Summary
Ett protokoll presenteras kombinerar vävnad clearing med ljus blad fluorescens mikroskopi (LSFM) för att erhålla tredimensionella och cellulära upplösning bilder av lymfatiska fartyg och lymfknutor (LNs) samla ryggmärgsvätskan (CSF) och spinal epidural vätska.
Abstract
Det lymfatiska systemet i samband med det centrala nervsystemet (CNS) inkluderar lymfatiska vasculature som snurrar runt hjärnan, ryggmärgen, och dess associerade LNs. CNS-associerade lymfsystemet är involverad i dränering av CSF makromolekyler och meningeal immunceller mot CNS-dränerande LNs, därigenom reglera avfall clearance och immun övervakning inom CNS vävnader. Presenteras är en roman strategi för att erhålla tredimensionella (3D) och cellulära upplösning bilder av CNS-associerade lymphatics samtidigt bevara integriteten hos sina kretsar inom omgivande vävnader. iDISCO+ protokollet används för att immunolabel lymfkärl i dekalcifierade och rensas hela montera preparat av vertebral kolumnen som därefter avbildas med ljus blad fluorescens mikroskopi (LSFM). Tekniken avslöjar 3D-strukturen i det lymfatiska nätverket som förbinder meningeal och epidural utrymmen runt ryggmärgen till extravertebral lymfkärl. Förutsatt är 3D-bilder av dräneringskretsarna av molekylära spårämnen som tidigare injicerats i antingen CSF via cisterna magna eller thoracolumbar spinal parenkym. Metoden iDISCO+/LSFM ger aldrig tidigare skådade möjligheter att utforska strukturen och funktionen hos det CNS-associerade lymfsystemet inom neurovaskulär biologi, neuroimmunologi, hjärn- och kotcancer eller vertebral ben- och ledbiologi.
Introduction
CNS är omgiven av CSF och överliggande lager av hjärnhinnor, epidural vävnad och ben. Sammantaget ger CSF fysiskt skydd till den mjuka hjärnan och ryggmärgen. Det utsöndras främst av den choroid plexus och meningealmembranen (dvs. pia mater, den arachnoid, och dura mater). CSF-meningeal komplexet upprättar också ett funktionellt gränssnitt mellan CNS vävnader och resten av kroppen, och därmed bidra till CNS homeostas. Först penetrerar CSF CNS-parenkymet genom CNS-para-arteriella utrymmen och interagerar dynamiskt med interstitialvätskan (ISF)1 via det glymfatiska (glia-lymfatiska) systemet, som består av de paravaskulära utrymmena och astrocyternas ändföttmembran runt CNS-kärlen2,3,4. Metaboliskt avfall och överskott av vätska rensas sedan slutligen genom intramural perivaskulär dränering direkt från hjärnan parenkym mot den systemiskacirkulationen 3, liksom de paravenösa utrymmen mot CSF och via kompetensflyktande lymfkärl, enligt den glymphatic modellen2,4. CSF utflöde sker främst via lymfsystemet, genom cribriformplattan och tillhörande extrakraniella lymfkärl5,6,7, samt av meningeal lymfkärlen, som konvergerar vid den kompetenstorpande LNs8,9,10,11,12 ( Figur1). En viktig, även om sekundära, roll i CSF utflöde tas av den kraniala arachnoid villi, som tränger in i luckan av meningeal venous bihålor13.
CFS dräneringskretsar har undersökts utförligt genom experimentella metoder baserade på injektion av färgade/fluorescerande spårämnen i CNS eller CSF, följt av avbildning av spårämnenas mönster inuti CNS och i hela kroppens organ och vävnader vid olika tidpunkter efter injektion13. Under lång tid ansågs utflödet av CSF uteslutande och direkt tas i laddning av blodcirkulationen, genom arachnoid villi som projicerar i Dural venous bihålor13. GSR-utflödet utförs dock övervägande av den lymfatiska vaskulaturen, vilket nyligen visades av en dynamisk avbildning i närheten av infrarött (NIR) av CSF-injicerad spårämnestransport hos möss9,10. DE CSF-dränerande lymfkärlen sedan tillbaka lymfa till blodomloppet via rätt subclavian vein. Kompletterande approcher har upptäckt både extrakraniell6,7,13 ochintrakraniell9,10,1111,12 lymfatiska utgångar av CSF-injicerade spårämnen och tyder på att CSF absorberas av två lymfvägar, en extern och den andra en inre till skallen och vertebral kolumnen. Huvuddelen av CSF dränering sker snabbt genom lymfkärl som ligger rostrally, utsidan av skallen i nässlemhinnan, genom kanaler av cribriform plattan av ethmoid ben3,6,13 och, caudally, utanför lumbosacral vertebral ben genom dorsolateral vägar som ännu inte helt kännetecknas7,14. Dessutom, i hjärnhinnorna i skallen, lymfatiska kapillärer av dura mater directy absorberar CSF och meningeal immunceller mot Dural lymfatiska samlare som korsar skallen ben och ansluta till CNS-dränerande LNs12,14. Dessa meningeal lymfkärl spelar viktiga roller i CNS patofysiologi, eftersom hjärnan meningeal lymfatik ändras vid åldrande och även påverka resultatet av neurologiska hjärnsjukdomar, inklusive neurodegeneration, neuroinflammation, och hjärncancer15,16,17. Därför cns-associerade lymfatiska vasculature (dvs., de Hamburg och perifera lymfatiska fartyg dränera CSF) kan därför vara en lovande roman mål att bekämpa CNS sjukdomar hos människor.
