Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הדמיה תלת מימדית של כלי הדם והניקוז הלימפטיים החולייתיים באמצעות iDISCO+ ומיקרוסקופית פלואורסצנטית גיליון אור

Published: May 22, 2020 doi: 10.3791/61099
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Université Pierre et Marie Curie Paris, Sorbonne Université, Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière, 2Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Department of Neurology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול מוצג שילוב של ניקוי רקמות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM) כדי לקבל תמונות רזולוציה תלת מימדית ותאי של כלי הלימפה ובלוטות הלימפה (LNs) איסוף נוזל המוח השדרה (CSF) ונוזל אפידורל השדרה.

Abstract

מערכת הלימפה הקשורה למערכת העצבים המרכזית (CNS) כוללת את כלי הדם הלימפה המסתובב סביב המוח, חוט השדרה, ו- LNs המשויך שלה. מערכת הלימפה הקשורים CNS מעורב ניקוז של CSF מקרומולקולות ותאי מערכת החיסון meningeal כלפי CNS ניקוז LNs, ובכך ויסות פינוי פסולת ומעקב חיסוני בתוך רקמות CNS. מוצגת גישה חדשנית כדי לקבל תמונות תלת מימדיות (3D) ורזולוציה תאית של לימפה הקשורים CNS תוך שמירה על שלמות המעגלים שלהם בתוך הרקמות שמסביב. iDISCO+ פרוטוקול משמש immunolabel כלי לימפה במערך ופינה כל ההכנות הר של עמודה החוליות כי הם לאחר מכן תמונה עם מיקרוסקופית פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM). הטכניקה חושפת את המבנה תלת-מיואש של רשת הלימפה המחברת את חללי קרום המוח והאפידורל סביב חוט השדרה לכלי לימפה מחוץ לחלית חוליות. מסופקים תמונות תלת-מיוד של מעגלי הניקוז של מעקבים מולקולריים שהוזרקו בעבר לתוך CSF דרך מגנה בור המים או parenchyma עמוד השדרה thoracolumbar. הגישה iDISCO+/ LSFM מביא הזדמנויות חסרות תקדים לחקור את המבנה והתפקוד של מערכת הלימפה הקשורים CNS בביולוגיה נוירווסקולרית, נוירואימונולוגיה, סרטן המוח וחלייתנים, או עצם החוליות וביולוגיה משותפת.

Introduction

CNS מוקף CSF שכבות כיסוי של קרום המוח, רקמת אפידורל, ועצמות. בסך הכל, CSF מספק הגנה פיזית למוח הרך וחוט השדרה. הוא הופרש בעיקר על ידי הממחורוד וקרום קרום קרום מדומה (כלומר, פיא מאטר, הארכנואיד, וdura mater). קומפלקס CSF-meningeal גם מבסס ממשק פונקציונלי בין רקמות CNS ושאר הגוף, ובכך תורם להומוסטאזיס CNS. ראשית, CSF חודר parenchyma CNS דרך חללים פרה עורקים CNS ומקיים אינטראקציהדינמית עם נוזל interstitial (ISF) 1 באמצעות מערכת גלימפטית (גליה לימפה), אשר מורכב חללים paravascular ואת ממברנות הרגליים הקצה אסטרוציט סביב כלי CNS2,,3,,4. פסולת מטבולית ונוזל עודף מנוקים בסופו של דבר על ידי ניקוז פריוואסקולרי תוך-מזוראלי ישירות מהפארנצ'ימה במוח לכיווןמחזור הדם המערכתי 3, כמו גם את החללים הפרארידיים לכיוון CSF ובדרך כלי לימפה מרוקן מוח, על פי מודל גלימפטי2,4. זרימת CSF היא בעיקר דרך מערכת הלימפה, דרך לוח cribriform וכלי לימפה חוץ-גולגולתייםקשורים 5,6,7 , כמוגםעל ידי כלי הלימפה קרום המוח, אשר להתכנס ב LNs ניקוז המוח 8 ,9,10,,1011,12 ( איור1). חשוב, אם כי משני, תפקיד בזרם CSF נלקח על ידי villi ארכנואיד גולגולתי, אשר לחדור lacuna של סינוסים ורידי קרוםמנום 13.

מעגלי ניקוז CFS נחקרו בהרחבה באמצעות גישות ניסיוניות המבוססות על הזרקת מעקבים צבעוניים/פלורסנט לתוך CNS או CSF, ואחריו ההדמיה של דפוס המעקב בתוך CNS וברחבי איברי הגוף ורקמות בנקודות זמן שונות לאחרהזרקה 13. במשך זמן רב, הזרימה של CSF נחשב באופן בלעדי וישיר נלקח בתשלום על ידי זרימת הדם, דרך villi ארכנואיד הקרנה לתוך סינוסים ורידי דוראל13. עם זאת, הזרימה CSF מבוצעת בעיקר על ידי כלי הדם הלימפה, כפי שהוצג לאחרונה על ידי כמעט אינפרא אדום (NIR) הדמיה דינמית של CSF מוזרק מעקב תחבורה בעכברים9,10. כלי הלימפה מנקזים CSF ואז להחזיר את הלימפה למחזור הדם דרך וווין subclavian הנכון. approches משלימים זיהוהן מחוץcranial 6, 7,,13 ו תוך גולגולתי 9,10,11,12 יציאות לימפה של מעקבים מוזרקים CSF ולהציע כי CSF נספג על ידי שני מסלולים לימפה, אחד חיצוני והשני פנימי לגולגולת ועמוד חוליות.7 החלק העיקרי של ניקוז CSF מתרחש במהירות דרך כלי לימפה הממוקמים rostrally, מחוץ לגולגולת רירית האף, דרך ערוצים של צלחת cribriform של עצם אתמואיד3,6,13, ו, caudally, מחוץ עצמות חוליות lumbosacral דרך נתיבים דורסולטיים שעדיין לא מאופייניםבאופן מלא 7,14. בנוסף, קרום המוח של הגולגולת, נימים לימפה של דורה מאטר ישיר לספוג CSF ותאי מנינג איל חיסוני כלפי אספנים לימפה דוראלית לחצות את עצמות הגולגולת ולהתחבר CNS ניקוז LNs12,14. כלי לימפה קרום המוח אלה לשחק תפקידים חשובים פתופיזיולוגיה CNS, כי המוח קרום המוח לימפה משתנים עם הזדקנות וגם להשפיע על התוצאה של מחלות מוח נוירולוגיות, כולל ניוון עצבי, דלקת עצבית, סרטן המוח15,16,17. לכן, כלי הדם הלימפה הקשורים CNS (כלומר, כלי הלימפה דוראליים והיקפיים מנקז CSF) עשוי להיות יעד חדשני מבטיח להילחם במחלות CNS בבני אדם.

