אימפאוגרפיה עכבה עבור מדידה פולשנית מינימלית של קצב הלב בשלב מאוחר יצורים חסרי חוליות

Summary

קצב לב מדידת במהלך אתגר תרמי מספק תובנה לתגובות פיסיולוגיים של אורגניזמים כתוצאה של שינוי סביבתי אקוטי. באמצעות הלובסטר האמריקאי (הומארוס אמריקאנוס) כאורגניזם מודל, פרוטוקול זה מתאר את השימוש האימפאוגרפיה עכבה כגישה בלתי פולשנית ולא קטלנית כדי למדוד את קצב הלב של חסרי חוליות בשלב מאוחר.

Abstract

הטמפרטורות באוקיינוסים הולכות וגדלות במהירות כתוצאה משינויים נרחבים באקלים העולמי. כאשר הפיזיולוגיה של הארגון מושפע במידה רבה מטמפרטורת הסביבה, זה בעל פוטנציאל לשנות ביצועים פיזיולוגיים תרמית במגוון של אורגניזמים ימיים. באמצעות לובסטר אמריקאי (הומארוס אמריקאנוס) כאורגניזם מודל, פרוטוקול זה מתאר את השימוש של האימפאוגרפיה עכבה כדי להבין כיצד ביצועים קרדיומטרים בשלב מאוחר משתנה תחת לחץ תרמי חריף. הפרוטוקול מציג טכניקה מינימלית פולשנית המאפשרת איסוף בזמן אמת של קצב הלב במהלך ניסוי הרפינג בטמפרטורה. נתונים מניפולציות בקלות כדי ליצור מזימה Arrhenius המשמש לחישוב הטמפרטורה של Arrhenius (ב), הטמפרטורה שבה קצב הלב מתחיל לרדת עם הגדלת טמפרטורות. ניתן להשתמש בטכניקה זו במגוון של יצורים חסרי חוליות בשלב מאוחר (כלומר, סרטנים, מולים או שרימפס). למרות שהפרוטוקול מתמקד אך ורק בהשפעה של הטמפרטורה על ביצועי הלב, ניתן לשנות אותו כדי להבין את הפוטנציאל של לחצים נוספים (למשל, היפוקסיה או hypercapnia) לקיים אינטראקציה עם הטמפרטורה כדי להשפיע על הביצועים הפיזיולוגיים. לפיכך, לשיטה יש פוטנציאל ליישומים רחבים כדי להבין עוד כיצד חסרי חוליות ימיים מגיבים לשינויים חריפים בסביבה.

Introduction

בעשורים האחרונים, מוגבר קלט גזי החממה (כלומר, פחמן דו חמצני, מתאן, ו תחמוצת החנקן) לתוך האטמוספירה הביא דפוסים נרחבים של שינוי סביבתי¹. האוקיינוסים של העולם הם התחממות במהירות^2,3, מגמה כי ייתכן השפעות חמורות על הפיזיולוגיה של אורגאימאל. הטמפרטורה משפיעה בכבדות על שיעורי פיסיולוגיים, ולאורגניזמים יש טווח טמפרטורות אופטימלי לביצועים^4,5,6. ככאלה, אנשים עלולים להיתקל בקשיים בשמירה על אספקת חמצן נכונה לרקמות כאשר הטמפרטורות תועות מחוץ לטווח זה. לדבר זה יש פוטנציאל להוביל לירידות בביצועי אירובי בפני הטמפרטורות המתחממות של האוקיינוס^5,7.

במסגרת מעבדה, שיטה להבנת ההשפעות הפיזיולוגיות של שינוי סביבתי היא לבחון את ביצועי הלב בהקשר של מתח תרמי. הדבר מספק תובנה כיצד חשיפה לתנאי ההתחממות החזוי עשויה לשנות את עקומות הביצועים^5,6 , כמו גם את הפוטנציאל ליכולת הסתגלות הפלסטיות⁸. מגוון שיטות יושמו בהצלחה כדי למדוד את קצב הלב בפני חסרי חוליות ימיים. עם זאת, רבים של טכניקות אלה כרוכות הסרה כירורגית או טיפול מרכזי של שלד חיצוני והשרשה ממושכת של התקני מדידה^9,10,11, אשר מציג מתח נוסף לנושא הבדיקה ומגביר את הזמן הדרוש להתאוששות מוצלחת לפני ניסויים. יתר על כן, טכניקות פחות פולשנית (למשל, התבוננות חזותית, videography) ניתן להגביל את השלבים המוקדמים בהיסטוריה של החיים כאשר אורגניזמים עשויים להיות מלא או שקוף למחצה¹². יתרה מזאת, ניתן להציג אתגרים נוספים לחוקרים שאינם מקיאים בשיטות מתקדמות יותר מבחינה טכנולוגית (למשל, תצפיות באמצעות התמרה אינפרא-אדום או מיזוג דופלר^8,11).