Konvergenta studier utförda med immunohistologi och högupplöst magnetresonanstomografi visade att den meningeala lymflymfaturen också finns hos primater, inklusive vanliga silkesapor och människor7,11,13. Dessutom meningeal lymfkärl är inte begränsade till skallen, men sträcker sig inom kotpelaren till ytan av spinal ganglier och rami13,18. Tredimensionella (3D) imaging av kotpelaren lymflyten bevara den totala anatomin av märkt vertebral och spinal prover, inklusive överliggande ben, muskler, ligament, samt angränsande visceral vävnader, utfördes nyligen14. IDISCO+ protokoll19,20 användes för att immunolabel avkalka och rensas preparat av hela kotpelaren med lymfatisk-specifika antikroppar mot antingen membranreceptorn LYVE121 eller transkriptionsfaktorn PROX122. Bildförvärv och analys genomfördes sedan med ljusbladsfluorescensmikroskopi (LSFM) och Imaris-programvaran. LSFM möjliggör snabb och minimalt invasiv 3D-avbildning av stora exemplar genom axial inneslutning av belysning, vilket resulterar i minskad fotobleaching och fototoxicitet23.
Den iDISCO+/LSFM tillvägagångssätt tillåter karakterisering av de distinkta skikten av Hamburg och epidural lymfkärl, och anslutningen av denna vasculature till de extravertebral lymfatiska kretsar och LNs angränsande ryggraden. Protokollet tillämpades på vävnader som tidigare injicerats med fluorescerande spårämnen för att demonstrera kotkanalen dränering. Föreliggande papper ger detaljer om iDISCO+/LSFM metodik för att bilden av vertebral lymfatiska vasculature och illustrerar dess relevans för CSF och epidural vätska dränering utredning.
Protocol
Alla in vivo-förfaranden som användes i denna studie uppfyllde alla relevanta etiska föreskrifter för djurförsök och forskning, i enlighet med Europeiska gemenskapen för riktlinjer för försöksdjuranvändning (L358-86/609EEC). Studien fick etiskt godkännande av Etiska kommittén för INSERM (n°2016110111126651) och Institutionella Djurvårds- och Användningskommittén för ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).
1. Förberedelse
- Förbered följande dissectionverktyg för kirurgi: skalpell (1), mikrokrafter (2), tescerps (1), dissekeringssax och Michel suturklipp. Förbered 26 G-nålar (0,45 mm x 13 mm), 1 mL spruta, och 10 μL mikrosyring.
- Dra mikrokapillärer med ett enkelstegsprotokoll vid 67,5 °C med en mikropipettdragare av glas. Förbered två mikrokapillärer per injektion.
- Förbered reagenser för bildgivande lymfdränage (tabell 1): Ovalbumin Alexa Fluor 555 konjugat (OVA-A555, 2 mg/mL i 1x fosfatbuffrad saltlösning [PBS]) och anti-LYVE1-antikropp (1 mg/mL i 1x PBS).
- Bered antikroppar (Tabell 1) för iDISCO+. För primära antikroppar, använd anti-LYVE1 kanin polyklonal antikropp (1: 1,600) och anti-PROX1 get polyklonala IgG antikropp (1: 2,000). För sekundära antikroppar, använd Alexa Fluor åsna anti-kanin-568, åsna anti-kanin-647, och åsna anti-get-647 (1:2,000).
2. Kirurgiprocedurer för intra-cisterna magna (ICM) och thoracolumbar (ThLb) injektioner
- Beredning av djuret för kirurgi
- Använd vuxna han- och honmöss C57BL6/J, 8–12 veckor gamla.
- Injicera musen intraperitoneally (IP) med 0,015 mg/mL buprenorfinlösning utspädd i 0,9% natriumklorid vid 0,1 mg/kg, 15 min före operation.
- Söva musen i en induktionslåda med 2–3 % isoflurangas.
- Beredning av sövda djur för spårämne injektion
- Placera den sövda musen och dess värmedyna på stereotaxisk apparat. Använd öronstänger för att hålla musens huvud, och lägg ner kroppen i en ~ 135 ° vinkel mot huvudet eller immobilisera ryggmärgen vid ThLb kotnivå (Th12-L1) med en spinal adaptor. Nyp svansen eller tassen med kraftpet för att kontrollera effektiviteten hos anestesi.
- Injicera IP 200 μL av 0,9% natriumklorid för mushydrering.
- Med hjälp av en skalpell blad, göra en hud snitt, antingen i occipital regionen mot livmoderhalscancer regionen för ICM injektion, eller på ThLb vertebral nivå (Th10-L3) för injektion i ThLb spinal parenkym.
