Behavior

שיטת תפוקה גבוהה עבור מדידת אלכוהול הרגעה זמן של הפרט דרוזופילה מלאנוגסטר

Published: April 20, 2020 doi: 10.3791/61108

Tatum N. Sass*¹, Rebecca A. MacPherson*¹, Trudy F. C. Mackay¹, Robert R. H. Anholt¹

¹Department of Genetics and Biochemistry and Center for Human Genetics, Clemson University

* These authors contributed equally

Summary

שיטות נוכחיות למדידת רגישות האלכוהול בדרוזופילה נועדו לבחון קבוצות של זבובים. אנו מציגים בקלות, בעלות נמוכה, התפוקה גבוהה הערכה להערכת רגישות הרגעה אלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים. השיטה אינה דורשת כלים מיוחדים וניתן לבצעו בכל מעבדה המשתמשת בחומרים משותפים.

Abstract

Drosophila ילה melanoster מספק מודל מצוין כדי ללמוד את התחתון הגנטי של רגישות לאלכוהול. בניגוד למחקרים באוכלוסיות אנושיות, דגם Drosophila ילה מאפשר שליטה קפדנית על רקע גנטי, ולמעשה מספר בלתי מוגבל של אנשים מאותו גנוטיפ ניתן לגדל במהירות בתנאים סביבתיים מבוקרת היטב ללא הגבלות רגולטוריות בעלות נמוכה יחסית. זבובים חשופים לאתנול עוברים שינויים פיסיולוגיים והתנהגותיים הדומים לשכרות אלכוהול אנושיים, כולל אובדן שליטה באמצעות הרדמה, הרגעה ופיתוח של סובלנות. כאן, אנו מתארים פשוט, בעלות נמוכה, התפוקה הגבוהה שיטת להערכת רגישות הרגעה לאלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים. העיבוד מבוסס על הקלטת וידאו של זבובים בודדים הציג ללא הרדמה ב 24-היטב לוחיות התרבות התא בהגדרה המאפשרת חניכה סינכרונית של חשיפה לאלכוהול. המערכת מאפשרת לאדם אחד לאסוף נתונים בודדים הרדמה האתנול על רבים כמו 2,000 זבובים בתוך תקופת עבודה של 8 h. האפשרות, בעיקרון, להיות מורחבת כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה לכל חומר נדיף ולהחיל על השפעות מדידה של רעילות חריפה של וולאטיקלס על חרקים אחרים, כולל מינים אחרים זבוב.

Introduction

המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ו אלכוהוליזם מדווח כי ב 2015 צריכת אלכוהול מוגזמת, המיועד כ "הפרעת שימוש באלכוהול", השפיעו על 16,000,000 אנשים בארצות הברית. שימוש לרעה באלכוהול גורם למגוון רחב של תופעות פיזיולוגיות לוואי והוא הגורם העיקרי למוות בארה ב. בבני אדם, רגישות מופחת, או רמה נמוכה של תגובה לאלכוהול, יש מרכיב גנטי חזק והוא קשור לסיכון גבוה יותר לפתח הפרעות שימוש באלכוהול¹^,²^,³^,⁴. מחקרי הסיכון הגנטי על אוכלוסיות אנושיות מאתגרת בגלל מוספים לאוכלוסיה, היסטוריה התפתחותית מגוונת וחשיפות סביבתיות, והסתמכות על שאלונים שדווחו על-ידי ככמת להפנוטיפים הקשורים לאלכוהול, אשר לעיתים קרובות מבולבל בתנאים נוירופסיכיאטריים אחרים.

