ड्रोसोफिला में अल्कोहल संवेदनशीलता को मापने के लिए वर्तमान तरीके मक्खियों के समूहों का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। हम एक मक्खियों की बड़ी संख्या में शराब सेडान संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक सरल, कम लागत, उच्च थ्रूपुट परख पेश करते हैं । विधि विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और आम सामग्री का उपयोग कर किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है।
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर शराब संवेदनशीलता के आनुवंशिक आधार का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है। मानव आबादी में अध्ययन के विपरीत, ड्रोसोफिला मॉडल आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर सख्त नियंत्रण की अनुमति देता है, और एक ही जीनोटाइप के व्यक्तियों की लगभग असीमित संख्या नियामक प्रतिबंधों के बिना और अपेक्षाकृत कम लागत पर अच्छी तरह से नियंत्रित पर्यावरणीय स्थितियों के तहत तेजी से पाला जा सकता है । इथेनॉल के संपर्क में आने वाली मक्खियों को शारीरिक और व्यवहार परिवर्तनों से गुजरना पड़ता है जो मानव शराब के नशे के समान होते हैं, जिसमें आसनीय नियंत्रण की हानि, आदितीकरण और सहिष्णुता का विकास शामिल है। यहां, हम एक मक्खियों की बड़ी संख्या में शराब सेडेशन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक सरल, कम लागत, उच्च थ्रूपुट परख का वर्णन करते हैं। परख एक सेट-अप में 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में संज्ञाहरण के बिना पेश की गई एकल मक्खियों की वीडियो रिकॉर्डिंग पर आधारित है जो शराब जोखिम की समकालिक दीक्षा को सक्षम बनाता है। यह प्रणाली एक व्यक्ति को 8 घंटे की कार्य अवधि के भीतर 2,000 मक्खियों पर व्यक्तिगत इथेनॉल सेडेशन डेटा एकत्र करने में सक्षम बनाती है। परख, सिद्धांत रूप में, किसी भी अस्थिर पदार्थ के संपर्क के प्रभाव का आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और अन्य मक्खी प्रजातियों सहित अन्य कीड़ों पर अस्थिर की तीव्र विषाक्तता के प्रभाव को मापने के लिए लागू किया जाता है।
शराब के दुरुपयोग और शराब पर राष्ट्रीय संस्थान की रिपोर्ट है कि २०१५ अत्यधिक शराब की खपत में, “शराब का उपयोग विकार” के रूप में नामित, संयुक्त राज्य अमेरिका में एक अनुमान १६,०००,००० लोगों को प्रभावित किया । शराब के दुरुपयोग प्रतिकूल शारीरिक प्रभाव की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बनता है और अमेरिका में मौत का एक प्रमुख कारण है मनुष्यों में, संवेदनशीलता में कमी, या शराब के प्रति प्रतिक्रिया का एक निम्न स्तर, एक मजबूत आनुवंशिक घटक होता है और शराब के उपयोग के विकारोंको विकसितकरने के उच्च जोखिम से जुड़ा होता है1,2,,3,4।4 मानव आबादी पर आनुवंशिक जोखिम अध्ययन जनसंख्या मिश्रण, विविध विकासात्मक इतिहास और पर्यावरण जोखिम के कारण चुनौतीपूर्ण हैं, और शराब से संबंधित फेनोटाइप की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्वयं-रिपोर्ट प्रश्नावली पर निर्भरता, जो अक्सर अन्य न्यूरोसाइकियाट्रिक स्थितियों के साथ चकित होते हैं।
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ,अल्कोहल संवेदनशीलता5,6,7,,8के आनुवंशिक आधार का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है । ड्रोसोफिला मॉडल आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर सख्त नियंत्रण की अनुमति देता है, और एक ही जीनोटाइप के व्यक्तियों की लगभग असीमित संख्या नियामक प्रतिबंधों के बिना और अपेक्षाकृत कम लागत पर अच्छी तरह से नियंत्रित पर्यावरणीय स्थितियों के तहत तेजी से पाला जा सकता है । सार्वजनिक रूप से उपलब्ध उत्परिवर्तन ों और आरएनएआई लाइनों के अलावा जो जीनोम में अधिकांश जीनों को लक्षित करते हैं, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जेनेटिक रेफरेंस पैनल (DGRP), पूर्ण जीनोम दृश्यों के साथ 205 नस्ल जंगली-व्युत्पन्न लाइनों की आबादी की उपलब्धता, जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन9,,10सक्षम है। इस तरह के अध्ययनों ने विकास के समय पर पड़ने वाले प्रभावों और इथेनॉल11,12 के विकास पर व्यवहार्यता से जुड़े आनुवंशिकनेटवर्कों कीपहचान की है । मौलिक जैविक प्रक्रियाओं का विकासवादी संरक्षण अनुवादीय निष्कर्षों को उनके फ्लाई समकक्षों पर मानव ऑर्थोलोग्स को सुपरथोपकर तैयार करने में सक्षम बनाता है।