פרוטוקול זה משתמש הלובסטר האמריקאי (הומארוס אמריקאנוס) כמו מודל חסרי חוליות ימית בשלב מאוחר כדי להדגים את השימוש של האימפגרפיה עכבה להערכת שינויים בקצב הלב במהלך ניסוי הפינג טמפרטורה. הדיאוגרפיה עכבה מערבת מעבר של זרם חשמלי מנדנוד (AC) על פני שתי אלקטרודות הממוקמות משני צדי קרום הלב כדי למדוד שינויים במתח כחוזי הלב ומרגיעה^13,14. טכניקה זו היא פולשנית מינימלית, כפי שהיא מעסיקה את השימוש באלקטרודות קטנות (כלומר, 0.10 – 0.12 מ"מ קוטר) כי הם מושתלים בעדינות רק מתחת לשלד החיצוני. לבסוף, הוא מספק הערכות בזמן אמת של קצב הלב וטמפרטורת המים במהלך הרמפה באמצעות לוגר נתונים.

הפרוטוקול מספק גם הוראות לחישוב טמפרטורת השבר arrhenius (ב), הטמפרטורה שבה קצב הלב מתחיל להצטמצם עם הגדלת טמפרטורות^13,15. ה-t משמש כאינדיקציה לא קטלנית למגבלה התרמית של הקיבולת בנבדקים שעשויים להיות מועדפים על מדידת המקסימום התרמי הקריטי (CT_max, הגבול העליון של תפקוד הלב^5,6), כמגבלות קטלניות הם לעתים קרובות קיצוניים ולעיתים רחוקות נתקלים בסביבה הטבעית⁵.

Protocol

1. התקנת ציוד

1. לעטוף ברור, אבובים מחושל סביב עצמו כדי ליצור סליל החלפת חום כי הוא כ 8 – 10 ס"מ בקוטר יש הרחבות 40 – 70 ס"מ ארוך. אבטחו את הסליל. בעזרת הקלטת החשמלית
2. חברו את הסליל להחלפת חום לאספקה החיצונית ואביזרי החזרה של אמבט קירור/חימום מים במחזור. ודא שהחיבור מאובטח באמצעות מלחציים בצינור.
3. למלא את הבאר של הקירור/חימום מים במחזור אמבטיה עם אוסמוזה הפוכה (RO) מים לחבר את כבל החשמל לשקע. הפעל את אמבטיית המים וודא שאין דליפות בקשר לסליל החלפת חום.
4. הגדר את ממיר העכבה על-ידי חיבור בכבל BNC השחור לפלט AC ביחידה וחיבורו לאוגר הנתונים (טבלת חומרים) באמצעות יציאת ערוץ 1 .
5. חבר את החללית הזוג תרמותרמיים (מקליט טמפרטורה) לתוך pod סוג T, ואז לחבר את התרמיל T-type לתוך ערוץ 2 הנמל של לוגר הנתונים.
6. חבר את כבל החשמל של לוגר הנתונים לאספקת חשמל וחבר את לוגר הנתונים למחשב מחשב באמצעות מחבר כבל ה-USB.
7. מלאו את חדר ההתרגל ואת הזירה ניסיוני עם 7.5 L של מי ים מלאכותיים (מליחות = 35 ppt, pH = 8.1, טמפרטורה = ~ 12 ° צ').
   הערה: הנפח, הטמפרטורה והכימיה של המים הנחוצים לחדר ההתרגל ותנאי ההתחלה בזירה הניסיונית תלויים בתכנון ניסיוני. חשוב מאוד, מכולות אלה חייבות להיות גדולות מספיק כדי להטביע בנוחות את נושא הבדיקה.