Drosophila ילה melanoster מספק מודל מצוין כדי ללמוד את התחתון הגנטי של רגישות לאלכוהול⁵^,⁶^,⁷^,⁸. דגם Drosophila ילה מאפשר שליטה קפדנית על הרקע הגנטי, וכמעט מספר בלתי מוגבל של אנשים מאותו גנוטיפ אותו ניתן לגדל במהירות תחת תנאים סביבתיים מבוקרת היטב ללא הגבלות רגולטוריות בעלות נמוכה יחסית. בנוסף על מוטציות זמינות בפומבי ו rnai קווים היעד רוב הגנים בגנום, הזמינות של הפאנל התייחסות גנטית של drosophila ילה מלאנוסטר (DGRP), אוכלוסיה של 205 שורות מלאות פראי עם רצפי הגנום המלא, אפשרה הגנום⁹הרחב לימודי^{התאגדות 9,}¹⁰. מחקרים כאלה זיהו רשתות גנטיות הקשורות להשפעות על זמן פיתוח וכדאיות על חשיפה התפתחותית לאתנול¹¹^,¹². שימור אבולוציוני של תהליכים ביולוגיים בסיסיים מאפשר להסיק מסקנות על ידי הטלת הרושם האנושי על עמיתיהם הטסים.

זבובים חשופים לאתנול עוברים שינויים פיסיולוגיים והתנהגותיים הדומים לשיכרון אלכוהול אנושי, כולל אובדן שליטה בפוסט-טראומטית⁸, הרגעה ופיתוח של סובלנות¹³^,¹⁴^,¹⁵. ניתן לכמת את השפעת ההרדמה בדרוסופילה באמצעות inebriometers. אלה הם 122 ס מ לאורך עמודות זכוכית אנכית עם מחיצות רשת משופע שבהם זבובים יכולים לצרף¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. קבוצה של לפחות 50 זבובים (המינים יכולים להיות מנותח בנפרד) מוצגים בחלק העליון של הטור וחשופים אדים אתנול. זבובים שאיבדו את השליטה בדואר האלקטרוני נופלים דרך הטור ונאספים במרווחי זמן של 1 דקות. הזמן הממוצע משמש מידה של רגישות הרעלת אלכוהול. כאשר זבובים חשופים אלכוהול בפעם השנייה לאחר שהחלים מן החשיפה הראשונה, הם יכולים לפתח סובלנות, כפי שניכר מתוך משמרת מתכוון הימנעות ממוצע זמן¹³^,¹⁵^,¹⁹^,²⁰. בעוד inebriometer בחני הובילו לזיהוי של גנים, רשתות גנטיות, ומסלולים סלולריים הקשורים עם רגישות הרגעה לאלכוהול ופיתוח של סובלנות¹²^,¹³^,¹⁴^,²¹, את היכולת לגזול זמן רב, תפוקה נמוכה, ולא יעיל למדידת רגישות לאלכוהול בזבובים בודדים.

הרגעה האתנול האלטרנטיבי בחני כי לא דורשים את הגדרת inebriometer מורכבים לאפשר מדידות נוח יותר אבל הם עדיין מוגבלים תפוקה בדרך כלל דורשים ניתוחים של קבוצות של זבובים ולא יחידים²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. הערכת זבובים בודדים מקטינה את הפוטנציאל להשפעות מייסדים עקב אינטראקציות קבוצתיות, כגון אלה הנובעות מהתנהגויות חברתיות. כאן, אנו מציגים בקלות, בעלות נמוכה, שיטת תפוקה גבוהה להערכת רגישות הרגעה לאלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים.

Protocol

1. בניית מנגנוני הבדיקה

יצירת תבנית קרטון בגודלה של צלחת תרבות תא בעלת 24 תאים על-ידי עקיבה סביב הצלחת על קרטון וגזירת האזור המיועד.
חותכים פיסת רשת קטנה של מסך חרק בגודל צלחת תרבות התא באמצעות תבנית קרטון משלב 1.1.
הכנת צלחת התרבות תא 24 היטב על ידי הצבת קו קטן של דבק חם סביב היקף החלק העליון של הצלחת באמצעות אקדח דבק חם ותיקון שינוי המסך על גבי הבארות פתוח.
אבטחת מלאכה עץ מקל כל אחד משלושת הצדדים של אותה צלחת תרבות התא משלב 1.3 באמצעות אקדח דבק חם. לוח תרבות התא המתוקן אמור להידמות כעת לדיאגרמת הצלחות המוצגת באיור 1A ובכיוונון הנסיוני המוצג באיור 2.
הערה: הכינו לפחות מספר רב של לוחיות הזיהוי התאים שיתאימו לתאי הצילום (ראו להלן).