इथेनॉल के संपर्क में आने वाली मक्खियों को शारीरिक और व्यवहार परिवर्तनों से गुजरना पड़ता है जो मानव शराब के नशे के समान होते हैं, जिसमें आसनीय नियंत्रण8,सेडेशन की हानि और सहिष्णुता का विकास13,,14,,15शामिल है। ड्रोसोफिला में अल्कोहल प्रेरित सेडक्शन को एरेब्रिओमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। ये 122 सेमी लंबे ऊर्ध्वाधर कांच के स्तंभ हैं जिनमें तिरछा जाल विभाजन होता है जिससे मक्खियां16,17,18को संलग्न कर सकती हैं । कॉलम के शीर्ष में कम से कम 50 मक्खियों (लिंगों का अलग से विश्लेषण किया जा सकता है) का एक समूह पेश किया जाता है और इथेनॉल वाष्प के संपर्क में आता है। मक्खियों कि स्तंभ के माध्यम से आसनीय नियंत्रण गिर खो देते हैं और 1 मिन अंतराल पर एकत्र किए जाते हैं। मतलब elution समय शराब के नशे के प्रति संवेदनशीलता का एक उपाय के रूप में कार्य करता है। जब मक्खियों को पहले एक्सपोजर से उबरने के बाद दूसरी बार शराब के संपर्क में आता है, तो वे सहिष्णुता विकसित कर सकते हैं, जैसा कि मतलब एल्यूशन समय13,,15,,19,,20में बदलाव से स्पष्ट है। जबकि इनेब्रियोमीटर परख जीन, आनुवंशिक नेटवर्क, और सेलुलर शराब से छुटकारा संवेदनशीलता और सहिष्णुता के विकास के साथ जुड़े रास्तों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है12,,13,,14,,21,परख समय लेने वाली है, कम थ्रूपुट, और एक मक्खियों में शराब संवेदनशीलता को मापने के लिए अप्रभावी ।
वैकल्पिक इथेनॉल सेडेशन परख ों में कहा गया है कि अधिक सुविधाजनक मापन के लिए विस्तृत एरेब्रिओमीटर सेट -अप की अनुमति की आवश्यकता नहीं है , लेकिन अभी भी थ्रूपुट में सीमित हैं और आम तौर पर21,,22,,23,24,25व्यक्तियों के बजाय मक्खियों के समूहों के विश्लेषण की आवश्यकता होती है । एकल मक्खियों का आकलन समूह बातचीत के कारण भ्रामक प्रभावों की क्षमता को कम करता है, जैसे कि सामाजिक व्यवहार से उपजी। यहां, हम एक मक्खियों की बड़ी संख्या में शराब सेडेशन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक सरल, कम लागत, उच्च थ्रूपुट परख पेश करते हैं।
यहां, हम ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टरमें इथेनॉल एक्सपोजर के कारण सेडक्शन समय का आकलन करने के लिए एक सरल, सस्ती और उच्च-थ्रूपुट विधि प्रस्तुत करते हैं। कई वर्तमान तरीकों के विपरीत, जिन्हें समूह विश्लेषण की आवश्यकता होती है, यह परख एक व्यक्ति को 8 घंटे की कार्य अवधि के भीतर ~ 2,000 मक्खियों के लिए व्यक्तिगत सेडेशन समय डेटा एकत्र करने में सक्षम बनाता है। हमने पाया कि एक व्यक्ति लगभग 5 मिन में सेडेशन समय के लिए 48 मक्खियों का स्कोर कर सकता है। इस दर पर, लगभग 4 घंटे में 2,000 मक्खियों को बनाए जा सकते हैं, हालांकि स्कोरिंग बाद में आयोजित की जा सकती है। हमारी परख के साथ, अधिकांश मक्खियों के लिए रिकॉर्ड किया गया सेडेशन समय 100% इथेनॉल के 1 मिलील के संपर्क में 5-15 किमी से होता है। इथेनॉल या छोटे वितरण की मात्रा की कम सांद्रता के परिणामस्वरूप लंबे समय तक सेडेशन समय होगा।
आद्य काल का आकलन करने के लिए वर्तमान तरीकों के लिए बड़ी संख्या में मक्खियों का परीक्षण करना होता है , बिना आसानी से एकल व्यक्तियों परमाप न हो 15,16,17,18,19,20 ,21,,22,23,24,25,26.21 कई वर्तमान आसीन और संवेदनशीलता परसों ST5022,,23,,24पर भरोसा करते हैं, जिस समय बिंदु पर 50% मक्खियों को इथेनॉल एक्सपोजर के परिणामस्वरूप दिया जाता है। यद्यपि मक्खियों के समूहों के लिए एसटी50 प्राप्त करना इस परख को विकसित करने के लिए प्राथमिक प्रेरणा नहीं थी, वीडियो रिकॉर्डिंग वर्तमान तरीकों की तुलना में उच्च उपयोगिता प्रदर्शित करती है, क्योंकि रिकॉर्डिंग का उपयोग व्यक्तिगत रूप से परीक्षण की गई मक्खियों के समूहों के लिए ST50 का पता लगाने और किसी भी समय किसी दिए गए मापदंड (जैसे, आसनीय नियंत्रण की हानि) को मापने के लिए किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तरह के वीडियो विश्लेषण के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता होगी ।