2. השרשה של אלקטרודות

1. מניחים את הלובסטר על משטח פלסטיק שמתאים בקלות לתוך הזירה הניסיונית, כך שהגוף בנוחות יוצר צורת Y בקצה אחד של המלבן.
2. מאבטח בזהירות את הטפרים והבטן של הלובסטר לתוך השבכה הפלסטית באמצעות עניבות בכבלים קטנים. הכבלים צריכים להיות צמודים מספיק כדי למנוע תנועה, אבל לאפשר מקום למספריים כירורגיים להסיר אותם עם סיום הניסוי.
3. יבש את שריון עם מגבת נייר ולנקות אותו עם כדור צמר גפן ספוג ב 70% אתנול.
4. . צור את החורים של האלקטרודות
   1. באמצעות קצת מקדחה קטנה (למשל, 1.6 מ"מ), לאט ובזהירות מקדחה ביד שני חורים קטנים (כמעט) דרך הקראפאס משני צדי קרום הלב.
   2. לסיים כל חור על ידי החדרת בעדינות מחט מבתר סטרילי.
   3. אם המחט לא בקלות לעבור את carapace, להמשיך לאט לקדוח ביד לפני מנסה את המחט שוב.
      הערה: כדי למזער את המתח בבעלי חיים ניסיוניים, מומלץ מאוד לתרגל טכניקה זו לפני הניסויים. במשך הזמן, משתמשים יכולים בקלות לקבוע על ידי תחושה כאשר סיבית התרגיל כמעט למרות שריון ולעבור את המחט. קידוח יד מתאים ללובסטרים וסרטנים, במיוחד אם השלד החיצוני רך (כלומר, בעל חיים לאחרונה מולח). עם זאת, אם לנבדק יש שלד חיצוני עבה יותר או קליפה (כלומר, שסתום), כלי Dremel מתאים יותר.
5. השג את האלקטרודות (36 – 38 חוט מגנטי G, 0.10 – 0.12 מ"מ קוטר) ולגרד קצת בידוד בטיפ של חוט באמצעות להב סכין מבתר. לכופף בזהירות את הקצה של כל חוט לתוך וו קטן באמצעות מלקחיים ולהכניס אחד לתוך כל החורים החדשים קדח.
6. אבטח כל חוט עופרת באמצעות טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילי ולאפשר לו להתייבש במשך 5 – 10 דקות.
   הערה: חשוב להשתמש בדבק בחסכנות, כאשר הוספת יותר מדי תאפשר לבודד את החוט ולמנוע את ההקלטה של האות.
7. לאחר ההדבקה יבש, לחבר את החוט מוביל את העכבה ממיר ולהפעיל אותו. מניחים את הלובסטר בחדר הסתגלות ומאפשרים לו להגיע לאלקטרודות המושתלת במשך 15 – 20 דקות.
   הערה: תנועות מהירות או מיופחות, כמו גם דבק מיובש לחלוטין, עלול לגרום האלקטרודות להיות מנותקת carapace. , אם זה יקרה. חזור לשלב 2.6
8. הפעל את לוגר הנתונים ופתח את תוכנת LabChart במחשב. לחץ על ניסוי חדש והשאר את מסך תצוגת התרשים פתוח.
9. בתצוגת תרשים, אתר את תפריט הפונקציה channel עבור ערוץ 1 מהחלק הימני של המסך. בחר מגבר קלט מהתפריט ובחר באפשרות מצמד AC. האות הנכנס מנושא הבדיקה יופיע כעת במסך בזמן אמת.
   הערה: ניתן לכוונן את רגישות הערוץ על-ידי בחירת התפריט הנפתח Range . התאימו את הטווח עד שפסגות האות יהיו בגודל 25%-75% מההיקף המלא. סגור את מגבר הקלט על-ידי לחיצה על אישור.
10. על ממיר עכבה, להתאים את הרווח (גודל) ואיזון עד סימן חזק הוא נצפתה על פלט לוגר נתונים, במטרה לשמור על האיזון קרוב לאפס.
11. בערוץ 2, בחר pod T-Type כדי להקליט נתוני טמפרטורה בזמן אמת.
12. כאשר שני הערוצים מוגדרים כראוי, לחץ על לחצן התחל ולוגר הנתונים יתחיל ברישום נתונים.