מחקרים מתכנסים שבוצעו עם אימונוהיסטולוגיה והדמיית תהודה מגנטית ברזולוציה גבוהה הראו כי כלי הדם הלימפה קרום קרום לב קיים גם פרימטים, כולל קופי מרמוסטנפוצים ובני אדם 7,11,13. יתר על כן, כלי לימפה מנינגאליים אינם מוגבלים לגולגולת, אבל להרחיב בתוך עמוד החוליות אל פני השטח של גנגליה עמוד השדרה ו רמי13,18. הדמיה תלת מימדית (תלת מימדית) של עמוד החוליות הלימפה משמרת את האנטומיה הכוללת של דגימות חוליות ועמוד שדרה מסומנות, כולל עצמות מעל, שרירים, רצועות, כמו גם רקמות קרביים שכנות, בוצע לאחרונה14. iDISCO+ פרוטוקול 19,20 שימש immunolabel decalcified ופינה את ההכנות של כל עמוד החוליות עם נוגדנים ספציפיים לימפה נגד קולטן ממברנה LYVE121 או גורם שעתוק PROX122. רכישת תמונה וניתוח בוצעו לאחר מכן עם מיקרוסקופית פלואורסכיה גיליון אור (LSFM) ותווך Imaris. LSFM מאפשר הדמיה תלת-ממדית מהירה ופולשנית מינימלית של דגימות גדולות על ידי כליאה סיסית של תאורה, מה שתוצאתו פוטו-בליחות מופחתתופוטוטו-אקסציטיות 23.

הגישה iDISCO+/ LSFM מאפשרת אפיון של השכבות הברורות של כלי לימפה דוראליים ואפידורליים, ואת החיבור של כלי דם זה למעגלים הלימפה מחוץ לחת החוליות וLNs השכן עמודה החוליות. הפרוטוקול הוחל על רקמות שהוזרקו בעבר עם מעקבי פלורסנט כדי להדגים ניקוז תעלת חוליות. המאמר הנוכחי מספק פרטים על iDISCO+/LSFM מתודולוגיית כדי למצוא את כלי הדם הלימפה החוליות וממחיש את הרלוונטיות שלה CSF וחדריקת ניקוז נוזל אפידורל.

Protocol

כל הליכי vivo המשמשים במחקר זה צייתו לכל התקנות האתיות הרלוונטיות לניסויים ומחקר בבעלי חיים, בהתאם לקהילה האירופית להנחיות ניסיוניות לשימוש בבעלי חיים (L358-86/609EEC). המחקר קיבל אישור אתי על ידי הוועדה האתית של INSERM (n°2016110111126651) והוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).

1. הכנה

  1. הכינו את כלי הניתוח הבאים לניתוח: אזמל (1), מיקרו-פורס (2), מכריחים (1), מספריים ואספי תפר של מישל. הכן מחטי 26 G (0.45 מ"מ x 13 מ"מ), מזרק 1 מ"ל, ו 10 μL microsyringe.
  2. משוך מיקרו-ערי בתנור עם פרוטוקול חד-שלבי ב-67.5°C עם ממשוך מיקרופיפט מזכוכית. הכן שני מיקרו-כינים לכל זריקה.
  3. להכין את הניקוז הלימפה הדמיה(שולחן 1):אובלבמין אלקסה פלור 555 להציות (OVA-A555, 2 מ"ג /מ"ל ב 1x פוספט אגירה תמיסת מלח [PBS]) ונוגדן אנטי LYVE1 (1 מ"ג/ מ"ל ב 1x PBS).
  4. הכנת נוגדנים (טבלה 1) עבור iDISCO+. לנוגדנים עיקריים, השתמשו בנוגדן פוליקלונלי נגד ארנב LYVE1 (1:1,600) ונוגדן IgG פוליקלונלי אנטי-פרוקס1 (1:2,000). לנוגדנים משניים, השתמשו ב-Alexa Fluor donkey anti-rabbit-568, בנקי נגד ארנב-647 ונגד עז-647 חמורים (1:2,000).

2. ניתוחים לזריקות פנים-בורנה מגנה (ICM) ותור קולומבר (ThLb)

  1. הכנת החיה לניתוח
    1. השתמש בעכברים זכר ונקבה בוגרים C57BL6/J, בני 8-12 שבועות.
    2. להזריק את העכבר intraperitoneally (IP) עם 0.015 מ"ג / מ"ל buprenorphine פתרון מדולל 0.9% נתרן כלוריד ב 0.1 מ"ג/ק"ג, 15 דקות לפני הניתוח.
    3. להניא את העכבר בתיבת אינדוקציה עם 2-3% גז isoflurane.
  2. הכנת בעלי חיים מנומסים להזרקת מעקב
    1. מניחים את העכבר המהדמה ואת משטח החימום שלו על המערכת הסטריאו-קסית. השתמש בלסתי אוזניים כדי להחזיק את ראשו של העכבר, ולהניח את הגוף בזווית של כ-135° לראש או לשתק את חוט השדרה ברמת החוליות ThLb (Th12-L1) עם מתאם עמוד השדרה. צבוט את הזנב או את כף הרגל עם המדף כדי לבדוק את היעילות של הרדמה.
    2. להזריק IP 200 μL של 0.9% נתרן כלורי ללחות העכבר.
    3. באמצעות להב אזמל, לעשות חתך בעור, או באזור העורף לכיוון אזור צוואר הרחם עבור הזרקת ICM, או ברמת החוליות ThLb (Th10-L3) להזרקה לתוך parenchyma עמוד השדרה ThLb.
  3. הזרקת מעקב
    1. השליכו את שרירי הפארצ'רביסל והפראש-שדרתיים המכסים את הצוואר ואת הטור כדי לדמיין את פני השטח של ה-dura mater, השכבה החיצונית ביותר של קרום קרום הלב.
    2. דייקנו בזהירות את האזור המרכזי של ה-dura mater והתחתית עם מחט 26 G.
    3. השתלת מיקרו-כיליון
      1. לחתוך 2 מ"מ של קצה נימות זכוכית (ראה שלב 1.2), ולאחר מכן להשתמש במיקרו-כיון המחובר לתנולה המקושרת למזרק 10 μL כדי לשאוף 2-8 μL של נוגדן OVA-A555 או LYVE1.
      2. הציגו את המיקרו-כיף באזור המדל של ה-dura mater בזווית של 30° עבור זריקות ICM או זווית של 10° לזריקות עמוד השדרה של ThLb, ודחפו אותו ל-1.5 מ"מ מתחת ל-dura mater.
        הערה: הרצועה מנוקבה, אך לא מתבצעת כריתת למינקט.
      3. להוסיף 10 μL של דבק כירורגי כדי לסגור את החתך סביב נמת הזכוכית ולחכות לו להתייבש.
    4. לאט להזריק מעקב פלורסנט ב 1 μL / דקה. לאחר שנפח ההזרקה נמסר, לשמור על נים במקום במשך 1 דקות. משוך את המיקרו-כיליון והוסף דבק כירורגי כדי לסגור את חור ההזרקה.
  4. לאחר ההתדברות, סגור את החתך בעור עם מהדקי תפר. הסר את העכבר מהמערכת הסטריאו-קיים והמקם אותו בתא חימום לאחר ניתוח ב-37°C עד שהוא מתאושש.