- Spårämne injektion
- Kasta paracerviska och paraspinal muskler som täcker halsen och kolumnen för att visualisera ytan av dura mater, det yttersta lagret av hjärnhinnorna.
- Försiktigt punkttera det centrala området i dura mater och underlaying arachnoid med en 26 G nål.
- Mikrokapillär implantation
- Skär 2 mm av glaskapilleringsspetsen (se steg 1.2), använd sedan mikrokapillären som är kopplad till en kanyl kopplad till en 10 μL spruta till aspirering 2−8 μL av OVA-A555 eller LYVE1-antikroppen.
- Introducera mikrokapillären i den mediala regionen av duramater i 30° vinkel för ICM-injektioner eller 10° vinkel för ThLb-spinalinjektioner, och tryck in den till 1,5 mm under duramataren.
OBS: Ligamentet punkteras, men ingen laminektomi utförs. - Tillsätt 10 μL kirurgiskt lim för att stänga snittet runt glaskaljillären och vänta tills det torkar.
- Injicera långsamt lysrörsspåraren vid 1 μL/min. När injektionsvolymen har levererats, bibehåll kapillären på plats i 1 min. Dra tillbaka mikrokapillären och tillsätt kirurgiskt lim för att stänga injektionshålet.
- Postinjektion, stäng huden snitt med sutur klipp. Ta bort musen från den stereotaxiska apparaten och placera den i en uppvärmningskammare för postkirurgi vid 37 °C tills den återhämtar sig.
3. Perfusion och vävnadsdesektion
- Vid antingen 15 min eller 45 min efter CSF-spårinsprutning, injicera IP en dödlig dos (100 μL) av natrium pentobarbital. Nyp svansen eller tassen för att verifiera att det inte finns någon reflex.
- Med dissekering sax, skär huden och öppna peritoneal lagret från nedre delen av buken regionen mot bröstkorgen bur. Öppna bröstkorgen med sax för att få tillgång till hjärtat.
- Sätt in 26 G-nålen i hjärtats vänstra ventricule och börja genomstärka med 20 mL iskall 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS vid 2 mL/min. Använd sax för att snabbt skära höger förmak och släpp perfusionsvätskeströmmen.
- Ta helt bort huden med tuts och skär de fyra benen med sax. Ta bort alla inre organ men var noga med att bevara LNs intakt.
OBS: Mandibular LNs är ytliga, så var noga med att inte ta bort dem när du skär av huden. Deep-cervical LNs (dcLNs) är belägna på varje sida av luftstrupen, i kontakt med den laterala ytan av de inre halsvenerna och nära stereomastoidmusklerna. - Skär revbenen för att avlägsna kotpelaren med ryggmärgen inuti från hals-till ländryggen segment.
- Sänk ned de dissekerade vävnaderna i iskall 4% PFA i 1x PBS i ett 50 mL-rör över natten (~18 h) vid 4 °C. Tvätta de fasta vävnaderna 3x i 50 mL på 1x PBS i 5 min.
4. Fluorescens makroscopy av ett kotsegment
- Placera provet under fluorescensstereozoommikroskopet med en kamera (Table of Materials). Ta en översikt över exemplet eller zooma på en viss region.
5. Provberedning för hela mount-immunofärgning
- Med hjälp av ett mikrotomblad, genomskinligt skära huvud-och-vertebral kolumnen på occipital och livmoderhalscancer nivåer.
OBS: Denna dissektion tillåter isolering av huvudet och halskotaregionen från resten av kotpelaren. - Med ett mikrotomblad skär du hals-, thoracolumbalen och korskotasområdena transversal i segment av 2−4 kotor, cirka 0,5 cm storlek vardera.
- Isolera varje segment i ordningen den var skild från vertebral axeln, längs hela längden av de massundersökning och bröst regioner i ryggraden. Bevara varje prov i ett rör på 2 mL 1x PBS.
6. iDISCO+ hela mount immunfärgning av ett kotsegment
OBS: Den detaljerade beskrivningen av iDISCO+ -protokollet är åtkomlig http://www.idisco.info.
- Dag 1: Tissue uttorkning
- Dehydrate vertebral vävnadsprover (dvs. ett kotsegment) genom successiv nedsänkning i 20%, 40%, 60%, 80%, och 100% metanol i 1x PBS för 1 h med agitation.
- Inkubera proverna över natten i en lösning på 33% metanol/66% diklormetan (DCM) vid rumstemperatur (RT) med agitation.
- Dag 2: Vävnad blekning
- Tvätta prover 2x med 100% metanol för 1 h vid RT. Inkubera proverna i 5% H2O2 i metanol (30% H2O2 och metanol 1:5 v/v) vid 4 °C över natten.
- Dag 3: Förkalkning och permeabiliseringssteg
- Rehydrera proverna gradvis i 80%, 60%, 40%, 20% metanol, sedan i 1x PBS (1 h i varje lösning) vid RT med agitation.