3. הפינג טמפרטורה

1. לאחר תקופת הסתגלות, הניחו את השבכה הפלסטית עם הלובסטר המצורף בזהירות לתוך הזירה הניסיונית וקבעו את סליל החלפת החום על גבי השבכה.
2. מניחים את הבדיקה התרמותרמיים ליד הלובסטר, ומבטיחים שהוא שקוע לגמרי לפני הצבת המכסה על הזירה הניסיונית כדי להפחית את הלחץ החזותי לנושא הבדיקה.
3. כוונן את היתרה כנדרש והוסף הערה על הפלט המציין כי המשפט החל.
4. הפלט יכול ויש לשמור מעת לעת במהלך הניסוי.
   1. לחץ על קובץ ובחר שמירה בתור תחילה שמור את הפלט למחשב.
   2. בעת שמירה במהלך הניסוי, לחץ על קובץ ובחר שמור.
      הערה: למרות שהתוכנה LabChart יכולה לשחזר קבצים במקרה של כיבוי תוכנית בשוגג (למשל, הפסקת חשמל), מומלץ לשמור קבצים פעילים כל 15 עד 20 דקות במהלך הניסוי כדי למנוע אובדן נתונים.
5. הגדל את טמפרטורת המים של הזירה הניסיונית בקצב של ~ 1.5 ° c כל 15 דקות כדי להשיג כבש מ 12 ° c עד 30 ° c מעל תקופה של 2.5 h על ידי התאמת הטמפרטורה של אמבט מים מחדש.
   הערה: ההתפלגות הגיאוגרפית של הלובסטר האמריקאי משתרעת על פני מעבר תרמי של 25 ° c, ואנשים יכולים למזג ולשרוד בטמפרטורות של עד 30 ° צ'¹⁶. ככזה, 30 ° צ' נבחר כגבול העליון עבור השיפוע הזה טמפרטורה, כפי שהוא מבטיח כי לובסטרים לחוות תרחיש מלחיץ שאינו מגיע למקסימום תרמית מקסימום¹³, אשר יכול להוביל לתמותה. שיעור ההתחממות הספציפית נבחר משום שהוא נמצא בטווח של שיעורי התחממות מיושם במחקרים באמצעות מינים אחרים^8,14 , כמו גם מחקר הקודם על הלובסטר האמריקאי^13,27. לפני יישום פרוטוקול זה, חשוב 1) לקבוע את מגוון הטמפרטורות המתאימות לניסוי נתון ו 2) לנהל את מכבש הטמפרטורה לפני הניסיון עם הזירה ניסיוני ריק, כמו זה יעזור לקבוע את התאמת הטמפרטורה הנדרשת של אמבט מים כדי להשיג את השיפוע הרצוי. זה עשוי גם להיות שונה בהתאם לנפח המים בזירה.
6. בכל שיפוע הטמפרטורה, הקלט בכל פעם שניתן להשפיע על התאמה שעלולה להיות משפיעה על הפלט.
   1. שים לב כי האיזון על ממיר העכבה יהיה כנראה צריך להיות מותאם לאורך כל הניסוי, ועושה זאת עלולה לגרום לספייק בכוונה בפלט.
   2. כמו הטמפרטורה בזירה ניסיוני מתחיל להגיע לרמות מחוץ לטווח התרמי המועדף של נושא הבדיקה, התכווצויות שרירים לא רצוניות עלול לגרום "ספייק" מוטעה בפלט. אם הדבר מתרחש, בצע הערה כדי לזהות אזורים של הפלט שיש להסיר במהלך תהליך המרת הנתונים.
7. כשהשיפוע יושלם, הסר את הלובסטר מהזירה הניסיונית והוצא אותו לתוך אמבטיית שחזור (12 ° c) עבור ~ 20 דקות. אם תרצו, המשיכו לעקוב אחר קצב הלב של הלובסטר עד שהוא חוזר לרמות הבזליים.
8. לאחר 20 דקות, הכה בלחצן Stop בפלט powerlab ושמור את הקובץ. הסירו בזהירות את האלקטרודות וחתכו את קשרי הכבלים עם מספריים כירורגיים לפני החזרת מבחן הנבדק למיכל ההחזקה שלו.
   הערה: במקום להניח לובסטר ישירות לתוך אמבט ההתאוששות, אפשרות אחרת היא להחזיר לאט את הזירה הניסיונית לטמפרטורת ההתחלה שלו. זה מושגת על ידי קירור הזירה ניסיוני על ידי ~ 1.5 ° c כל 15 דקות על המסלול של 2.5 h נוספים.

4. המרת נתונים

1. פתח את לוח הנתונים. הגדר עמודה A לזמן על-ידי לחיצה כפולה על עמודה a ולחיצה על בחירה & הצבע הפעיל בצד השמאלי של תפריט לוח ההתקנה של עמודת הנתונים . בחרו ' זמן ' מצד ימין של התפריט וסגרו את החלון על-ידי לחיצה על ' אישור '.
2. הגדר את עמודה B לטמפרטורה הממוצעת על-ידי לחיצה כפולה על עמודה b ובחירה באפשרות סטטיסטיקה מהצד השמאלי של תפריט ההתקנה של עמודת לוח הנתונים . בחר ממוצע מהצד הימני של התפריט ומערוץ 2 כמקור החישוב בתחתית החלון של התפריט. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון.
3. המרת המתח המוקלט לפעימות לדקה
   1. לחץ פעמיים על עמודה C ובחר בחירה & נקודת פעילות בצד שמאל של התפריט. בחרו ' משך בחירה ' מהצד הימני של התפריט ולחצו על ' אשר ' לסגירת החלון.
   2. לחצו פעמיים על העמודה D ובחרו ' מדידות מחזורית ' בצד שמאל של התפריט. בחר ' ספירת אירועים ' מהצד הימני של התפריט וערוץ 1 כמקור החישוב. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון. פעולה זו תספור את הפסגות של הנתונים כדי לקבוע את קצב פעימות הלב על-פני חלק נבחר של נתונים.
      הערה: במידת הצורך, בחר בלחצן אפשרויות מהחלק התחתון של התפריט והתאם את הגדרות הזיהוי לקריאה מדויקת יותר של הנתונים. סרוק את קובץ הנתונים ובדוק אם אפשרויות הצורה "סינוס" או "Spikey" נובעות מספירות של הפסגות הראשיות בלבד של פלט הפעימה. בנוסף, כוונן את סף התאמת הזיהוי בצד הימני של התפריט כדי להתעלם מהרעש בקובץ הפלט.
   3. לחצו פעמיים על העמודה E ובחרו ' מדידות מחזורית ' בצד שמאל של התפריט. בחר קצב מחזורי ממוצע וערוץ 1 כמקור החישוב. כוונן את הגדרות הזיהוי והתאמת הזיהוי כדי להתאים את ההגדרות עבור עמודה D (אם מניפולציות בשלב 4.4.2). לחץ על אישור כדי לסגור את החלון. זה מספק את האומדן הסופי של קצב הלב (כפעימות לדקה) על חלק נבחר של נתונים.
4. כאשר העמודות מוגדרות, חזור לקובץ הנתונים וסמן את החלקים הרצויים של הפלט, תוך השמטת אזורים של נתונים שגויים כפי שזוהו על-ידי הערות בסעיף 3.6.
   1. בחר פקודות ומספר הוספה ללוח נתונים.
   2. בחר זמן מתוך התפריט הנפתח ' חפש ' ומשוך נתונים כל 30 s על-ידי בדיקת כל התיבה והזנת "30" תחת תפריט Select .
   3. לחצו על אפשרות הבחירה הנוכחית מהתפריט ' שלב עד ' ולחצו על ' הוסף'.
5. חזור למסך של לוח הנתונים ובחר קובץ ושמור בשם כדי לשמור את הפלט כקובץ Excel.
   הערה: כאן, הדופק מדווח (בפעימות לדקה) כל 30 s בניגוד לכל דקה מבוסס על המחקר הקודם^8,27. פעולה זו גם מסייעת ללכוד באופן מדויק יותר את השינויים בנתוני המתח שנאספו בזמן אמת. ניתן לבחור נתונים במרווחי זמן קצרים או ארוכים יותר המבוססים על העדפה אינדיבידואלית.