3. תפליטה ופירוק רקמות

  1. ב 15 דקות או 45 דקות לאחר הזרקת מעקב CSF, להזריק IP מינון קטלני (100 μL) של נתרן פנטוברביטל. צבוט את הזנב או את כף הרגל כדי לוודא שאין רפלקס.
  2. עם מספריים, לחתוך את העור ולפתוח את שכבת צוק מאזור הבטן התחתונה לכיוון כלוב בית החזה. פתח את כלוב בית החזה עם מספריים כדי שתהיה לו גישה ללב.
  3. הכנס את מחט 26 G בחדר השמאלי של הלב ולהתחיל להסתפר עם 20 מ"ל של קר כקרח 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS ב 2 מ"ל / דקה. השתמש במספריים כדי לחתוך במהירות את האטריום הימני ולשחרר את זרם נוזל ההזבות.
  4. הסר לחלוטין את העור עם מפסים וחתכו את ארבע הרגליים במספריים. הסר את כל האיברים הפנימיים אך היזהרו לשמור על מספר ה-LNs ללא פגע.
    הערה: LNs הבלוטות התותיות הם שטחיים, לכן הקדו לא להסיר אותם בעת חיתוך העור. LNs צוואר הרחם עמוק (dcLNs) ממוקמים בכל צד של קנה הנשימה, במגע עם פני השטח הצדדי של ורידים וריד הצוואר הפנימי וקרוב לשרירי סטריאומסטואיד.
  5. חותכים את הצלעות כדי להסיר את עמוד החוליות עם חוט השדרה בפנים מצרע הרחם למקטעים המותניים.
  6. לטבול את הרקמות החתושות בקרח קר 4% PFA ב 1x PBS בצינור 50 מ"ל לילה (~ 18 h) ב 4 ° C. לשטוף את הרקמות הקבועות 3x ב 50 מ"ל של PBS 1x במשך 5 דקות.

4. מאקרוסקופיה פלואורסצטית של קטע חוליות

  1. מקם את הדגימה מתחת למיקרוסקופ סטריאוזום פלואורסציטי עם מצלמה(טבלת חומרים). קח מבט כולל על המדגם או הגדלה של אזור מסוים.

5. הכנה לדוגמה לכל הר אימונוסטיין

  1. באמצעות להב מיקרוטומי, לחתוך באופן רוחבי את עמוד הראש והבעל חוליות ברמות העורף וצוואר הרחם.
    הערה: פעולה זו מאפשרת בידוד של הראש ואת אזור החוליות צוואר הרחם משאר עמוד החוליות.
  2. עם להב מיקרוטומי, חתוך את אזורי צוואר הרחם, בית החזה ועצם העצם של עמודת החוליות באופן טרנס-רוחבי למקטעים של חוליות 2-4, בערך 0.5 ס"מ כל אחד.
  3. בודדו כל מקטע בסדר שבו הופרדו מהציר החוליות, לאורך כל אזורי צוואר הרחם ועצם החזה של עמודת החוליות. לשמר כל דגימה בצינור של 2 מ"ל 1x PBS.

6. iDISCO+ כל הר אימונוסטיין של קטע חוליות

הערה: התיאור המפורט של פרוטוקול iDISCO+ נגיש http://www.idisco.info.