איור 1: תרשים מנגנון הבדיקה וחדר הצילום. (A) דיאגרמות עליונות. התצוגות העליונות, הצדדיות והקדמיות של מנגנוני הבדיקה מוצגות, בהתאמה. רשת שינוי של המסך מטילה על גבי צלחת תרבות התאים 24 היטב. כלי השיט מעץ, המיוצגים על ידי ראשי החצים, מחוברים לשלושה צדדים סמוכים ליציבות ולעזר היישור, שניים בצד צלחת הבאר עם שש בארות ואחד בצד הצלחת עם ארבע בארות. כל הקבצים המצורפים חמים מודבקים על המנגנון. (ב) דיאגרמות נמוכות יותר. התצוגות העליונות, הצדדיות והקדמיות של הגדרת הערכה מוצגות, בהתאמה. חתך מצדו הימני של הקופסה, מפתח המכסה ועד לחלק האחורי של הפתח, עם החלק התחתון של רמת החתך אל המשטח הפנימי. החור בראש התיבה, המשטח המקביל לקרקע, ממורכז לחשיפה מקסימלית של וידאו. התיבה המוצלת מייצגת את מצלמת הווידיאו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: צילום של מערכת השיטה. מצלמת הווידיאו מונחת על גבי תא הפוליסטירן, כשהעדשה מוכנסת לחור החתוך, מומחש בדיאגרמות של איור 1B. שני סטים של שינוי היטב של תרבות תא התאים משענת על גבי משטח התאורה כי הוא הוכנס לחתוך דרך הצד של החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. בניית חדר הצילום

צור תא צילום על ידי חיתוך חור בגודל של עדשת מצלמת הוידיאו בצד של התיבה פוליסטירן. חותכים תוספת לרוחב של משטח התאורה בצדו הנגדי של הפוליסטירן. חדר הצילום אמור להידמות לחדר הצילום המוצג באיור 1B ובאיור 2.
הכן את חדר הצילום לשימוש על-ידי החדרת משטח התאורה לתוך החריץ והצבת המצלמה בחור העדשה מעל למשטח התאורה.
מניחים את כל החומרים ולבצע את כל הבדיקות העוקבות בסביבה מבוקרת, רצוי חדר התנהגותית עם כ 30% לחות, 25 ° c טמפרטורה, זרימת אוויר אחיד, ורמות רעש פחות מ 65 dB.

3. הכנת מנגנון הבדיקה והזבובים

פיפטה 1 מ ל של 100% אתנול דרך המסך שינוי לתוך כל טוב.
יבש את שינוי המסך עם פיסת גזה.
חותכים שתי חתיכות של גזה את הממדים של צלחת תרבות התא באמצעות תבנית קרטון שנוצר בשלב 1.1. מניחים אותם על גבי רשת המסך היבש של הצלחת תרבות התא שונה המכיל אתנול משלב 3.2.
צור חתיכה קטנה של לוח חיתוך פלסטיק דק וגמיש על-ידי מעקב סביב תבנית קרטון שנוצרה בשלב 1.1 כמדריך כללי והרחבת אזור המעקב באמצעות 1 – 2 ס"מ על אחד הצדדים הקצרים. לגזור את האזור המורחב מעקב מלוח דק, גמיש חיתוך פלסטיק. לאחר גזירה, להבטיח כי פלסטיק עדיין מתאים בין שלוש מקלות כלי השיט מעץ על מנגנון הבדיקה, אבל מתנתק קצה אחד על ידי 1 – 2 ס"מ.
אופציונלי אם צריך ליצור מייבש שמנת, להרכיב מייבש כמו זה המוצג באיור 3 על ידי הראשון חיתוך P1000 מראה הצינורות לחצי. הוסף את פיסת עם קוטר גדול לקצה אחד של ~ 30 ס"מ פיסת צינורות גמישים לשמש כפייה.

איור 3: שופית זבוב שבו זבובים נאספים עם שומה להחלפה מחוברת אבובים גמיש ומלא משעמם עם פקק של גזה כותנה. המפעיל יכול לאכול זבוב אחד. לתוך הפיפטה להעברה ללא הרדמה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אופציונלי כדי להשלים את ההרכבה מייבש, לכסות את הקצה הרחב של 10 ס"מ פיסת הצינור סרולוגית עם גזה כדי למנוע זבובים להיכנס אבובים ולהכניס את הפיפטה, גזה הראשון, לתוך הקצה הפתוח של אבובים לשמש תא זבוב. מייבש האספירין צריך להידמות. לזה שמוצג באיור 3
באמצעות מייבש (איור 3, שלבים 3.5 ו 3.6), לייבש זבוב אחד לתוך לוחית נפרד 24-היטב התרבות התא. השתמש בפלסטיק גמיש כדי לכסות כל בארות המכילות זבובים משופחת קודם לכן. הקלט את המיקום היטב ואת כל גנוטיפ רלוונטיים או מידע פנוטיפ של כל זבוב.
להחזיק את הסומק פלסטיק גמיש עם החלק העליון של הלוח תרבות התא המכיל את הזבובים כדי למנוע בריחה שלהם להפוך את הצלחת אל החלק העליון של הצלחת תרבות התא שונה עם האתנול. הסדין של פלסטיק גמיש צריך להיות נח על גבי גיליונות של גזה. ליישר את הלוח הפוך תרבות התא המכיל זבובים באמצעות מקלות מלאכת יד כדי להבטיח כל טוב עם אתנול מיישרת עם כל היטב המכיל זבוב.
הכיוונון הנסיוני צריך להידמות לאיור 2.

4. בדיקת הזבובים

ודא שמשטח התאורה דולק בבהירות מלאה לניגודיות חזותית מקסימלית. התחל להקליט עם מצלמת הווידיאו.
כדי לחשוף את הזבובים כדי אתנול, בזהירות להסיר את הפלסטיק מבין צלחת הבאר ומכשיר הבדיקה, מטפלת לא לנתק את גזה.
לסיים את הקלטת וידאו פעם אחת כל הזבובים איבדו את השליטה הפוסט. ברגע שהוא חשוד כי כל הזבובים איבדו את השליטה הפוסט, הקש בחוזקה במרכז הלוח כדי להבטיח כי כל הזבובים יש אובדן מוחלט של שליטה בדואר. , אם יש תזוזה. המשיכי להקליט המשך להקיש מדי פעם (כל 1 – 2 דקות) עד ששום תנועה לא תתרחש.
אופציונלי כדי לשחזר במהירות את הזבובים, להסיר את הצלחת העליון ממנגנון הבדיקה, חשיפת זבובים מסומם נח על גזה. מנושף זבובים בודדים לתוך מכולות שנבחרו להתאוששות.
החלף את האתנול בלוחות תרבות התא ששונתה עם 1 מ ל של טרי 100% אתנול לפחות 1 x כל שעה כדי לשלוט על אידוי ומחולל לחות של האתנול וכדי לשמור על חשיפה לאתנול עקבי לאורך הזמן. יבש את שינוי המסך עם גזה.
חזור על הפעולה לקבלת דגימות רבות ככל שתרצה.
הערה: לתפוקה הגבוהה ביותר, המשך הסיבוב הבא של זבובים ללוחות של תרבות התא החדשה במהלך הקלטת וידאו. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן, כמו הקלטת וידאו ניתן לסקור מאוחר יותר.

5. קביעת זמן הרגעה לטיסה

הקלטת זמן הרגעה עבור כל זבוב בודד על ידי צפייה בהקלטת וידאו. זמן ההרדמה מוגדר כרגע זבוב מאבד שליטה מלאה הפוסט ויכולת locomotor. מומלץ לצפות בסרט הפוך ולתעד את הזמן שהזבוב מתחיל לנוע כדי להבטיח דיוק.

Representative Results

2 24-גם צלחות microtiter יכול ליצור נתונים בו על 48 זבובים בודדים בתוך קטן כמו 10 דקות. Table 1 רשימות מדידות של זמני הרגעה אתנול עבור 48 בודדים זבובים, זכרים ונקבות בנפרד, של שני קווים DGRP עם רגישויות שונות לחשיפה לאלכוהול על זמן פיתוח ויכולת קיום¹³. זבובים של קו RAL_555 היו פחות רגישים מאשר קו RAL_177 (איור 4, טבלה 2; p < 0.0001, ANOVA). זכרים ונקבות של RAL_177 הראו לא השפעה מינית (איור 4, שולחן 2; p > 0.1, ANOVA), בעוד נקבות של קו RAL_555 היו רגישים פחות לחשיפה אתנול מאשר הזכרים (איור 4, טבלה 2; p < 0.006, ANOVA). המספר הגדול של הזבובים שניתן למדוד בו זמנית את היכולת למדוד המינים ושורות שונות contemporaneously יכול להגביר את הדיוק על ידי הפחתת שגיאה בשל וריאציה סביבתית.

קצת.	זמן הרגעה של אתנול						B.	זמן הרגעה של אתנול
	נקבות			זכרים				נקבות			זכרים
	414	365	477	423	568	309		937	742	622	460	331	498
	201	384	498	411	523	626		791	619	197	467	455	562
	228	364	333	440	403	267		504	744	513	570	582	506
	440	416	404	408	422	384		970	540	369	865	533	492
	888	283	285	322	369	287		595	550	606	392	544	345
	1079	519	315	393	376	284		418	709	553	308	477	388
	718	287	432	275	206	411		366	564	558	385	576	377
	598	337	398	279	631	372		437	692	578	460	511	412
	241	398	364	347	374	808		665	729	484	532	425	354
	229	423	534	386	396	628		312	576	305	334	531	506
	388	488	451	523	322	533		682	638	420	560	548	379
	252	529	375	427	330	540		1045	741	708	832	509	472
	674	401	303	401	307	311		394	675	381	477	449	784
	303	453	351	429	525	262		540	690	520	556	495	226
	258	483	302	389	562	319		356	615	336	454	524	590
	346	426	385	416	596	287		626	678	840	634	677	509

שולחן 1: מדידות של האתנול פעמים (s) של הDGRP שורות בודדות של (א) קווי הרגעה RAL_177 ו (ב) RAL_555 למינים נפרדים (n = 48). ראה גם טבלה 2, איור 4.

איור 4: זמני הרדמה לאלכוהול של קווי DGRP RAL_177 ו RAL_555. העמודות מייצגות את האמצעים ואת קווי השגיאה SEM (n = 48). זמני הרגעה עבור RAL_177 זבובים היו פחות אלה עבור RAL_55 זבובים (p < 0.0001, ANOVA). נקודות נתונים בודדות מצוינות בטבלה 1. הבדלים משמעותיים סטטיסטית נוספים בין המינים והקווים מצוינים בטקסט ובטבלה 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח	מקור הווריאציה	df	האס	ערך F	ערך פי
מודל מלא במאגר	קו	1	769627	34.869	< 0.0001
	סקס	1	105001	4.757	0.0304
	קו x סקס	1	86021	3.897	0.0498
	שגיאה	188	4149491
מופחתת מודל נקבות	קו	1	685126	23.58	< 0.0001
מופחתת מודל נקבות	שגיאה	94	2730718
מופחתת גברים מודל	קו	1	170522	11.3	0.0011
מופחתת גברים מודל	שגיאה	94	1418774
דגם מופחת RAL_177	סקס	1	473	0.023	0.8800
דגם מופחת RAL_177	שגיאה	94	1943741
דגם מופחת RAL_555	סקס	1	190549	8.12	0.0054
דגם מופחת RAL_555	שגיאה	94	2205751

טבלה 2: ניתוח של סטיה לזמן הרגעה לאורך המין ו DGRP קו. המודל שהיה Y בשימוש היה Y L = μ + s + lxs + ε, כאשר μ הוא הממוצע הכולל, L הוא האפקט הקבוע של הקו DGRP (RAL_177, RAL_555), S הוא האפקט הקבוע של מין (זכר, נקבה), lxs הוא מונח האינטראקציה (קבוע), ו ε הוא מונח השגיאה. המודלים Y = μ + L + ε ו- Y = μ + S + ε שימשו למודלים הפחיתו. קו, סקס, המונח אינטראקציה קו x היחסים היו משמעותיים בדגם המלא ב α < 0.05. מופחת דגמים על ידי סקס DGRP line RAL_555 היו משמעותיים גם ב α < 0.01. ראה גם טבלה 1, איור 4. df = דרגות של חופש, SS = הקלד אני סכומי ריבועים.

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה, זולה, תפוקה גבוהה להערכת זמן הרגעה עקב חשיפה אתנול ב Drosophila ילה melanogaster. שלא כמו שיטות נוכחיות רבות, הדורשות ניתוח קבוצתי, שיטה זו מאפשרת לאדם אחד לאסוף נתוני זמן הרגעה בודדים עבור ~ 2,000 זבובים בתוך תקופת עבודה של 8 h. מצאנו כי אדם אחד יכול להבקיע 48 זבובים בזמן ההרדמה בערך 5 דקות. בקצב זה, 2,000 זבובים יכולים להיות הבקיע כ 4 h, אם כי הבקיע ניתן לנהל מאוחר יותר. עם הצורך שלנו, זמן ההרדמה מוקלט עבור רוב הזבובים נע בין 5-15 דקות בחשיפה ל 1 mL של 100% אתנול. ריכוזים נמוכים יותר של אתנול או אמצעי מסירה קטנים יותר יגרמו זמני הרגעה ארוכים יותר.

השיטות הנוכחיות להערכת זמן הרגעה דורשות בדיקת מספר גדול של זבובים מבלי לאפשר בקלות מדידות על אנשים בודדים¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶. הרגעה ורגישות הנוכחי רבים מוסר להסתמך על ST50²²^,²³^,²⁴, הזמן שבו 50% של זבובים הם הרגעה כתוצאה של חשיפה אתנול. למרות השגת ST50 עבור קבוצות של זבובים לא היתה המוטיבציה העיקרית לפיתוח הספק הזה, הקלטות וידאו להפגין שירות גבוה יותר לעומת השיטות הנוכחיות, כמו ההקלטות ניתן להשתמש כדי לוודא את ST50 עבור קבוצות של זבובים נבדק בנפרד כדי למדוד את אחוז הזבובים המקיימים קריטריון נתון (למשל, אובדן של שליטה בדואר) בכל יצוין כי ניתוח וידאו כזה ידרוש זמן נוסף.

בניגוד inebriometer assays הנוכחי, השיטה שאנו מתארים אינו דורש כלים מיוחדים להגדיר וניתן לבצע בכל מעבדה באמצעות חומרים משותפים. באמצעות שיטה זו, הצלחנו להשיג זמן הרגעה אמין ועקבי עבור זבובים בודדים. ניתן להרחיב את האפשרות, בעיקרון, להעריך את השפעות החשיפה לכל חומר נדיף. ניתן גם ליישם את האפשרות למדוד את ההשפעות של רעילות חריפה של וולאטיקלס על חרקים אחרים, כולל מינים אחרים זבוב. בודדים זמן הרגעה נתונים ניתן להשתמש כדי להעריך את מידת וריאציה פנוטימית בתוך אוכלוסיה, כגון DGRP.