5. חישוב טמפרטורת שוברים ארניוס

1. פתח את קובץ הנתונים ב-Excel וטפל בפלט מהתוכנה LabChart.
   1. המר את הטמפרטורה מצלזיוס להופכי של קלווין באמצעות המשוואה הבאה: [1000/(טמפרטורה ° c + 273.15 K)].
   2. השג את היומן הטבעי של קצב הלב: בתוך (BPM).
2. צור התוויה arrhenius על ידי התוויית קצב הלב כפונקציה של טמפרטורה, המבוטא כמו ln (BPM) לעומת הדדית (K)^13,15.
3. ב-SigmaPlot, התאם את הנתונים באמצעות רגרסיה טיפין וקבע את נקודת ההצטלבות, שהיא ה-אבט.
   1. העתק והדבק את הנתונים שהפכו לחוברת עבודה חדשה. בחר את האפשרות סטטיסטיקה מתוך התפריט הראשי ואשף הרגרסיה מתוך הרשימה הנפתחת.
   2. בחלון המשוואה , בחר באפשרות ' חלקים ' מתפריט קטגוריית המשוואה ו- 2 מקטעים ליניאריים תחת התיבה שם משוואה . לחץ על הבא.
   3. בחלון המשתנים , בחר את נתוני הטמפרטורה שהפכו למשתנה t ואת נתוני קצב הלב שהפכו למשתנה y , תוך שימוש באפשרויות הנפתחות בתפריט ' עמודות משתנה '. ודא שנבחר תרשים XY בתפריט נתונים מהתפריט לפני הלחיצה על הבא.
   4. לאחר סקירת חלון תוצאות ההתאמה , לחץ על הבא ובדוק את התיבה עבור יצירת דוח בחלון אפשרויות פלט מספרי . לחץ על הבא.
   5. בחלון ' אפשרויות תרשים ', בדקו את האפשרות ' צור גרף חדש ' באזור ' גרף תוצאות התאמה ', והוסיפו משוואה לכותרת התרשים תחת המקטע ' תכונות גרף '. לחץ על סיום.
   6. בדף הפלט של התוצאות , אחזר את המשוואות ואת ערכי הפרמטרים עבור שני האזורים של הרגרסיה בטיפין, כמו גם את הפלט הסטטיסטי עבור הרגרסיה (למשל, R², F-סטטיסטיקת וערך p).
   7. באמצעות ערכי הפרמטרים והמשוואות שנוצרו, הגדר את שני המקטעים השווים זה לזה ופתור את המשתנה "t" כדי לקבוע את ה-אבט. המר ערך זה בחזרה לצלסיוס באמצעות המשוואה הבאה: ° צ' = (1000/t)-273.15.
      הערה: ניתן לחשב את ה-אבט גם בסביבת המחשוב הסטטיסטי R באמצעות החבילה "מקוטעת"¹⁷ בתוכנית SAS¹⁸, או באמצעות שגרת הרגרסיה הלינארית הסגורה ב-Prism8¹⁹.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב העכבה הפנאומטי כדי להשיג נתונים בזמן אמת עבור קצב הלב (במתח) ואת הטמפרטורה במהלך ניסוי מרדעת טמפרטורה. כאשר מנקבים טכניקה זו, משרעת המתח והטמפרטורות המוקלטות ישתנו בהתאם לתכנון הניסיוני ולמין המוקד. עם זאת, תפוקת המתח המוצגת בזמן אמת עוקבת אחר התפלגות סינוס כללית כאשר הפרוטוקול מיושם כהלכה (איור 1A). כאשר הטמפרטורה בזירה מוגברת, התפלגות הזמן האמיתי של שינויי מתח כדי לשקף תדירות מוגברת של פסגות מתח (כלומר, פעימות לב; איור 1B). ככל שטמפרטורת הזירה ממשיכה לעלות לרמות מחוץ לחלון הביצועים האופטימלי של הנבדק, השינויים בהפצה מתארים תדירות מופחתת של פסגות מתח בצורה של סינוס שנקטע על ידי פסגות מפוזרות ו/או רגעי "שטוח" (איור 1C).

לאחר שהנתונים הגולמיים מומרים באמצעות רכיב Pad Data של תוכנת LabChart, התפלגות התוצאה של קצב הלב (בפעימות לדקה) במהלך מכבש הטמפרטורה מלווה בהתפלגות פרבולית אם הניסוי מצליח (איור 2). כאשר הטמפרטורה בזירה מוגברת, קצב הלב של הנבדק מגדיל גם את הדרישות האנרגטיות הגבוהות הכרוכות בטמפרטורות חמות יותר. עם זאת, כאשר הטמפרטורה ממשיכה להגדיל את הנבדק מתחיל לחוות מתון כדי מתח תרמי קיצוני, קצב הלב מתחיל לרדת או הופך יציב כמו הנושא מתחיל להפגין סובלנות תרמית פסיבי (למשל, התפרצות של נשימה אנאירובית, שיעור מטבולית דיכוי, פעילות מופחתת^5,7). כאשר נתוני קצב הלב והטמפרטורה משתנים ומיוצר מזימה של Arrhenius, הנקודה שבה ניתן לחשב את קצב הלב (באיור 3). לאחר מכן, העלילה של ארניוס מתאימה לרגרסיה באמצעות התוכנה הסטטיסטית שבה הצטלבות שתי השורות מייצגת את ה-אבט.

איור 1: פלט נציג מתוך לוגר מידע LabChart. שינוי בזמן אמת במתח באמצעות האלקטרודות של הנבדק מוצג באדום, והפלט בזמן אמת המקביל של טמפרטורת הזירה (° c) מוצג בכחול. בתחילת הניסוי בטמפרטורות מגניבות (לדוגמה, 13.1 ° c), המתח אמור לעקוב אחר התפלגות כללית כמו סינוס (a). ככל שטמפ ' מוגברת (לדוגמה, 23 ° c), התדירות של פסגות המתח צריכה לגדול, אך ההתפלגות צריכה להישאר בדומה לסינוס (ב). לבסוף, כאשר הנבדק נדחף מחוץ לחלון הביצועים התרמי האופטימלי (לדוגמה, 28.5 ° c), פסגות המתח אמורות להיות בלתי יציבות כאשר התדר יורד (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: התפלגות צפויה של קצב הלב במסלול הטמפרטורה. נתוני מתח שנאסף על ידי לוגר הנתונים מומרים לקצב הלב בפעימות לדקה (BPM) באמצעות רכיב Pad של התוכנה. כאשר השיפוע מתנהל כראוי, התפלגות פרבולית של שיעור הלב על טווח הטמפרטורה נבדק מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דוגמה למזימה של ארניוס. לאחר שהנתונים הומרו בלוח הנתונים ויוצאו, הם משתנים כדי ליצור מזימה Arrhenius. בדוגמה זו, הנתונים מתאימים לרגרסיה לא-לינארית של טיפין-SigmaPlot, היוצרת משוואות עבור המקטעים השמאליים והימניים (אזור 1 ואזור 2, בהתאמה) של קו הרגרסיה, כמו גם מדדים טובים בהתאמה. הצטלבות שני קווי הרגרסיה נפתרת כ-ה-אבט (כוכב אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב העכבה הפנגרפיה כדי למדוד שינויים בקצב הלב של חסרי חוליות בשלב מאוחר במהלך ניסוי הרמפינג בטמפרטורה. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לגישות אחרות המבוססות על מעבדה^9,10,11 הוא שזה פולשני מינימלית ולא כרוך מניפולציה כירורגית משמעותי של שלד חיצוני, ובכך להקטין את כמות זמן ההחלמה הדרוש לפני ניסויים. יתר על כן, הציוד הוא קל לשימוש, והנתונים המתקבלים יכולים להיות פשוט מניפולציה ומפורש בתוכנית התוכנה המוצעת. בעוד הלובסטר האמריקאי משמש כאן כנושא המודל, טכניקה זו יושמה בהצלחה מולים כחולים (Mytilus spp.¹⁴) והוא יכול להיות שונה בקלות לשימוש אחרים חסרי חוליות בשלב מאוחר (כלומר, סרטנים, שרימפס, אחרים bivalves).

יתרון נוסף של הפרוטוקול הוא שהוא מתמקד בחישוב ה-אבט כחיווי לא קטלני של מגבלות תרמיות. למרות מחקרים רבים מציגים את ה-CT_max כמו נקודת הקצה המשמעותית בעת קביעת ביצועים פיזיולוגיים תרמית^{5,8,20,21,22,23}, אורגניזמים לעתים נדירות להיתקל בטמפרטורות בטווח זה בסביבה הטבעית⁵. יתר על כן, כמו CT_max היא לעתים קרובות טמפרטורה קטלנית, באמצעות מדד זה כמו נקודת הקצה המועדפת מונע את השימוש בנבדקים בניסויים נוספים או לעקוב אחר הבדיקה התרמית לאחר לחץ²³. כאשר מכוונים לחשב את ה-אבט באמצעות פרוטוקול זה, חשוב להגדיל את הטמפרטורה בזירה הניסיונית עד כדי דחיפת הנבדק למגבלה הפיזיולוגית שלה מבלי לגרימת מוות. לכן, מומלץ לקבוע את המגבלות התרמיות הפוטנציאליות של המינים באמצעות מחקר פיילוט (כאשר הדבר אפשרי) לפני קביעת הטווח המלא של מכבש הטמפרטורות הניסיוני.

מומלץ גם כי החוקרים לקבוע ולהתבונן וריאציות טבעיות בקצב הלב הבזליים של מינים מוקד כאשר הטמפרטורה בזירה הניסיונית מתוחזק ברמה קבועה ולא מלחיצה לפני הניסוי הרפינג. זה מועיל במיוחד עבור מינים מוקד שבו במנוחה מידע קצב הלב אינו זמין בספרות שפורסמה. כמו כן, הוא משמש לתרגול נרחב של טכניקות השרשה אלקטרודה. זה עשוי גם לעזור לחוקרים לקבוע את זמן הסתגלות המתאים הנדרש כדי להבטיח כי אין קוצים שווא בקצב הלב הם בשל טיפול בלחץ בתחילת ניסוי.

למרות שהפרוטוקול דן בשימוש בהקשרה הפנאומטי בהקשר של מתח תרמי בלבד, הוא יכול גם להיות מנוצל כדי לחקור את ההשפעות האינטראקטיביות האפשריות של מתחים אחרים על הפיזיולוגיה התרמית. ניתן לצמצם את ביצועי הארגון בנוכחות של מפגעים סביבתיים (כלומר, היפוקסיה, hypercapnia, מזהמים, ו/או שינויים במליחות), אשר עשוי גם לדחוס טווחי טמפרטורה אופטימלית עבור ביצועים^7,24,25,26. בתור שכזה, ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי לבחון כיצד חשיפה למספר שינויים לפני הטמפרטורה עלולה להשפיע על הביצועים.