  1. יום 1: התייבשות רקמות
    1. דגימות רקמת חוליות מיבשות (כלומר, קטע חוליות) על ידי טבילה רצופה ב 20%, 40%, 60%, 80%, ו 100% מתנול ב 1x PBS עבור 1 שעה עם תסיסה.
    2. דגירה הדגימות בן לילה בתמיסה של 33% מתנול / 66% דיכלורומטאן (DCM) בטמפרטורת החדר (RT) עם עצבנות.
  2. יום 2: הלבנת רקמות
    1. לשטוף דגימות 2x עם 100% מתנול עבור 1 שעה ב RT. דגירה הדגימות ב 5% H2O2 ב מתנול (30% H2O2 ומתנול 1:5 v / v) ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
  3. יום 3: צעד ההתפלה והיציבות
    1. להתייבש הדגימות בהדרגה ב 80%, 60%, 40%, 20% מתנול, אז ב 1x PBS (1 h בכל פתרון) ב RT עם תסיסה.
    2. להקטין את החוליות על ידי דגירה דגימות בתמיסה של מורס (10% טריסודיום ציטראט ו 45% חומצה תכלית 1:1 v/v) במשך 30 דקות ב RT כדי לשמר את מבנה העצם.
    3. יש לשטוף את הדגימות פי 2 עם PBS אחד ודגירה פי 2 למשך שעה אחת בפתרון PTx2 (0.2% Triton X-100 ב-PBS אחד, לחדש את הדגירה השנייה) ב- RT עם תסיסה. לאחר מכן דגירה דגימות pretreated בתמיסת permeabilization (PTx2 עם 20% דימתיל sulfoxide [DMSO] ו 2.3% w / v גלצין) ב 37 ° C עבור 24 שעות.
  4. יום 4: שלב חסימה
    1. דגירה דגימות בתמיסת חסימה (PTx2 עם סרום חמור 6% ו 10% DMSO) ב 37 °C עבור 24 שעות.
  5. ימים 5-16: כל הר אימונולה
    1. דגימות דגירה בגוף ראשוני מדולל PTwH (1x PBS המכיל 0.2% Tween-20 ו 0.1% הפרין ב 10 מ"ג / מ"ל ב 1x PBS) עם 5% DMSO/ 3% סרום חמור ב 37 ° C במשך 6 ימים. לשטוף דגימות 4-5x ב PTwH ב RT עם עצבנות בן לילה.
    2. דגימות דגירה בדילול נוגדנים משני ב PTwH עם 3% סרום חמור ב 37 ° C במשך 4 ימים. לשטוף דגימות PTwH 4-5x ב RT תחת תסיסה לילה לפני ניקוי.
  6. ימים 17 ו-18: iDISCO+ ניקוי רקמות
    1. דגימות התייבשות בהדרגה על ידי טבילה רצופה ב- PBS 1x, לאחר מכן 20%, 40%, 60%, 80%, ו 2x ב 100% מתנול (1 שעה בכל פתרון). דגירה כל מדגם בן לילה בתמיסה של 33% מתנול/66% DCM.
    2. לשטוף 2x ב 100% DCM במשך 15 דקות כדי להסיר את מתנול. דגירה באתר dibenzyl (DBE) מבלי לרעוד עד פינה (4 שעות) ולאחר מכן לאחסן DBE ב RT לפני הדמיה.

7. הדמיית LSFM

  1. התמונה פינה דגימות במטוס טרנסוורסל עם LSFM מצויד 4x/0.3 יעד.
    1. השתמש בתצורת תאורה חד-צדדית של שלושה גיליונות, מיקום x קבוע (ללא מיקוד דינמי). השתמש בלייזרי LED מכוונים ל- 561 ואט,000 ואט; ו-639 00 00:00:00,000 --&10, 70 00:00 הגדר את הצמצם המספרי של גיליון האור ל- 30%.
    2. השתמש במסנני פליטה שונים: 595/40 עבור Alexa Fluor-568 או -555, ו--680/30 עבור Alexa Fluor-647.
  2. מלא את תא המיקרוסקופ ב-DBE.
  3. אקווייר ערימות עם 2.5 μm z צעדים ו 30 ms זמן חשיפה לכל שלב עם המצלמה(טבלת חומרים). השתמש בזום אופטי x2 להגדלה יעילה של (x8), 0.8 μm/pixel, ולבצע את רכישות הפסיפס עם חפיפה של 10% על המסגרת המלאה.
  4. לרכוש תמונות בתבנית .tif עם תוכנת רכישה ולהמיר אותם לתבנית 3D עם תוכנת המרת קובץ.
  5. לשחזר פסיפסים רכישת עם תוכנת תפירה (טבלת חומרים). פתח את התמונות והועברו ידנית כדי לשחזר את תמונת הפסיפס כולה, תוך שימוש ב- 10% חפיפה בין תמונות כקווים מנחים.
  6. השתמשו בתוכנה תלת-מית-ייחודית(טבלתחומרים) כדי ליצור תחזיות אורתוגונליות של נתונים, כפי שמזוצג באות 1, איור 2, איור 3 ואיור 4 , ולהוסיףתכונת קוד צבע לכלי הלימפה ולבני האנטומיה האחרים המוצגים. הגדר תיקון גמא של 1.47 לנתונים הגולמיים שהתקבלו מ- LSFM בהתאם להוראות היצרן.

Representative Results

הדמיה תלת-ממדית של כלי הדם החולייתיים
איור 1 מציג את השלבים של iDISCO+/LSFM ותדמית LSFM של מעגלים לימפה בתוך תעלת החוליות של iDISCO+מטופל חוליות ThLb. השילוב של iDISCO+ עם LSFM שמר על האנטומיה החולייתית ותפס תצוגה של רשת כלי הדם הלימפה (כלומר, כלי תוך חוליות המחוברים עם כלי החוליות היוצאים גב ורוחב מהגוף החוליות) בתוך העצמות שמסביב, רצועות, שרירים, וגנגליה עצבית.

הדמיית מאקרו פלואורסץ של ניקוז dcLN
על מנת לתזמן ניקוז מקרומולקולה במערכת הלימפה הקשורה CNS, מעקבים מקרומולקולריים היו מנהלים vivo על ידי הזרקה לתוך CSF או parenchyma עמוד השדרה. ניתן להעביר בקלות מעקב מקרומולקולרי ל-CSF ב-cisterna magna. הבור מגנה ממוקם בין המוח הקטן ואת פני השטח הגב של מדולה oblongata, מעל מגנום foramen. מעקב מקרומולקולרי יכול גם להיות מוזרק לתוך parenchyma בעמוד השדרה על ידי ניתוח סטריאוטיפי ברמות שונות לאורך עמוד החוליות.

המעקבים מקרומולקולריים בשימוש סומנו ישירות עם פלואורופור או זוהו לאחר המוות על ידי אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים ספציפיים. איור 2A ממחיש את התוכנית הניסיונית למעקב אחר OVA-A555, פלורסנט אדום ומעקב משקל מולקולרי קטן (כ- 45 kDa), שהוזרק לתוך CSF(איור 2B)או לאזור ThLb של חוט השדרה (איור 2C).

ב 45 דקות לאחר הזרקת מעקב מקרומולקולרי, העכברים הוקרבו, חדור עם 4% PFA, ומעובד כדי לבודד קטעים חתכים של אזור גזע המוח של הראש ואת עמוד החוליות שהיו מדבקים והובהרו. ניקוז מקרומולקולה הוערך לאחר מכן בקלות על ידי הדמיית מאקרוסקופיה פלואורסצנטית של LNs לאסוף CSF ונוזלי אפידורל. כפי המוצג בדמות 2, הזרקת OVA-A555 לתוך CSF (איור 2B) או ThLb (איור 2C) אזור של חוט השדרה הביא OVA-A555 הצטברות לתוך dcLNs ב 45 דקות לאחר ההזרקה. תצפית זו מצביעה על ספיגה וניקוז של מעקב פלורסנט על ידי מערכת הלימפה; זהו תנאי מוקדם לפני רודף iDISCO+ /LSFM הליך כדי למצוא את ניקוז לימפה החוליות.