- Avkalka kotor genom att inkubera prover i Morses lösning (10% trisodiumcitrat och 45% myrsyra 1:1 v/v) i 30 min vid RT för att bevara benstrukturen.
- Skölj proverna 2x med 1x PBS och inkubera 2x i 1 h i PTx2-lösning (0,2% Triton X-100 i 1x PBS, förnya för den andra inkubationen) vid RT med agitation. Inkubera sedan de förbehandlade proverna i permeabiliseringslösning (PTx2 med 20% dimetylsulfoxid [DMSO] och 2,3% w/v glycin) vid 37 °C i 24 h.
- Dag 4: Blockeringssteg
- Inkubera prover i blockerande lösning (PTx2 med 6% åsneserum och 10% DMSO) vid 37 °C i 24 h.
- Dagar 5−16: Hela mount immunolabeling
- Inkubera prover i primär antikropp som späds ut i PTwH (1x PBS innehållande 0,2% Tween- 20 och 0,1% heparin vid 10 mg/mL i 1x PBS) med 5% DMSO/3% åsneserum vid 37 °C i 6 dagar. Tvätta prover 4−5x i PTwH vid RT med agitation över natten.
- Inkubera prover i sekundära antikroppsutspädningar i PTwH med 3% åsneserum vid 37 °C i 4 dagar. Tvätta prover i PTwH 4−5x vid RT under agitation över natten innan du rensar.
- Dag 17 och 18: iDISCO+ mjukning
- Torka prover gradvis genom successiv nedsänkning i 1x PBS, sedan 20%, 40%, 60%, 80%, och 2x i 100% metanol (1 h i varje lösning). Inkubera varje prov över natten i en lösning på 33% metanol/66% DCM.
- Tvätta 2x i 100% DCM i 15 min för att avlägsna metanolen. Inkubera i dibenzyleter (DBE) utan att skaka tills den rensats (4 h) och förvara sedan i DBE vid RT före bildtagning.
7. LSFM bildframställning
- Bild rensas prover i ett gränsöverskridande plan med LSFM utrustad med en 4x/0.3 mål.
- Använd en endasidig tre ark belysning konfiguration, fast x position (ingen dynamisk fokusering). Använd LED-lasrar inställda på 561 nm, 100 mW; och 639 nm, 70 mW. Ställ in den numeriska ljusarköppningen på 30 %.
- Använd olika emissionsfilter: 595/40 för Alexa Fluor-568 eller -555, och -680/30 för Alexa Fluor-647.
- Fyll mikroskopkammaren med DBE.
- Aquire staplar med 2,5 μm z steg och en 30 ms exponeringstid per steg med kameran (Table of Materials). Använd den optiska x2-zoomen för en effektiv förstoring på (x8), 0,8 μm/pixel, och utför mosaikförvärven med en överlappning på 10 % på hela ramen.
- Skaffa bilder i .tif-format med förvärvsprogram och omvandla dem till 3D-format med en filkonverteringsprogram.
- Rekonstruera mosaik förvärv med stitcher programvara( Table of Materials). Öppna bilderna och flytta manuellt för att rekonstruera hela mosaikbilden, med hjälp av 10% överlappning mellan bilder som en riktlinje.
- Använd 3D-programvaran (Table of Materials) för att generera ortogonala projektioner av data, som visas i figur 1, figur 2, figur 3, och figur 4, och lägg till ett färgkodsattribut till lymfkärlen och de andra anatomiska strukturerna som visas. Ställ in en gammakorrigering på 1,47 på de rådata som erhållits från LSFM enligt tillverkarens anvisningar.
Representative Results
3D-avbildning av kotlymfaturen
Figur 1 presenterar stegen i iDISCO+/LSFM-proceduren och en LSFM-bild av lymfkretsar inuti kotkanalen hos iDISCO+-behandlade ThLb-kotor. Kombinationen av iDISCO+ med LSFM bevarade vertebral anatomi och fångade en bild av det lymfatiska vaskulära nätverket (dvs. de intravertebral fartygen i samband med de extravertebral fartygen lämnar dorsal och lateralt från vertebral kroppen) inom de omgivande ben, ligament, muskler, och nerv ganglierna.
Fluorescens makrokopikop avbildning av dcLN dränering
För att bild makromolekyl dränering i CNS-associerade lymfatiska systemet, var makromolekylära spårämnen administrated in vivo genom injektion i antingen CSF eller spinal parenkym. En makromolekylär spårämne kan lätt levereras in i CSF vid cisterna magna. Cisterna magna ligger mellan lillhjärnan och ryggytan på medulla oblongata, ovanför foramen magnum. Makromolekylära spårämne kan också injiceras i spinal parenkyma genom stereotaktisk kirurgi på olika nivåer längs vertebral kolumnen.
De makromolekylära spårämnen som användes var antingen direkt märkta med en fluorophore eller detekteras postmortem av immunohistokemi med specifika antikroppar. Figur 2A illustrerar den experimentella planen för spårning av OVA-A555, en röd fluorescerande och liten molekylviktsspårare (omkring 45 kDa), som injicerades i antingen CSF (Figur 2B) eller ThLb-regionen i ryggmärgen (Figur 2C).
