Современные методы измерения чувствительности к алкоголю в Дрозофиле предназначены для тестирования групп мух. Мы представляем простой, недорогой, высокопроизводительный анализ для оценки чувствительности седации алкоголя в большом количестве одиночных мух. Метод не требует специализированных инструментов и может быть выполнен в любой лаборатории с использованием общих материалов.
Drosophila melanogaster обеспечивает отличную модель для изучения генетических основ чувствительности к алкоголю. В отличие от исследований в популяциях людей, модель Дрозофилы позволяет строго контролировать генетический фон, и практически неограниченное число лиц одного генотипа может быть быстро выращено в хорошо контролируемых экологических условиях без нормативных ограничений и при относительно низких затратах. Мухи, подвергающиеся воздействию этанола, подвергаются физиологическим и поведенческим изменениям, напоминающими алкогольное опьянение человека, включая потерю постурального контроля, седацию и развитие толерантности. Здесь мы описываем простой, недорогой, высокопроизводительный анализ для оценки чувствительности седации алкоголя в большом количестве одиночных мух. Ассес основан на видеозаписи одиночных мух, введенных без анестезии в 24-хорошо клеточных культурных пластин в настройке, которая позволяет синхронное начало воздействия алкоголя. Система позволяет одному человеку собирать индивидуальные данные о седативных данных о седативных седативных данных о 2000 мух в течение 8 ч рабочего периода. Анализ в принципе может быть расширен для оценки воздействия любого летучих веществ и применяется для измерения воздействия острой токсичности летучих веществ на других насекомых, включая другие виды мух.
Национальный институт по борьбе со злоупотреблением алкоголем и алкоголизмом сообщает, что в 2015 году чрезмерное потребление алкоголя, обозначенное как “расстройство употребления алкоголя”, затронуло, по оценкам, 16 миллионов человек в Соединенных Штатах. Злоупотребление алкоголем вызывает широкий спектр неблагоприятных физиологических эффектов и является основной причиной смерти в США. У людей, снижение чувствительности, или низкий уровень реакции на алкоголь, имеет сильный генетический компонент и связанс с более высоким риском развития расстройств употребления алкоголя1,2,3,4. Генетические исследования риска в отношении популяций людей являются сложными из-за примесей населения, различных историй развития и воздействия окружающей среды, а также опоры на самостоятельно представленные вопросники для количественной оценки связанных с алкоголем фенотипов, которые часто путают с другими нейропсихиатрическими условиями.
Drosophila melanogaster обеспечивает отличную модель для изучения генетических основ чувствительности к алкоголю5,,66,7,,8. Модель Drosophila позволяет строгий контроль над генетическим фоном, и практически неограниченное число лиц одного генотипа может быть быстро выращено в хорошо контролируемых условиях окружающей среды без нормативных ограничений и при относительно низких затратах. В дополнение к общедоступным мутаций и линий РНК, которые нацелены на большинство генов в геноме, наличие Drosophila меланогастер генетической справочной панели (DGRP), популяция 205 инбредных диких линий с полными последовательностями, позволило генома всей ассоциации исследований9,10. Такие исследования выявили генетические сети, связанные с воздействием на время разработки и жизнеспособность при воздействии этанола11,12. Эволюционное сохранение фундаментальных биологических процессов позволяет сделать переводческие выводы путем наложения ортологов человека на их аналоги.
Мухи, подвергающиеся воздействию этанола, претерпевают физиологические и поведенческие изменения, напоминающие алкогольное опьянение человека, в том числе потеря постурального контроля8,седация и развитие толерантности13,,14,,15. Алкоголь индуцированного седования в Drosophila можно количественно с помощью inebriometers. Это 122 см вертикальных стеклянных колонн с наклонными сетными перегородками, к которым мухи могут прикрепляться16,,17,,18. Группа из не менее 50 мух (пол ы могут быть проанализированы отдельно) вводятся в верхней части столбца и подвергаются парам этанола. Мухи, которые теряют постуральный контроль, попадают через столбец и собираются с интервалом в 1 минуту. Среднее время элюционизма служит мерой чувствительности к алкогольной интоксикации. Когда мухи подвергаются воздействию алкоголя во второй раз после восстановления после первого воздействия, они могут развивать толерантность, как видно из изменения в среднем время elution13,15,19,20. В то время как анализы инебриометра привели к выявлению генов, генетических сетей и клеточных путей, связанных с чувствительностью седации алкоголя и развитием толерантности12,,13,,14,,21, анализ отнимает много времени, низкой пропускной связи, и неэффективным для измерения чувствительности алкоголя у одиночных мух.
Альтернативные анализы седации этанола, которые не требуют разработки настройки инебриометра позволяют более удобныеизмерения,но по-прежнему ограничены в пропускной записи и, как правило, требуют анализа групп мух, а не лиц21,22,23,24,25. Оценка отдельных мух сводит к минимуму потенциал для смешанных эффектов из-за групповых взаимодействий, таких как те, вытекающих из социального поведения. Здесь мы представляем простой, недорогой, высокопроизводительный анализ для оценки чувствительности седации алкоголя в большом количестве одиночных мух.
Здесь мы представляем простой, недорогой и высокопроизводительный метод для оценки времени седации из-за воздействия этанола в Drosophila melanogaster. В отличие от многих современных методов, которые требуют группового анализа, этот анализ позволяет одному человеку собирать индивидуальные данные о времени седативных данных для 2000 мух в течение 8 ч рабочего периода. Мы обнаружили, что один человек может забить 48 мух для седации время примерно за 5 минут. При таком темпе, 2000 мух может быть забил примерно в 4 ч, хотя забил может быть проведена позже. С нашим ассесом, записанное время седативных для большинства мух колеблется от 5-15 мин при воздействии на 1 мл 100% этанола. Более низкие концентрации этанола или меньшие объемы доставки приведут к более длительному времени седации.
Текущие методы оценки времени седации требуют тестирования большого количества мух без легко позволяющих измерений на отдельных лиц15,16,,17,,18,,19,20,,21,22,23,24,25,26. Многие текущие седативные и чувствительность анализы полагаться на ST5022,23,24, время, в котором 50% мух седативные в результате воздействия этанола. Хотя получение ST50 для групп мух не было основной мотивацией для разработки этого исследования, видеозаписи демонстрируют более высокую полезность по сравнению с современными методами, так как записи могут быть использованы для установления ST50 для групп индивидуально протестированных мух и для измерения доли мух, удовлетворяющих данному критерию (например, потеря постурального контроля) в любой момент времени. Следует отметить, что такой видеоанализ потребует дополнительного времени.
В отличие от текущих анализов инебриометра, метод, который мы описываем, не требует специализированных инструментов для настройки и может быть выполнен в любой лаборатории с использованием общих материалов. Используя этот метод, мы получили надежное и последовательное время седации для отдельных мух. Анализ в принципе может быть расширен для оценки последствий воздействия любого летучих веществ. Ассеи также может быть применен для измерения воздействия острой токсичности летучих веществ на других насекомых, в том числе других видов мух. Индивидуальные данные времени седации могут быть использованы для оценки степени фенотипических изменений в популяции, таких как DGRP.
Мы использовали небольшую сетку экрана насекомых, чтобы предотвратить прямой контакт с раствором этанола, позволяя при этом достаточное количество паров этанола достичь мухи. Слой белой марли в верхней части сетки экрана обеспечивает визуальный контраст между мухой и поверхностью ниже и гарантирует, что мухи не попадают в экранную сетку, что может привести к неоднозначному определению потери постурального контроля. Коммерчески доступные мембраны, которые являются пористыми для воды и воздуха, дали противоречивые результаты и были недостаточно проницаемы паров этанола. Мы намеренно использовали небольшую сетку экрана насекомых, потому что это равномерно пористый материал, который сводит к минимуму изменения в воздействии этанола в результате положения мухи в колодце. Изменения могут быть внесены в этот протокол на основе имеющихся материалов, хотя мы рекомендуем контролируемую поведенческую камеру, доступ к 90%-100% этанола близко к мухе, и равномерное воздействие этанола.
Положение мухи внутри пластин клеточной культуры должно быть рандомизировано между репликациями, чтобы избежать позиционного смещения. Для более крупных экспериментов, которые требуют использования этого исследования в течение нескольких дней и, следовательно, подвержены изменениям окружающей среды, которые могут повлиять на результаты анализов (например, изменения в барометрическом давлении)27, мы настоятельно рекомендуем, чтобы мухи были проверены в одно и то же время каждый день и рандомизированы как в течение и через дни, особенно если различные линии и / или полов должны быть по сравнению друг с другом.
Разработанный метод лучше всего подходит для измерения воздействия острого воздействия алкоголя, но не подходит для получения данных о потреблении или моделирования зависимости. Данные чувствительности седативных спирта, полученные в результате этого анализа, могут, однако, быть интегрированы с другими мерами фенотипов, связанных с алкоголем. Одним из ограничений системы является то, что вертикальная высота стандартных пластин клеточной культуры позволяет вертикальному движению мух, которые не могут быть легко отслежены видео для детальной оценки общей активности или передвижения. Однако это ограничение не влияет на точную оценку времени седанности. При использовании мух различных генотипов (например, в DGRP полученных выведенных выведенных инбридных популяций28),этот анализ также позволяет поиска отдельных мух для сбора пулов мух с контрастными фенотипами для массового секвенирования ДНК и экстремальных карт29,30. В целом, этот анализ позволяет быстро, недорогой сбор алкоголя седативных данных о большом количестве одиночных мух.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами DA041613 и GM128974 от Национальных институтов здравоохранения tFCM и RRHA.
24-well Cell Culture Plates | Corning | 3526 | Flat-bottomed; will house flies throughout assay |
Aspirator | |||
Cheesecloth | Genesee Scientific | 53-100 | Widely available. |
Ethanol | Decon Labs | V1001 | Widely available. |
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover) | Walmart | 550098612 | Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well. |
Gauze (for aspirator) | Honeywell North | 67622 | Widely available. |
Illumination Pad | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Any light pad to provide contrast is suitable. |
Jumbo Craft Sticks | Michaels | 10334892 | Any craft stick at least 7 cm long is suitable. |
P1000 Pipette Tip (for aspirator) | Genesee Scientific | 24-165RL | Any P1000 pipette tip is suitable. |
Serological Pipette (for aspirator) | Genesee Scientific | 12-104 | |
Small Insect Screen Mesh | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Any small insect screen mesh is suitable. |
Testing Chamber | Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box. | ||
Tygon Tubing (for aspirator) | Grainger | 9CUG7 | Widely available. |
Video Camera | Canon | 1959C001AA | Any video camera is suitable. |