הדמיה תלת-ממדית של ניקוז מקרומולקול במערכת הלימפה החולייתית
בהתבסס על זיהוי OVA-A555 תיוג ב- dcLNs, ההליך iDISCO+/LSFM יכול להיות מיושם על דגימות חוליות מדבקות וprecleared מבודד OVA-A555-מוזרק עכברים. גישה זו אפשרה יצירת מפה תלת-מית-מיו של ניקוז הלימפה של CSF ונוזל אפידורל בעמוד השדרה בנקודת זמן ספציפית לאחר הזרקת מעקב. מיפוי תלת-ממדי זה יכול להתבצע על-ידי הדמיית מקטעי CNS רצופים, בכל רמה של עמודת חוליות, מנקודת ההזרקה.

איור 3A מראה את העיצוב הניסיוני עבור OVA-A555 הזרקה לתוך parenchyma עמוד השדרה ThLb ואת דפוס 3D וכתוצאהמכך של OVA-A 555 הפצה במקטע צוואר הרחם קטע חוליות בית החזה, בשילוב עם כלי הדם הלימפה. ב 45 דקות לאחרהזרקת OVA-A 555, OVA-A555 הצטברות זוהתה ברקמות חוט השדרה וdcLNs (חצים לבנים איור 3B), בהסכמהעם תצפיות מיקרוסקופ מאויר איור 2. זה לא זוהה, עם זאת, בצוואר הרחם ובחזה כלי הדם הלימפה מתויג עם נוגדנים אנטי LYVE1. היעדרו של מעקב מוזרק CSF בכלי הלימפה החוליות עשוי להיות בשל זמן התמדה קצר של מעקב בתוך כלי לימפה או חוסר ספיגה של המעקב על ידי כלי הלימפה(איור 3C).

כדי לבדוק את ההשערה הראשונה, הנוגדן נגד LYVE1 ארנב שימש תג תא אנדותל לימפה לקשור כלי לימפה הקשורים CNS. הנוגדן נגד LYVE1 הארנב מוזרק זוהה לאחר מכן על ידי אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן משני אנטי ארנב, בעוד תאי אנדותל לימפה היו immunolabeled עם נוגדנים ANTI-PROX1. איור 4 מייצג את העיצוב הניסיוני של הזרקת אנטי-LYVE1 לתוך parenchyma עמוד השדרה ThLb (איור 4A), ואת דפוס ההפצה 3D וכתוצאה מכך של נוגדנים LYVE1 בקטע ThLb קרוב לאתר ההזרקה, ביחס PROX1+ לימפה (איור 4B). שני חוליות לימפה וקשרים לימפה מחוץ לחת החוליות שלהם סומנו על ידי נוגדנים אנטי-LYVE1 מוזרק, אשר התבססו על ספיגת מעקב על ידי כלי לימפה חולייתני וניקוז הלימפה לכיוון מערכת הלימפה מחוץ החוליות. ב- LNs חסר באזור ThLb, ולכן לא היתה דרך צפייה במקטע התמונה. יתר על כן, הדפוס באופן בלתי רציפות של סמן LYVE1 שנצפה לאורך כלי הלימפה כנראה שיקף את הביטוי באופן בלתי רציפתי של LYVE1 בכלי הדם הלימפה, כפי שדווח במחקריםקודמים 14,21. בסך הכל, התוצאות של המחקר הנוכחי הראו כי, ב 45 דקות לאחר הזרקת מעקב, LYVE1 נוגדן, אבל לא OVA-A555, אפשר זיהוי של ספיגת לימפה חולייתן מקומית והיה מועדף OVA-A555 כסמן מתמיד של ניקוז לימפה חולייתי מקומי.

Figure 1
איור 1: מבט תלת מימדי על כלי הדם החוליים. (א)ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. (ב)הקרנה כנרית של תצוגה תלת-מית-מית-ייחודית של כלי הדם החולייתיים של ה-ThLb מנקודת מבט דורזו-חזיתית. כלי הלימפה היו immunolabeled עם נוגדן ANTI-PROX1 (ירוק) באמצעות iDISCO+ פרוטוקול ולאחר מכן תמונה על ידי LSFM. שימו לב לדפוס המט-אמריקאי של כלי הדם בתוך תעלת החוליות של שלוש חוליות רצופות (ראשי חץ לבנים). בנוסף לכלי גב חצי-מעגליים (ראשי חץ לבנים), כל רשת חוליות כללה ענפים גנום (חצים צהובים), נתיבי יציאה דו-צדדיים לאורך עמוד השדרה רמי וגנגליה (חצים לבנים), כמו גם נתיב יציאה גב בקו האמצע (חץ כפול לבן). רשתות חוליות היו מחוברות עם כלי אורכי (חצים סגולים). לקבלת תיאור מלא, ראה יעקב L. ואח '18 SC = חוט השדרה; כוכבית = גוף חוליות גהוני; D = גב; L = רוחטי; V = גהות; קנה מידה ברים = 300 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 2
איור 2: dcLNs אסף OVA-A555-התווית CSF נוזלים. (א)תוכנית העיצוב הניסיוני. OVA-A555 הוזרק לתוך ICM או parenchyma עמוד השדרה ThLb, אז עכברים הוקרבו 45 דקות לאחר הזריקה. הדגימות נונו ונצפו על ידי הדמיית מקרוסקופ פלואורסצינטי (B,C). תמונות מקרוסקופ פלואורסץ של חוליות צוואר הרחם מ- ICM- (B) ו ThLb- (C) מוזרק עכברים. שימו לב כי OVA-A555 שהצטברו ב-dcLNs (B,C, ראשי חץ לבנים), בחללים הזוויתיים והפרבסקולריים של חוט השדרה הצווארי(B,C) ולאחר הזרקת ICM, במסלולי יציאה מאווררים, ככל הנראה לאורך עצבי צוואר הרחם(B, חצים לבנים). SC = חוט השדרה. כוכבית = גוף חוליות גהוני; D = גב; L = רוחטי; V = גהות; הסתכם ב- B ו- C = 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי של נוזלי CSF OVA-A555בעלי תווית במערכת הלימפה החוליות. (א)תוכנית העיצוב הניסיוני. OVA-A555 הוזרק לתוך parenchyma עמוד השדרה ThLb, אז עכברים הוקרבו ב 45 דקות לאחר הזריקה. הדגימות טופלו בפרוטוקול iDISCO+ ותמונה עם LSFM. (B,C) מה אתה עושהכאן? הקרנה תכנון של LSFM שנתפסו תצוגות תלת-מידות קדמיות של צוואר הרחם (B) וקטעי עמוד שדרה(C)בית החזה. OVA-A555 הצטברות (אדום) זוהתה ברקמות חוט השדרה וdcLNs(B, חץ לבן), כפי שמוצג באיור 2, אבל לא בצוואר הרחם ובבית החזה כלי דם immunolabeled כאן עם נוגדנים anti-LYVE1 (ירוק). SC = חוט השדרה; כוכבית = גוף חוליות גהוני; D = גב; L = רוחטי; V = גהות; פסים בקנה מידה = 1מ"מ( B ), 300 μm (C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי של ניקוז לימפה חוליות לאחר הזרקה תוך-שדרתית של נוגדנים אנטי-LYVE1. (א)תוכנית העיצוב הניסיוני. נוגדנים נגד LYVE1 הוזרקו לתוך parenchyma עמוד השדרה ThLb, אז עכברים הוקרבו 45 דקות לאחר ההזרקה. הדגימות טופלו בפרוטוקול iDISCO+ ותמונה עם LSFM. (ב).הקרנה כנית של תצוגות תלת-מידותיות קדמיות של קטע עמוד שדרה ThLb (B), שנלכדו באמצעות LSFM. נוגדנים נגד LYVE1 זוהו עם נוגדנים נגד ארנב (סגול) ואת כלי הדם הלימפה עם נוגדנים ANTI-PROX1 (ירוק). כלי דם לבנים הם PROX1+ לימפה colabeled עם נוגדנים אנטי LYVE1 (B); אלה כוללים חוליות (חצים צהובים) וחתר חוליות (חצים צהובים כפולים) לימפה. SC = חוט השדרה; כוכבית = גוף חוליות גהוני; D = גב; L = רוחטי; V = גהות; סולם ברים = 300 μm (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

ריאגנטים (ריאגנטים) יעד (10 איור (איור) שלב פרוטוקול הערות והערות
OVA-A555 מעקב CSF איור 2 ואיור 3 2. הזרקת ICM או ThLb
7. הדמיית LSFM.		 מסיס במים, קל להזרקה ופלואורסצסצנציה אינטנסיבית גבוהה
נוגדן אנטי-Lyve1 סמן ממברנה של תאי טלוויזיות איור 3 6. iDISCO + הר שלם immnunostaining.
7. הדמיית LSFM.		 נוגדן יעיל להר אימנוזה שלם
ניקוז מעקב של טלוויזיות דוראל ואפידורל איור 4 2. הזרקת ICM או ThLb
6. iDISCO+ הר שלם immnunostaining
7. הדמיית LSFM
נוגדן אנטי-פרוקס1 סמן גרעיני של תאי טלוויזיות איור 1 ואיור 4 6. iDISCO+ הר שלם immnunostaining
7. הדמיית LSFM		 נוגדן יעיל להר אימנוזה שלם

טבלה 1: נוגדנים ומעקבים המשמשים במחקר.

בעיה (בעיה סיבה אפשרית פתרון (פתרון
ניתוח להזרקת מעקב נגע רקמת CNS לא רצויה 1. חוסר שליטה על הכנסת נמת זכוכית
2. עומק שגוי של הכנסת נמת זכוכית		 1. דייקן בזהירות, אבל באופן מלא, מאטר dura עם מחט 26 G לפני החדרת נמת זכוכית.
2. להפחית את מעמקי החדרת נמת זכוכית (<1.5 מ"מ מן מאטר dura).
3. להפחית את קוטר נמת הזכוכית.
טמא לא רצוי של מעקב מוזרק לתוך האפידורל או מחוץ לחללים חוליות הזרקה שגויה של מעקב 1. בדוק אם נמת מיקרו זכוכית הוכנס היטב לתוך הדייק מאטר dura.
2. להוסיף דבק כירורגי בין מיקרו-כיון זכוכית לבין הרקמה המוקפת לפני הזרקת מעקב.
נפח מוגזם של מעקב מוזרק להפחית את עוצמת האחסון של מעקב מוזרק (<2 μL).
iDISCO+ אימונוסטיין היעדרות, הטרוגניות או רקע מוגזם של תיוג ברקמה 1. בעיות עם הריכוז של הנוגדן העיקרי
2. חפוז לא מספיק
3. כביסה לא מספקת
4. ניקוי לא מספיק		 הגדל את המספר ו/או את זמן שלבי הדגירה: חחלוב, וואהינג, נוגדן ראשוני וספתור. ראה http://www.idisco.info (שאלות נפוצות ופתרון בעיות).
מדבקות לא מספיקות השתמש טיפול מדבקות מחמיר יותר של מדגם עם EDTA21 או פתרון מורס עבור רקמות הראש במיוחד.
ניקוי iDISCO+ הדגימות אטומות או בצבע חום הלבנה לא מספקת השתמש בפתרון H2O2 טרי, הגדל את עוצמת הקול ו/או זמן הדגירה.
נוכחות חמצון מלא את הצינור לחלוטין כדי למנוע את הנוכחות של אוויר.
ניקוי לא מספיק הגדל את עוצמת הקול ו/או זמן הדגירה. ראה http://www.idisco.info (שאלות נפוצות ופתרון בעיות).
זיהוי מעקב מעקב בלתי ניתן לגילוי שילוב שגוי של המעקב הנבחר אלקסה 555, 594 ו- 647 fluorochromes עמידים iDISCO +פרוטוקול 5,,6,7,,8,,9,,10. עם זאת, זה לא המקרה עבור FITC, GFP, RFP fluorochromes.
הקרבת נקודת זמן לאחר ההזרקה מעדיף OVA-A555 עבור ניתוח ניקוז לטווח קצר (15 דקות) ב לימפה חולייתן מקומית. לניתוח ניקוז בלוטות הלימפה, OVA-A555 ונוגדן Lyve1 יכול לשמש לטווח ארוך יותר (>45 דקות) ניתוח.
הדמיה: לכידה וניתוח תמונות שצולמו של מעגל הלימפה אינן משביעות רצון בעיה בפירוק (בלוטות הלימפה חסרות) כלול בזהירות את הרקמות השכנות החוליות/גולגולת בדגימה החתונה שלך, על פי מעגל הלימפה שאתה רוצה למצוא.
סוגיית הדמיה 1. שנה את פרמטרי הרכישה של LSFM: עוצמת לייזר, צמצם מספרי גיליון אור, עובי גיליון אור, זמן תערוכה.
2. מקם את המדגם בתמיכה כדי להפחית את הנתיב נע באור דרך הרקמה עד המטרה.
3. ודא כי אין בועות בתוך דגימת הרקמה במהלך הרכישה.