Vid 45 min efter den makromolekylära tracer injektion offrades mössen, perfused med 4% PFA, och bearbetas för att isolera dissekerade segment av regionen hjärnstammen av huvudet och vertebral kolumnen som var decalcified och förtydligas. Makromolekyl dränering var sedan lätt bedömas genom fluorescens macroscopy avbildning av LNs som samlar in CSF och epidural vätskor. Som framgår av figur 2, OVA-A555 injektion i antingen CSF (Figur 2B) eller ThLb (Figur 2C) regionen av ryggmärgen resulterade i OVA-A555 ackumulering i dcLNs vid 45 min efter injektion. Denna iakttagelse indikerar upptagning och dränering av fluorescerande spårämne av det lymfatiska systemet; det är en förutsättning innan fullfölja iDISCO+/ LSFM förfarande för att bilden av kot lymfdränage.
3D-avbildning av makromolekyldränage i kotlymfsystemet
Baserat på detektion av OVA-A555-märkning i dcLNs kunde proceduren iDISCO+/LSFM tillämpas på avkalkylerade och förrensade vertebrala prover som isolerats från OVA-A555-injicerade möss. Detta tillvägagångssätt får skapandet av en 3D-karta över lymfdränage av CSF och spinal epidural vätska vid en viss tidpunkt efter spårämne injektion. Denna 3D-mappning skulle kunna utföras genom bildframställning successiva CNS-segment, på varje nivå av ryggrad, från injektionspunkten.
Figur 3A visar den experimentella designen för OVA-A555 injektion i ThLb spinal parenkym och den resulterande 3D-mönstret av OVA-A555 fördelning i en massundersökning och en bröstkota segment, i samband med den lymfatiska vaskulatur. Vid 45 min efter OVA-A555 injektion, OVA-A555 ackumulering upptäcktes i ryggmärgen vävnader och dcLN (vita pilar i figur 3B), i samförstånd med mikroskop observationer illustreras i figur 2. det upptäcktes inte, dock i massundersökning och bröst lymfatiska vasculature märkt med anti-LYVE1 antikroppar. Frånvaron av GSR-injicerat spårämne i kotlymfkärlen kan bero på antingen en kort persistenstid av spårämne inuti lymfkärlen eller bristande upptag av spårämnet genom lymfkärlen (Figur 3C).
För att testa den första hypotesen användes kaninen anti-LYVE1 antikropp som en lymfatisk endotel cell tag att binda CNS-associerade lymfatiska fartyg. Den injicerade kaninen anti-LYVE1 antikroppen upptäcktes därefter av immunohistokemi med en anti-kanin sekundär antikropp, medan lymfatiska endotelceller var immunolabeled med anti-PROX1 antikroppar. Figur 4 representerar den experimentella utformningen av anti-LYVE1 injektion i ThLb spinal parenkyma (Figur 4A), och den resulterande 3D-distributionsmönster av LYVE1-antikroppar i ett ThLb-segment nära injektionsstället, med avseende på PROX1+ lymflyt (Figur 4B). Båda vertebral lymphatics och deras extravertebral lymfatiska anslutningar var märkt med injicerade anti-LYVE1 antikroppar, som underbyggde tracer upptaget av vertebral lymfatiska fartyg och den lymfatiska dränering mot extravertebral lymfatiska systemet. LNs saknades i ThLb-regionen och kunde därmed inte visualiseras i det avbildade segmentet. Vidare återspeglade det diskontinuerliga mönstret av LYVE1-markör som observerats längs lymfkärlen sannolikt det diskontinuerliga uttrycket av LYVE1 i den lymfatiska vaskulaturen, såsom rapporterats i tidigarestudier 14,21. Sammantaget visade resultaten av den föreliggande studien att, vid 45 min efter spårämne injektion, LYVE1 antikroppar, men inte OVA-A555, tillåten påvisande av lokala vertebral lymfvävnad upptag och var preferrable till OVA-A555 som en långlivade markör för lokala vertebral lymfatisk dränering.