השתמשנו שינוי מסך קטן של חרק כדי למנוע מגע ישיר עם פתרון אתנול תוך מתן כמויות נאותה של אדי אתנול כדי להגיע לזבוב. שכבת הגזה הלבנה על גבי רשת שינוי המסך מספקת ניגוד חזותי בין הזבוב לבין המשטח שמתחת ומבטיחה שהזבובים לא יתפסו ברשת שינוי המסך, דבר שעלול להוביל לקביעת הפסד רב-משמעי של איבוד שליטה בדואר. ממברנות זמינים מסחרית כי הם נקבובי למים ואוויר נתן תוצאות לא עקביות היו נחדרת מספיק כדי אדים אתנול. במתכוון השתמשנו בכוונת מסך קטן ברשת החרקים משום שהוא חומר נקבובי אחיד המקזער את הווריאציה בחשיפה לאתנול כתוצאה מתנוחת הזבוב בתוך הבאר. ניתן לבצע שינויים בפרוטוקול זה על בסיס חומרים זמינים, למרות שאנו ממליצים על תא התנהגותי מבוקר, גישה ל-90%-100% אתנול קרוב לזבוב, וחשיפה אחידה לאתנול.

מיקום לטוס בתוך לוחות תרבות התא צריך להיות אקראי בין משכפל כדי למנוע הטיה מיקום. לניסויים גדולים יותר הדורשים שימוש בטיפול זה לאורך ימים מרובים ולכן כפופים לווריאציה סביבתית שיכולה להשפיע על תוצאות הטיפול (למשל, שינויים בלחץ ברומטרי)²⁷, מומלץ מאוד לבדוק זבובים באותו הזמן בכל יום ובאופן אקראי הן בתוך ומעבר לימים, במיוחד אם שורות ו/או

השיטה שפיתחנו מתאימה ביותר למדידת ההשפעה של חשיפה לאלכוהול חריפה אך אינה מתאימה להשגת נתוני צריכה או התמכרות לדוגמנות. אלכוהול הרגעה רגישות נתונים שהתקבלו מתוך הנתון הזה יכול, עם זאת, להיות משולב עם אמצעים אחרים של הקשורות לאלכוהול פנוטיפים. מגבלה אחת של המערכת היא כי הגובה האנכי של הלוחות הסטנדרטיים של תרבות התא מאפשר תנועה לטוס אנכי כי לא ניתן לעקוב בקלות על ידי וידאו להערכה מפורטת של הפעילות הכללית או תנועה. עם זאת, מגבלה זו אינה משפיעה על הערכה מדויקת של זמן ההרדמה. כאשר משתמשים בזבובים של גנוסוגים שונים (למשל, ב-DGRP-נגזר האוכלוסייה²⁸), שיטת הפעולה מאפשרת גם לאחזור של זבובים בודדים כדי לאסוף בריכות של זבובים עם פנוטיפים מנוגדים עבור רצפי DNA בצובר ומיפוי qtl קיצוני²⁹^,³⁰. בסך הכל, שיטת הפעולה מאפשרת איסוף מהיר וזול של מידע על הרדמה לאלכוהול על מספר גדול של זבובים בודדים.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים DA041613 ו GM128974 מן המכונים הלאומיים לבריאות ל-TFCM ו RRHA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well Cell Culture Plates	Corning	3526	Flat-bottomed; will house flies throughout assay
Aspirator
Cheesecloth	Genesee Scientific	53-100	Widely available.
Ethanol	Decon Labs	V1001	Widely available.
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover)	Walmart	550098612	Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.
Gauze (for aspirator)	Honeywell North	67622	Widely available.
Illumination Pad	Amazon (AGPtek)	ASIN B00YA9GP0G	Any light pad to provide contrast is suitable.
Jumbo Craft Sticks	Michaels	10334892	Any craft stick at least 7 cm long is suitable.
P1000 Pipette Tip (for aspirator)	Genesee Scientific	24-165RL	Any P1000 pipette tip is suitable.
Serological Pipette (for aspirator)	Genesee Scientific	12-104
Small Insect Screen Mesh	Lowe's (Saint-Gobain ADFORS)	89322	Any small insect screen mesh is suitable.
Testing Chamber			Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.
Tygon Tubing (for aspirator)	Grainger	9CUG7	Widely available.
Video Camera	Canon	1959C001AA	Any video camera is suitable.