वर्तमान इनेब्रियोमीटर परख के विपरीत, हम जिस विधि का वर्णन करते हैं, उसे स्थापित करने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और आम सामग्रियों का उपयोग करके किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके, हमने व्यक्तिगत मक्खियों के लिए विश्वसनीय और सुसंगत विच्छेदन समय प्राप्त किया है। परख, सिद्धांत रूप में, किसी भी अस्थिर पदार्थ के संपर्क के प्रभाव का आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । परख अन्य मक्खी प्रजातियों सहित अन्य कीड़ों पर अस्थिर की तीव्र विषाक्तता के प्रभाव को मापने के लिए भी लागू किया जा सकता है। डीजीआरपी जैसी आबादी के भीतर फेनोटाइपिक भिन्नता की सीमा का आकलन करने के लिए व्यक्तिगत सेडेशन टाइम डेटा का उपयोग किया जा सकता है।
हमने इथेनॉल समाधान के साथ सीधे संपर्क को रोकने के लिए छोटे कीट स्क्रीन जाल का उपयोग किया, जबकि पर्याप्त मात्रा में इथेनॉल वाष्प को फ्लाई तक पहुंचने की अनुमति दी। स्क्रीन जाल के शीर्ष पर सफेद चीज़क्लोथ की परत फ्लाई और नीचे की सतह के बीच दृश्य विपरीत प्रदान करती है और यह सुनिश्चित करती है कि मक्खियों को स्क्रीन जाल में पकड़ा न जाए, जिससे आसनीय नियंत्रण के नुकसान का अस्पष्ट निर्धारण हो सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध झिल्ली जो पानी और हवा के लिए असुरक्षित हैं, ने असंगत परिणाम दिए और इथेनॉल वाष्प के लिए अपर्याप्त रूप से दंडित किए गए थे। हमने जानबूझकर छोटे कीट स्क्रीन जाल का उपयोग किया क्योंकि यह एक समान रूप से असुरक्षित सामग्री है जो एक कुएं के भीतर फ्लाई पोजीशन के परिणामस्वरूप इथेनॉल एक्सपोजर में भिन्नता को कम करती है। उपलब्ध सामग्रियों के आधार पर इस प्रोटोकॉल में संशोधन किए जा सकते हैं, हालांकि हम एक नियंत्रित व्यवहार कक्ष, फ्लाई के करीब 90%-100% इथेनॉल तक पहुंच और समान इथेनॉल एक्सपोजर की सलाह देते हैं।
सेल संस्कृति प्लेटों के भीतर उड़ान भरने की स्थिति स्थितीय पूर्वाग्रह से बचने के लिए प्रतिकृति के बीच यादृच्छिक होना चाहिए। बड़े प्रयोगों के लिए जिन्हें कई दिनों में इस परख के उपयोग की आवश्यकता होती है और इसलिए पर्यावरणीय भिन्नता के अधीन हैं जो परख के परिणामों (उदाहरण के लिए, बैरोमेट्रिक दबाव में परिवर्तन) को प्रभावित कर सकते हैं)27,हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि मक्खियों का परीक्षण हर दिन एक ही समय में किया जाए और दोनों दिनों के भीतर और पूरे दिनों यादृच्छिक हो, खासकर यदि विभिन्न लाइनों और/या लिंगों की तुलना एक दूसरे के खिलाफ की जानी है।
हमारे द्वारा विकसित विधि तीव्र अल्कोहल एक्सपोजर के प्रभाव को मापने के लिए सबसे उपयुक्त है लेकिन खपत डेटा या मॉडलिंग की लत प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है। हालांकि, इस परख से प्राप्त अल्कोहल सेअधिक संवेदनशीलता डेटा को शराब से संबंधित फेनोटाइप के अन्य उपायों के साथ एकीकृत किया जा सकता है। सिस्टम की एक सीमा यह है कि मानक सेल संस्कृति प्लेटों की ऊर्ध्वाधर ऊंचाई ऊर्ध्वाधर फ्लाई आंदोलन के लिए अनुमति देती है जिसे समग्र गतिविधि या लोकोमोशन के विस्तृत मूल्यांकन के लिए वीडियो द्वारा आसानी से ट्रैक नहीं किया जा सकता है। हालांकि, यह सीमा सेडेशन समय के सटीक आकलन को प्रभावित नहीं करती है। विभिन्न जीनोटाइप (उदाहरण के लिए, DGRP-व्युत्पन्न आउटब्रीड आबादी28)की मक्खियों का उपयोग करते समय, यह परख भी व्यक्तिगत मक्खियों को थोक डीएनए अनुक्रमण और चरम क्यूटीएल मानचित्रण29,,30के लिए विषम फेनोटाइप के साथ मक्खियों के पूल इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है। कुल मिलाकर, यह परख एक मक्खियों की बड़ी संख्या पर शराब से छुटकारा डेटा के तेजी से, सस्ती संग्रह की अनुमति देता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से टीएफसीएम व आरआरएचए को अनुदान डीए041613 व जीएम 128974 द्वारा समर्थन दिया गया।
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |