LabChart 软件的数据板组件转换原始数据，如果实验成功，则在温度斜坡过程中产生的心率分布（以节拍为每分钟），遵循抛物面分布（图 2）。随着竞技场温度的升高，测试主体的心率也会增加，以满足与温度升高相关的高能量需求。然而，随着温度的继续升高和测试对象开始经历中度至极端热应力，心率开始下降或变得不稳定，因为受试者开始表现出被动的热耐受性（例如，厌氧呼吸的开始，代谢率抑制，和减少活动55，7）。7当心率和温度数据被转换并生成Arrhenius图时，可以计算心率开始下降的点（ABT）。图3）。然后，Arrhenius 图与使用统计软件进行分段回归，其中两条线的交集表示 ABT。
图 1：来自 LabChart 数据记录器的代表性输出。测试主体电极之间的电压实时变化显示为红色，同时竞技场温度 （°C） 的实时输出显示为蓝色。在较冷的温度（例如 13.1 °C）下实验开始时，电压应遵循一般等子状分布（A）。随着温度的升高（例如 23 °C），电压峰值的频率应增加，但分布应保持正极（B）。最后，当测试对象被推到其最佳热性能窗口之外（例如 28.5 °C）时，电压峰值会随着频率降低（C） 变得不稳定。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：在温度斜坡过程中心率的预期分布。数据记录器收集的电压数据使用软件的数据键盘组件以每分钟节拍 （BPM） 转换为心率。当斜坡正确进行时，将显示心率在测试温度范围内的抛物面分布。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：Arrhenius 绘图的示例。数据在数据盘中转换并导出后，将转换数据以生成 Arrhenius 绘图。在此示例中，数据与 SigmaPlot 中的分段非线性回归一致，生成回归线左侧和右侧段（分别为区域 1 和区域 2）的方程以及拟合度指标。两条回归线的交点作为 ABT（红星）求解。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
该协议描述了在温度升高实验中使用阻抗肺功能学测量晚期无脊椎动物心率变化。与其他基于实验室的方法99、10、1110,11相比，该技术的主要优点是，它具有微创性，不涉及外骨骼的重大手术操作，从而减少了实验前所需的恢复时间。此外，设备易于使用，结果数据可以在建议的软件程序中简单操作和解释。虽然美国龙虾在这里被用作模型主题，但这项技术已经成功地在蓝贝类（Mytilus spp.14）中实现，并且可以很容易地修改，用于其他晚期无脊椎动物（即螃蟹、虾和其他双壳类）。
该协议的另一个好处是，它侧重于将ABT计算为热极限的非致命性指标。虽然许多研究认为CT最大值是确定热生理性能55、8、20、21、22、23时的重要终点，但生物体很少在自然环境中遇到这种范围内的温度,8,20,21,22,23。此外，由于CT最大值通常是致命的温度，使用此指标作为首选的终点，排除了测试对象在热应力后的额外或后续实验中使用23。当打算使用这种协议计算ABT时，将实验场的温度提高到在不诱导死亡的情况下将测试对象推到生理极限至关重要。因此，建议在确定实验温度斜坡的全部范围之前，通过试验性研究（如果可能）确定焦点物种的潜在热极限。
还建议研究人员在斜坡实验前将实验场的温度保持在恒定且无压力水平时，确定并观察焦点物种基底心率的自然变化。这对在已发表的文献中没有静息心率信息的焦点物种特别有帮助。它还作为电极植入技术的充分实践。这也可以帮助研究人员确定适当的适应时间，以确保没有假的心率峰值是由于处理压力在实验开始时。
虽然该协议讨论了仅在热应力环境下使用阻抗肺造影，但它也可用于探索其他压力器对热生理学的潜在交互作用。有机体性能可在环境压力因素（即缺氧、重度、污染物和/或盐度变化）存在的情况下降低，这也可能压缩最佳温度范围，以达到性能77、24、25、26。24,25,26因此，可以修改此协议，以探索在温度升高之前暴露于各种压力器时如何影响性能。
例如，哈林顿和哈姆林27在评估温度升高期间的心脏表现之前，将幼年H.usus暴露于当前或预测的世纪末pH条件（分别为8.0和7.6）。与当前pH条件下的龙虾相比，预先暴露在酸性环境中的龙虾平均ABT显著减少。这表明，低pH环境会降低热性能，并可能增加在较低温度下因热应力而造成细胞损伤的风险。今后的努力可以扩大这里介绍的方法，在遵守本议定书之前包括预先接触任何环境压力因素的组合。此外，可以修改该协议，以测量接触生物压力器期间心脏性能的变化，以及热极限如何根据44、55而改变。
该协议的一个主要限制是，所述设备被限制在实验室环境中使用，这有可能限制其适用于需要更专业设备的实地实验。这种技术还要求高度运动测试对象（如龙虾和螃蟹）保持克制，以减少非心肌运动导致的虚假数据点的生成。虽然这可能限制温度上升期间的自然行为，但约束的影响在所有测试对象中是一致的。最重要的是，如果在电极植入过程中进行攻击性或粗心钻取，测试对象有组织损伤或死亡的可能性。这与红外光胸成像形成鲜明对比，这是一种真正的非侵入性技术，它利用外部红外传感器将光通过心外，通过将反射光能转换为电压88，2828来记录心脏功能。
虽然红外光胸成像比阻抗肺造影相比，降低了处理压力的风险，但使用所述方法正确植入电极可减少创伤，从而缩短适应时间，并在斜坡实验27后快速恢复，而不会导致受试者死亡。由于两种方法28所记录的心脏输出没有显著差异，因此认为阻抗肺造影是评估心脏性能的可靠和微创技术。最后，该协议的许多优点和灵活性有可能阐明各种环境因素如何与温度相互作用，如何影响晚期甲壳类动物的生理性能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢保罗·罗森的实验室援助，国家科学基金会向缅因大学缅因州EPSCoR颁发了IIA-1355457，用于购买设备的资金。该项目得到了美国农业部国家粮食和农业研究所的支持，哈奇项目编号MEO-21811，通过缅因州农业和森林实验站，以及NOAA国家海洋渔业服务Saltonstall肯尼迪赠款#18GAR039-136。作者还感谢三位匿名评论者对本手稿的先前版本的评论。缅因州农业和森林实验站出版物编号3733。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P. Physiology and climate change. Science. 322 (5902), 690-692 (2008).
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