טבלה 2: ייעוץ לפתרון בעיות עבור כל שלב בפרוטוקול, כולל בעיות ופתרונות אפשריים.

Discussion

פרוטוקול iDISCO+/LSFM מספק תצוגות תלת-מידות חסרות תקדים של רשת הלימפה הקשורה ל-CNS בתוך הרקמות שמסביבה ברמת רזולוציה תאית. פרוטוקול זה מותאם היטב לדגימות בגודל בינוני, ולא מדגים 1.5ס"מ 3, בשל המגבלות של המערכת האופטית LSFM, מרחק העבודה המופחת, ואת הגודל הגדול של עדשות אובייקטיביות מסחריות עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה23. מגבלה זו מונעת לכידת כל מערכת הלימפה הקשורה למוח. חשוב לציין כי תחום החקירה צריך להיות מופרד בזהירות ואת הרקמות הסובבות את מערכת העצבים תק יש לנתח בזהירות על מנת לכלול את כלי הלימפה החוץ-גולגולתיים ו-LNs שתורמים לכל המעגלים הלימפטיים(טבלה 2).

בנוסף לשיקולים גודל ואנטומיים, המורכבות של רקמות mesenchymal שמסביב משתנה לאורך הגולגולת ועמוד החוליות, אשר דורש התאמה של מדבקות וטיפול preclearing על מנת לקבל הבהרה מדגם הומוגני ולאפשר הפצת קרן אור בתוך רקמה ביולוגית איזוטרופית רכה. בהיעדר עצמות, הדמיית LFSM של המוח או רקמות חוט השדרה אינה מחייבת את שלב הממתג, ואת הרזולוציה הסופית של התמונות שנתפסו הואאופטימלי 19. הפרוטוקול המתואר לעיל, הכולל שלב מדבקות מתון עם הפתרון של מורס, מותאם היטב להדמיית LSFM של עמודת החוליות כפי שמוצג באות 1 ואיור 4. לעומת זאת, אזור הצוואר מציג אנטומיה מורכבת במיוחד של עצם בנוסף לשכבות מרובות של שרירים, שומן, ורקמות הבלוטות, אשר להפחית את האיכות של תמונות LSFM שנתפסו, כפי שמשתקף איור 3B. הדמיית LSFM של אזור הצוואר וצוואר הרחם עשויה להיות משופרת על ידי טיפול מחמיר יותר של רקמות; לדוגמה, עם EDTA, כפי שדווח בעבר24. השלב מדבקה ולכן הוא קריטי ותנאי מדבקות יש לבדוק בעבר עבור כל נוגדן בשימוש לפני הפעלת iDISCOהמלא + פרוטוקול (טבלה 2).

בעוד פרוטוקול iDISCO+/LSFM מאפשר יצירת תצוגה תלת-מית-מיו של חיבור מעגלים בין מנום המוח ומרחבי אפידורל ו- LNs המשויך, הניתוח הכמותי הישיר של כלי הדם הלימפה מתמונות LSFM שנתפסו אינו אפשרי מהסיבות הבאות: 1) התיוג של מעגלי כלי לימפה אינו אמין בשל דפוס בלתי רציף של ביטוי סמן לימפה, כי membranar LYVE1 מופץבזאת 21 ו PROX1 יש דפוס ביטויגרעיני 22; 2) החדירה הטרוגנית של נוגדנים, כמו גם אניסוטרופיה שעשויה להימשך ברקמה הביולוגית בשל מדבקות הטרוגניות לא שלמות והטרוגנית וpreclearing. הדמיית LSFM צריכה להיות מורחבת על ידי כלי מציאות מדומה המאפשרים הדמיה אינטראקטיבית ובכך להקל על כימות של כלי הדם הלימפה (www.syglass.io). כמו כן, ראוי לציין כי התיאור המדויק של המעגלים הקשורים CNS דורש גיבוי מידע LSFM עם נתונים ברזולוציה גבוהה confocal שהושגו על ידי immunolabeling קונבנציונלי על דק (5–10 μm) cryostat או פרפין מוטבע רקמות מקטעים, במיוחד כדי למקם במדויק את המיקום של כלי לימפה לגבי dura mater ו CSF, כפי שדווח בעבר11,14,18.