לדוגמה, הרינגטון ו-המלין²⁷ חשף H. אמריקאנוס הנוער של האמריקאים הנוכחי או החזוי המאה הסופית מצבים pH (8.0 ו 7.6, בהתאמה) עבור 2 חודשים לפני הערכת ביצועים לב במהלך מכבש הטמפרטורה. לובסטרים חשופים מראש לסביבות חומצי יותר הציגו ירידה משמעותית ב-הממוצע בהשוואה לאלה שהוחזקו תחת תנאי pH הנוכחי. הדבר מצביע על כך שסביבת pH נמוכה מפחיתה את הביצועים התרמיים ועלולה להגביר את הסיכון לנזק תאי בשל מתח החום בטמפרטורות נמוכות יותר²⁷. מאמצים עתידיים יכולים להתרחב על השיטה המוצגת כאן כדי לכלול חשיפה מוקדמת לכל שילוב של שינויים סביבתיים לפני הליך זה. כמו-כן, ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי למדוד שינויים בביצועי הלב במהלך החשיפה לשעולים ביוטיים וכן כיצד מגבלות תרמיות יכולות להשתנות על פי הקימוט האונטלוגי^4,5.

הגבלה מרכזית של פרוטוקול זה היא כי הציוד כפי שמתואר מוגבל לשימוש בסביבה מעבדה, העלולה להגביל את תחולתו עבור ניסויים מבוססי שדה שדורשים ציוד מיוחד יותר⁸. טכניקה זו דורשת גם איפוק של נבדקים מבחן מאוד מאוד (למשל, לובסטרים וסרטנים) כדי להפחית את הייצור של נקודות מידע שווא כתוצאה מתנועות שרירים שאינם לב. למרות שהדבר עלול להגביל את ההתנהגויות הטבעיות במהלך מכבש הטמפרטורה, ההשפעה של ריסון עקבית בין כל נושאי הבדיקה. החשוב ביותר, יש פוטנציאל לנזק רקמות או מוות במקצועות הבדיקה אם הקידוח אגרסיבי או רשלני במהלך השתלת האלקטרודה מיושמת. זה ניגודים בחדות עם פוטוגרפיה אינפרא אדום, טכניקה לא פולשנית באמת כי מנצל מתמר אינפרא אדום חיצוני כדי לעבור את האור באמצעות קרום הלב ולהקליט פונקציה לב על ידי המרת אנרגיה אור משתקף מתח^8,28.

למרות פוטוגרפיה אינפרא אדום מפחית את הסיכון לטיפול בלחץ לעומת העכבה הפנאומטי, כראוי השתילה אלקטרודות באמצעות שיטה מתוארת תוצאות טראומה מינימלית, מאפשר זמן הסתגלות מהירה, מוביל התאוששות מהירה מבלי לגרימת תמותה במקצועות הבדיקה בעקבות הניסוי הרפינג²⁷. כפי שאין הבדל משמעותי בתפוקת הלב שנרשם על ידי שתי שיטות²⁸, זה הגיע למסקנה כי העכבה הפנאומטי היא טכניקה מהימנה ומינימלית פולשנית להערכת ביצועים לב. לבסוף, היתרונות והגמישות הרבים של הפרוטוקול הם בעלי פוטנציאל להבהיר כיצד גורמים סביבתיים שונים מתקשרים עם טמפרטורה לפגיעה בביצועים פיזיולוגיים בשלב מאוחר של סרטנים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm (1/16 in) drill bit	Milwaukee Tool at Home Depot	1001294900	This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores.
38 AWG Copper Magnet Wire	TEMCo	MW0093	This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes.
Cyanoacrylate glue	Loctite	852882	This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace.
Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade	Fisher BioReagents	BP82931GAL	This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation.
Excel	Microsoft	N/A	This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems.
Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit	Fisher Scientific	08-855	This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol.
Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz	Fisher Scientific	13-874-180	This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use.
Fisherbrand Sterile Cotton Balls	Fisher Scientific	22-456-885	These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation.
Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK	Grainger	5WHE6	Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors.
Impedance converter	UFI	Model 2991	Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three.
LabChart software	ADInstruments	N/A	Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes.
LED Soldering Iron	Grainger	28EA35	This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes.
PowerLab datalogger	ADInstruments	ML826	There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel.
Prism8	GraphPad	N/A	This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems.
R	R Project	N/A	This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website.
Rosin Core Solder	Grainger	331856	This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes).
SAS	SAS Institute	N/A	This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems.
SigmaPlot	Systat Software, Inc.	N/A	This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers.
T-type Pod	ADInstruments	ML312	Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples.
T-type Thermocouple Probe	ADInstruments	MLT1401	Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m.
UV Cable Tie, Black	Home Depot	295813	This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store.