Bild 1: Tredimensionell vy över kotlymflyfkärlen. (A) Schematisk representation av protokollet. (B) Planar projektion av en 3D-vy av ThLb vertebrat lymfatisk vasculature ur ett dorsofrontal perspektiv. Lymfkärl var immunolabeled med anti-PROX1 antikroppen (grön) med hjälp av iDISCO+ protokollet och sedan avbildas av LSFM. Notera det metameriska-liknande mönstret för vasculaturen inom kotkanalen av tre på varandra följande kotor (vita pilspetsar). Förutom halvcirkelformade dorsala kärl (vita pilspetsar) inkluderade varje kotnät ventrala grenar (gula pilar), bilaterala laterala utgångsvägar längs spinal rami och ganglier (vita pilar), samt en dorsalutgångsväg vid mittlinjen (vit dubbelpil). Vertebral-nät var sammankopplade med ett längsgående kärl (lila pilar). För en fullständig beskrivning, se Jacob L. et al.18 SC = ryggmärg; Asterisk = ventrala vertebral kropp; D = rygg; L = lateral; V = ventral; Skala barer = 300 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: dcLNs samlade OVA-A555-märkta CSF Fluids. (A) Scheme av den experimentella designen. OVA-A555 injicerades i antingen ICM eller ThLb spinal parenkym, då möss offrades 45 min efter injektion. Proverna rensades och observerades genom fluorescens makroscope avbildning (B,C). Fluorescens makroscope bilder av livmoderskaver kotor från ICM- (B) och ThLb- (C) injicerade möss. Observera att OVA-A555 ackumulerade i de dcLNs (B,C, vita pilspetsar), pial och paravaskulära utrymmen i livmoderhalscancer ryggmärgen (B,C) och efter ICM injektion, i ventrolatral utgångsvägar, sannolikt längs livmoderhalscancer nerver (B, vita pilar). SC = ryggmärg. Asterisk = ventrala vertebral kropp; D = rygg; L = lateral; V = ventral; Skala barer i B och C = 2 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Påvisande av OVA-A555-märkta CSF-vätskor i kotlymfsystemet. (A) Scheme av den experimentella designen. OVA-A555 injicerades i ThLb spinal parenkym, då möss offrades på 45 min efter injektion. Proverna behandlades med iDISCO+ protokollet och avbildas med en LSFM. (B,C) Planar prognoser av LSFM-fångade frontal 3D-vyer av massundersökning (B) och bröst (C) rygg segment. OVA-A555 ackumulering (röd) upptäcktes i ryggmärgen vävnader och dcLNs (B, vit pil), som illustreras i figur 2, men inte i livmoderhalscancer och bröst lymfatisk vaskulatur immunolabeled här med anti-LYVE1 antikroppar (grön). SC = ryggmärg; Asterisk = ventrala vertebral kropp; D = rygg; L = lateral; V = ventral; Skalstång = 1 mm (B), 300 μm (C). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Påvisande av kotlymfaldränage efter intraspinal injektion av anti-LYVE1-antikroppar. (A) Scheme av den experimentella designen. Anti-LYVE1 antikroppar injicerades i ThLb spinal parenkym, då möss offrades 45 min efter injektion. Proverna behandlades med iDISCO+ protokollet och avbildas med en LSFM. (B). Planar prognoser av frontal 3D-vyer av en ThLb (B) ryggrad segment, fångas med en LSFM. Anti-LYVE1 antikroppar upptäcktes med anti-kanin antikroppar (lila) och den lymfatiska vasculature med anti-PROX1 antikroppar (grön). Vita kärl är PROX1+ lymfatik kolmär med anti-LYVE1 antikroppar (B); dessa inkluderar vertebral (gula pilar) och extravertebral (dubbla gula pilar) lymphatics. SC = ryggmärg; Asterisk = ventrala vertebral kropp; D = rygg; L = lateral; V = ventral; Skalstång = 300 μm (B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Reagenser | Mål | Figur | Protokoll steg | Kommentar |
| OVA-A555 | CSF-spårämne | Figur 2 och bild 3 | 2. ICM eller ThLb injektion 7. LSFM bildframställning. |
Vattenlöslig, lätt att injicera och hög intensiv fluorescens |
| Anti-Lyve1 antikropp | Membranmarkör av LVs celler | Bild 3 | 6. iDISCO+ hela fästet immnunostaining. 7. LSFM bildframställning. |
Effektiv antikropp mot hela mount immnunostaining |
| Spårämne dränering av hamburg och epidural LVs | Bild 4 | 2. ICM eller ThLb injektion 6. iDISCO+ hela fästet immnunostaining 7. LSFM bildframställning |
||
| Anti-Prox1 antikropp | Kärnmarkör av LVs celler | Bild 1 och bild 4 | 6. iDISCO+ hela fästet immnunostaining 7. LSFM bildframställning |
Effektiv antikropp mot hela mount immnunostaining |
Tabell 1: Antikroppar och spårämnen som används i studien.
| Problem | Möjlig orsak | Lösning | |
| Kirurgi för spårämne injektion | Oönskad CNS vävnad lesion | 1. Bristande kontroll av kapillärinsättning av glas 2. Felaktigt djup av kapillär insättning av glas |
1. Punktat med omsorg, men fullt ut, dura mater med en 26 G nål innan glas kapillär insättning. 2. Minska djupheten i kapillärinsättning av glas (<1,5 mm från dura mater). 3. Minska kapillärdiametern av glas. |
| Oönskad defilement av injicerat spårämne i epidural- eller extrakotutrymmena | Felaktig injektion av spårämne | 1. Kontrollera om glaset mikro kapillär har väl in i punktat dura mater. 2. Tillsätt kirurgiskt lim mellan mikrokapillärer av glas och den omgivna vävnaden innan du injicerar spårämne. |
|
| För hög volym injicerat spårämne | Minska volymen injicerat spårämne (<2 μL). | ||
| iDISCO+ immunfärgning | Frånvaro, heterogenitet eller överdriven bakgrund av märkning i vävnaden | 1. Problem med koncentrationen av den primära antikroppen 2. Otillräcklig permeabilisering 3. Otillräcklig tvätt 4. Otillräcklig röjning |
Öka antalet och/eller tiden för inkubationssteg: permebilisering, whashing, primär antikropp och röjning. Se http://www.idisco.info (VANLIGA FRÅGOR OCH FELSÖKNING). |
| Otillräcklig dekalcifiering | Använd en strängare dekalcifiering behandling av prov med EDTA21 eller Morse lösning för huvudet vävnader speciellt. | ||
| iDISCO+ clearing | Proverna är ogenomskinliga eller brunfärgade | Otillräcklig blekning | Använd färsk H2O2-lösning, öka volym och/eller inkubationstid. |
| Förekomst av oxidation | Fyll röret helt för att undvika närvaron av luft. | ||
| Otillräcklig röjning | Öka volym och/eller inkubationstid. Se http://www.idisco.info (VANLIGA FRÅGOR OCH FELSÖKNING). | ||
| Spårningsdetektering | Omätbara spårämne | Felaktig kombination av den valda spårningsapparaten | Alexa 555, 594 och 647 fluorokromer är resistenta mot iDISCO+ protokoll5,6,7,8,9,10. Detta är dock inte fallet för FITC, GFP, RFP fluorokromer. |
| Offra timepoint efter injektion | Föredrar OVA-A555 för kortvarig (15 min) dräneringsanalys i lokala vertebrala lymphatics. För lymfkörtlar dränering analys, OVA-A555 och Lyve1 antikropp kan användas för längre sikt (>45 min) analys. | ||
| Bildbehandling: fånga och analysera | Tagna bilder av lymfkretsen är inte tillfredsställande | Dissektion fråga (lymfkörtlar saknas) | Inkludera noga vertebral / skalle angränsande vävnader i din dissekerade prov, enligt den lymfatiska krets som du vill bilden. |
| Imaging fråga | 1. Ändra förvärvsparametrar av LSFM: laserintensitet, ljus-ark numerisk bländare, tjocklek av ljus-ark, utläggning tid. 2. Placera provet i stödet för att minska den väg som färdas med ljus genom vävnaden tills målsättningen. 3. Var säker på att det inte finns några bubblor inuti vävnadsprovet under förvärvet. |
Tabell 2: Felsökningsråd för varje steg i protokollet, inklusive möjliga problem och lösningar.
Discussion
IDISCO+/LSFM protokollet ger oöverträffad 3D-vyer av CNS-associerade lymfatiska nätverket inom dess omgivande vävnader på en cellulär upplösning nivå. Detta protokoll är väl anpassat till medelstora prover, inte exeeding 1,5 cm3, på grund av begränsningarna i LSFM optiska systemet, den minskade arbetsavstånd, och den stora storleken på kommersiella objektiv objektiv för högupplösta mikroskopi23. Denna begränsning förhindrar att fånga hela hjärnan-associerade lymfsystemet. Det är viktigt att notera att utredningsområdet måste avgränsas försiktigt och vävnaderna kring CNS måste noggrant dissekeras för att inkludera de extrakraniella lymfkärl och LNs som bidrar till hela lymfkretsarna (tabell 2).
Förutom storlek och anatomiska överväganden varierar komplexiteten hos omgivande mesenkymala vävnader längs skallen och vertebral kolumnen, vilket kräver anpassning av dekalcification och preclearing behandling för att få ett homogent prov förtydligande och tillåta ljusstråle förökning inom en mjuk isotropisk biologisk vävnad. I avsaknad av ben, LFSM avbildning av hjärnan eller ryggmärgen vävnader inte nödvändiggör dekalcification steg, och den slutliga upplösningen av de tagna bilderna är optimal19. Det ovan beskrivna protokollet, som innehåller ett milt dekalifieringssteg med Morses lösning, är väl anpassat för LSFM-avbildning av kotpelaren som illustreras i figur 1 och figur 4. Däremot visar halsregionen en särskilt komplex benanatomi utöver flera lager av muskler, fett och körtelvävnader, vilket minskar kvaliteten på fångade LSFM-bilder, vilket återspeglas i figur 3B. LSFM bildframställning av hals och livmoderhalscancer området kan därmed förbättras genom en strängare behandling av vävnader; till exempel med EDTA, som tidigare rapporterats24. Dekalcifieringssteget är därför kritiskt och dekalcifieringsförhållandena måste testas tidigare för varje antikropp som används innan hela iDISCO+ protokollet (tabell 2) påbörjas .
Medan iDISCO+/LSFM-protokollet tillåter generering av en 3D-vy av anslutande kretsar mellan meningeal- och epiduralutrymmen och tillhörande LNs, den direkta kvantitativa analysen av lymfatisk vaskulatur från LSFM-tagna bilder är inte genomförbart av följande skäl: 1) avgränsningen av lymfkärlkretsar är opålitlig på grund av det diskontinuerliga mönster av lymfatisk marköruttryck, eftersom membranar LYVE1 är hereterogenous distributed21 och PROX1 har ett kärnuttrycksmönster22; 2) den heterogena penetrationen av antikroppar, liksom den anisotropi som kan kvarstå i den biologiska vävnaden på grund av ofullständig och heterogen dekalcifiering och preclearing. LSFM imaging behöver alltså utökas med virtuell verklighet verktyg som möjliggör interaktiv visualisering och därmed underlätta kvantifiering av den lymfatiska vasculature (www.syglass.io). Det är också anmärkningsvärt att den exakta beskrivningen av CNS-associerade kretsar kräver att säkerhetskopiera LSFM-information med högupplösta konfokala data som erhållits genom konventionell immunolabeling på tunn (5–10 μm) kryostat eller paraffinin-inbäddade vävnadssektioner, speciellt för att exakt lokalisera lymfkärlens position med avseende på dura mater och GSR, som rapporteratstidigare 11,14,18.
iDISCO+/LSFM-protokollet möjliggör tredimensionell visualisering av den makromolekylära dräneringen i det CNS-associerade lymfsystemet, vilket illustreras i figur 3 och figur 4. Den funktionella bedömningen av lymfdränage kräver dock, förutom de rekommendationer om iDISCO+/LSFM-protokollet som beskrivs ovan, efter en rigorös procedur, eftersom slutresultatet beror på kvaliteten på injektionsoperationen, valet av leveransstället, vilken typ och den injicerade volymen av makromolekylmarkör som används samt tidpunkten för uppoffring efter spårämnesadresning (Tabell 2). På grund av variationer av spårämnet mönster mellan injicerade djur, karakterisering av lymfdränering kretsar kräver stora experimentella grupper (> 10 genom injektion skick). I det presenterade protokollet, 1) måste duramateren punkteras före injektion för att förhindra oönskade lesioner och penetrering i CNS-vävnaderna; 2) den injicerade volymen måste vara mindre än 2 μL för att begränsa oönskad diffusion genom injektionshålet, längs injektionsmönsionen, in i epiduralutrymmet eller extravertebralvävnaderna; 3) djupheten i injektion kapillär insättning måste begränsas till 2 mm under dura mater för att undvika CNS skada eller mistargeting i ICM och intraspinal injektioner, respektive. Observera också att en kompletterande högupplöst konfokal analys av angränsande vertebrala segment måste utföras, som anges ovan, för att bedöma förekomsten av injicerade spårämne insidan av lymfkärlen. Denna analys kräver att fastställa intensitet profil tomter för spårämne och lymfatiska markör på tvärsnitt av markör-märkt lymfkärl. Detta tillvägagångssätt har tidigare använts för att demonstrera OVA555 upptag av ThLb-lymfatik vid 15 min efter injektion (Kompletterande Figur 5F i Jacob et al.14). Det har dock inte illustrerats för anti-LYVE1-spårämnet i den föreliggande studien (Figur 4).
Bland möjliga CSF-spårämnen är OVA-A555 ett utmärkt alternativ eftersom det är resistent mot iDISCO+ protokollbehandlingar och upprätthåller hög fluorescens för LSFM-avbildning. Observera dock att typen av spårämne måste väljas i enlighet med analystidpunkten (tabell 1 och tabell 2). Som rapporterats ovan observeras OVA-A555-märkning av lokala vertebrat lymfkärl vid 15 min efter injektion14. OVA-A555 detekteras dock inte längre i dessa lokala lymfatiska kretsar vid 45 min efter injektionen (Figur 3) i motsats till anti-LYVE1-antikroppen (Figur 4).
Som avslutning är iDISCO+/LSFM-protokollet väl anpassat för att undersöka 3D-strukturen och dräneringen av det CNS-associerade lymfsystemet i fysiologiska och patologiska tillstånd som CNS och vertebrala kolonncancer, eller vertebrala ben- och ledsjukdomar. Även om det fullständiga förfarandet är långt och kräver metodologisk stringens, ger det värdefull, unik information när den används med kompletterande analys med hjälp av verktyg för virtuell verklighet och högupplöst konfokal avbildning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Maturation (till L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ för J.B.), NIH (R01EB016629-01) och Yale School of Medicine. Vi erkänner ICM plattformarna: ICM-QUANT för cellulära imaging och ICM-histomics för immunohistokemi. Allt djurarbete utfördes vid pheno-ICMice-anläggningen. Kärnan stöds av 2 "Investissements d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 och ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) och "Fondation pour la Recherche Médicale". Vi erkänner Nicolas Renier för metodråd och manuskriptläsning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
| Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
| Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
| Needles 26G (0.45x13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
| Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
| Microscopes and imaging softwares | |||
| AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
| Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
| Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
| LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
| Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
| Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
| Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
| Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
| Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
| Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
| Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
| Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
| Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
| Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
| Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
| Surgical tools and equipments | |||
| Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
| Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
| Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
| Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
| Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
| Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
| Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
| Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |
References
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M. Implications of the discovery of brain lymphatic pathways. The Lancet Neurology. 14 (10), 977 (2015).
- Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
- Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
- Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
- Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
- Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
- Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
- Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9 (2010).
- Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
- Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
- Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
- Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: a tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