פרוטוקול iDISCO+/LSFM מאפשר הדמיה תלת מימדית של הניקוז המקרומולקולרי במערכת הלימפה המשויכת ל-CNS, כפי שמוצג באיור 3 ואיור 4. עם זאת, ההערכה הפונקציונלית של ניקוז הלימפה דורשת, בנוסף להמלצות על iDISCO+/ LSFM פרוטוקול מפורט לעיל, לאחר הליך קפדני, כמו התוצאה הסופית תלויה באיכות של ניתוח ההזרקה, הבחירה של אתר המסירה, סוג ונפח מוזרק של סמן macromolecule בשימוש, ואת זמן ההקרבה לאחר ניהול מעקב (טבלה 2). בשל וריאציות של דפוס המעקב בין בעלי חיים מוזרקים, האפיון של מעגלי ניקוז לימפה דורש קבוצות ניסיוניות גדולות (>10 על ידי מצב הזרקה). בפרוטוקול שהוצג, 1) מאטר dura חייב להיות מנוקב לפני הזרקה כדי למנוע נגעים לא רצויים וחדירה לתוך רקמות CNS; 2) הנפח המוזרק צריך להיות פחות מ 2 μL כדי להגביל דיפוזיה לא רצויה דרך חור ההזרקה, לאורך נימי ההזרקה, לתוך שטח אפידורל או רקמות מחוץ לחלית לבן; 3) את מעמקות הכניסה הנמת הזרקה יש מוגבל 2 מ"מ מתחת מאטר דורה כדי למנוע פגיעה CNS או תסיסה בזריקות ICM ותוך שדרתי, בהתאמה. שימו לב גם כי ניתוח confocal ברזולוציה גבוהה משלימה של מקטעים חוליות שכנים צריך להתבצע, כאמור לעיל, כדי להעריך את הנוכחות של מעקב מוזרק בתוך כלי הלימפה. ניתוח זה דורש ביסוס חלקות פרופיל העוצמה עבור המעקב ואת סמן הלימפה על חתךים צולבים של כלי לימפה עם תווית מרקר. גישה זו שימשה בעבר כדי להפגיןספיגת OVA 555 על ידי לימפה ThLb ב 15 דקות לאחר ההזרקה (דמות משלימה 5F ביעקב ואח'14). עם זאת, זה לא היה מאויר עבור מעקב אנטי LYVE1 במחקר הנוכחי(איור 4).

בין מעקבי CSF אפשריים, OVA-A555 היא אפשרות מצוינת כפי שהוא עמיד iDISCO+ טיפולים פרוטוקול ושומר על פלואורסץ גבוה עבור הדמיית LSFM. עם זאת, שים לב שיש לבחור את סוג המעקב בהתאם לנקודת הזמן לניתוח (טבלה 1 וטבלה 2). כפי שדווח לעיל, OVA-A555 תיוג של כלי לימפה חולייתן מקומיים נצפתה ב 15 דקות לאחרהזרקה 14. עם זאת, OVA-A555 אינו מזוהה עוד במעגלים לימפה מקומיים אלה ב 45 דקות לאחרההזרקה (איור 3)בניגוד נוגדן LYVE1(איור 4).

לסיכום, iDISCO+/ LSFM פרוטוקול מותאם היטב לחקירת מבנה 3D וניקוז של מערכת הלימפה הקשורים CNS בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כגון CNS וסרטן עמודה חולייתן, או עצם חוליות ומחלות מפרקים. למרות שההליך המלא ארוך ודורש קשיחות מתודולוגית, הוא מספק מידע ייחודי בעל ערך בעת שימוש בניתוח משלים באמצעות כלי מציאות מדומה והדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סאנטה et de la Recherche רפואי, Agence הלאומי Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), הפדרציה לשפוך la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), קרנוט התבגרות (אל.ג'יי), אוניברסיטת הפדרלי דה ריו דה ז'ניירו (UFRJ עבור J.B.), NIH (R01EB016629-01) ואת בית הספר לרפואה של ייל. אנו מכירים בפלטפורמות ICM: ICM-QUANT להדמיה תאית והיסטומיקה ICM עבור אימונוהיסטוכימיה. כל העבודה בבעלי חיים נערכה במתקן PHENO-ICMice. הליבה נתמכת על ידי 2 "Investissements d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 ו ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) ו"Fondation pour la Recherche Médicale". אנו מכירים את ניקולס רנייה על ייעוץ מתודולוגי וקריאת כתבי יד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge tubes: 0.2ml Eppendorf 30124359
Centrifuge tubes: 2ml Eppendorf 30120094
Conical centrifuge tubes: 15ml Falcon 352096
Conical centrifuge tubes: 50ml Falcon 352070
Microtome blade 80mm Microm Microtech France F/MM35P
Needles 26G (0.45x13 mm) Terumo AN*2613R1
Syringe 1ml Terumo SS+01H1
Microscopes and imaging softwares
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera Zeiss
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) OXFORD instruments
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion COHERENT
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) LaVision Biotec
Reagents
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit Thermo Fisher A10042
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat Jackson ImmunoResearch 705-605-147
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit Jackson ImmunoResearch 711-605-152
Anti-LYVE1 polyclonal antibody Angiobio #11-034
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody R&D systems #AF2727
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) Animalcare Ampule 1ml
Dibenzyl Ether 100% (DBE) Sigma Aldrich 108014
Dichloromethane 100% (DCM) Sigma Aldrich 270997
Formic acid 99% CARLO ERBA 405793
Glycine Sigma Aldrich G.7126
Heparine sodium salt from porcine Sigma Aldrich H4784
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) Sigma Aldrich H1009
Isoflurane (Iso-Vet 100%) Piramal NDC 66794-013-10
Methanol 100% Sigma Aldrich 322415
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate Invitrogen 11549176
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) Euromedex ET330-A
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) Dechra 08718469445110
Tri-sodium citrate VWR 6132-04-3
Surgical tools and equipments
Anaesthesia system Univentor Univentor 410 Anaesthesia Unit
Glass micropipette puller Narishige PC-10
Heating pad CMA Microdialysis AB CMA 450 Temperature controller
Microcapillaries (Glass Capillaries) Harvard Apparatus GC120-15
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) Fine Science Tool 12040-01
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) Swann-Norton 0510
Stereotaxic apparatus KOPF Model 940
Syringe Hamilton 10µl 701N Hamilton 28618-U
Warm air System Vet-Tech LTD HE011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
  2. Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Implications of the discovery of brain lymphatic pathways. The Lancet Neurology. 14 (10), 977 (2015).
  3. Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
  4. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
  5. Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
  6. Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
  7. Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  10. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  11. Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
  12. Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  13. Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9 (2010).
  14. Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
  15. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  16. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  17. Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
  18. Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738 (2017).
  19. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  20. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  21. Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  23. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: a tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 159 קרום המוח וחוס כלי דם לימפה חוליית בלוטות הלימפה ניקוז iDISCO+ מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור מערכת העצבים המרכזית
הדמיה תלת מימדית של כלי הדם והניקוז הלימפטיים החולייתיים באמצעות iDISCO<sup>+</sup> ומיקרוסקופית פלואורסצנטית גיליון אור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacob, L., Brito, J., Thomas, J. L.… More

Jacob, L., Brito, J., Thomas, J. L. Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61099, doi:10.3791/61099 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter