Summary
Astrocytter flise hjernebarken ensartet, hvilket gør analysen af deres komplekse morfologi udfordrende på cellulært niveau. Protokollen her bruger flerfarvet mærkning baseret på in utero elektroporation til at fremhæve kortikale astrocytter og analysere deres volumen og morfologi med en brugervenlig billedanalysepipeline.
Abstract
Protoplasmiske astrocytter (PrA) placeret i musens hjernebark er tæt sammenstillet og danner en tilsyneladende kontinuerlig tredimensionel matrix på voksne stadier. Hidtil har ingen immunostaining strategi kan udpege dem ud og segmentere deres morfologi i modne dyr og i løbet af kortikogenese. Cortical PrA stammer fra forfædre placeret i dorsal pallium og kan nemt målrettes ved hjælp af i livmoderen elektroporation af integrative vektorer. En protokol præsenteres her for at mærke disse celler med den multiaddressable genom-integrerende farve (MAGIC) Markører strategi, som er afhængig af piggyBac / Tol2 gennemførelse og Cre /lox rekombination til stokastisk udtrykke forskellige fluorescerende proteiner (blå, cyan, gul og rød) rettet til specifikke subcellulære rum. Denne flerfarvede skæbne kortlægning strategi gør det muligt at markere in situ nærliggende kortikale forfædre med kombinationer af farve markører forud for starten af gliogenesis og til at spore deres efterkommere, herunder astrocytter, fra embryonale til voksne stadier på det enkelte celleniveau. Semi-sparsom mærkning opnås ved at justere koncentrationen af elektroporated vektorer og farve kontraster fra Multiaddressable Genome-Integration Color Markører (MAGIC Markører eller MM) gør det muligt at individualisere astrocytter og fremhæve deres område og komplekse morfologi på trods af deres tætte anatomiske arrangement. Præsenteret her er en omfattende eksperimentel arbejdsgang, herunder detaljerne i elektroporation procedure, multikanal billede stakke erhvervelse af konfokal mikroskopi, og computer-assisteret tre-dimensionelle segmentering, der vil gøre det muligt for eksperimentator at vurdere de enkelte PrA volumen og morfologi. Sammenfattende giver elektroporation af MAGIC Markers en bekvem metode til individuelt at mærke adskillige astrocytter og få adgang til deres anatomiske træk på forskellige udviklingsstadier. Denne teknik vil være nyttig til at analysere kortikale astrocyt morfologiske egenskaber i forskellige musemodeller uden at ty til komplekse kryds med transgene reporterlinjer.
Introduction
Astrocytter spiller mange vitale funktioner i hjernens udvikling og fysiologi1. Ved siden af deres rolle ved blod-hjerne barrieren, hvor de regulerer optagelse af næringsstoffer og blodgennemstrømning, bidrager de aktivt til synapsedannelse og funktion, mens de producerer neuromodulatorer, der kan ændre neuronal aktivitet og adfærd2. Desuden bidrager astrocyt dysfunktion til en række neurologiske lidelser3. Astrocytter placeret i hjernebarken viser en udførlig morfologi, der muliggør omfattende kontakt med neuronale processer. Disse kontakter, der er afgørende for kredsløbsfunktionen, styrer også astrocytmorfogenese og synaptogenese gennem celle vedhæftningsproteiner4. Neuroforskere har brug for praktiske og robuste værktøjer til at undersøge astrocyt udvikling og morfogenese i deres neurologiske modeller af interesse. Men på grund af den tætte apposition af astrocytter til deres naboer og deres ensartede tredimensionelle fliser, er det udfordrende at fremhæve kortikale astrocytter og omfattende vurdere deres morfologi ved hjælp af immunomarkører.
I øjeblikket gør to af de vigtigste genteknologiske strategier det muligt at mærke og individualisere kortikale astrocytter in situ: sparsom reporteraktivering i transgene muselinjer eller somatisk transgenese ved hjælp af elektroporation af reporter plasmider. Den første strategi bygger på opdræt af en floxed reporter mus linje med mus udtrykke en inducible form for Cre recombinase aktiveret specifikt i astrocytter på tamoxifen levering (f.eks Aldh1l1-CreERT25). Der er flere ulemper forbundet med denne strategi. For det første kræver avlstransgene mus et stort antal dyr, og der er typisk behov for flere analyseforanstaltninger for at bestemme den korrekte dosis tamoxifen for at give tilstrækkeligt sparsom mærkning af kortikale astrocytter. Analyse kortikale astrocyt fænotyper i en genetisk mus model af interesse vil kræve endnu mere avl og mus forbrug. Desuden, in utero tamoxifen injektion er kendt for at forstyrre parturition, hvilket gør denne strategi vanskeligt at anvende til studiet af de tidligste stadier af astrocyt udvikling. In vivo DNA-elektroporation er en alternativ tamoxifenfri strategi, der er afhængig af et minimum antal dyr6. Udføres enten på embryonale eller postnatal stadier, denne tilgang består i at injicere reporter plasmider i laterale hjertekamrene af gnavere efterfulgt af elektriske impulser, der skaber porer i cellemembranen, og dermed tillade DNA at komme ind stamceller foring hjertekammeret. Derefter behandles de reportertransgener, der bæres af de elektroporated plasmider, af de målrettede cellemaskiner og udtrykkes7. To elektroporationsmetoder er tidligere blevet beskrevet for at mærke mus kortikale astrocytter: 1) Postnatal astrocytmærkning ved elektroporation (PALE), som er afhængig af elektroporation af 1-2 enfarvet episomal reporter plasmider i tidlige postnatale stadier4; 2) StarTrack-strategien baseret på in utero electroporation (IUE) af flere ensfarvede integrative reporter plasmids8,9,10. Selvom disse to teknikker effektivt mærker PrA i hjernebarken, udgør de også nogle begrænsninger. I deres oprindelige version er begge metoder afhængige af en glial fibrillary sur protein (GFAP) promotor til at drive udtryk i astrocytter, som kan bias mærkningen mod radial glia samt pial og reaktive astrocytter, der udtrykker GFAP stærkere end normalt hvile PrA11,12. Med hensyn til PALE er andre ulemper det sene stadium af elektroporation, som forhindrer mærkning af tidlig født PrA (eller dem, der stammer fra tidlige delaminerende forfædre) og analyse af tidlige stadier af astrogliaudvikling og brugen af episomale vektorer, der bliver fortyndet gennem successive divisioner under den massive spredning, som PrA gennemgår i løbet af den første postnatal uge13,14. I modsætning til PALE er StarTrack baseret på den embryonale elektroporation af integrative reporterplasmider, der gør det muligt at spore bidraget fra både embryonale og postnatale forfædre til PrA. En opdateret StarTrack ordning bygger på ubiquitin C promotor (UbC-StarTrack)opnår bredere udtryk for fluorescerende reportere i både neuronale og glial afstamning (astrocytter inkluderet) af neurale forfædre15,16,17. I sin nuværende version er gennemførelsen af denne tilgang imidlertid kompleks, da den bygger på en ligeværdig blanding af 12 forskellige plasmider, der udtrykker seks fluorescerende proteiner (FP) med delvis excitation og emissionsspektreoverlapning.
Præsenteret her er en ligetil i livmoderen elektroporation-baserede multicolor mærkning metode ved hjælp af integrative reporter konstruktioner drevet af en stærk og bredt aktiv initiativtager til at fremhæve kortikale astrocytter14. Derudover leveres en nem billedanalysepipeline ved hjælp af både licenseret (f.eks. Imaris) og åben adgang (Vaa3D18,19,20) billedanalysesoftware til segmentering af henholdsvis astrocyt territorial volumen og arborization. Sammenlignet med de tidligere beskrevne metoder er denne strategi udelukkende baseret på 1-2 multicolor integrative transgener Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers eller MM21) rettet mod det cytoplasmiske og (eventuelt) nukleare cellerum, hvis udtryk er drevet af en syntetisk CAG-promotor bestående af en cytomegalovirusforstærker, kylling β-actin promotor, og kanin β-globin splejse acceptor site22. Dette gør det muligt at mærke og spore kortikale astrocytter, fra embryonale til sene postnatale stadier, uafhængigt af GFAP-udtryk14,23. Hver af disse transgener har følgende fire forskellige FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP og tdTomato/mCherry, som udviser minimal spektral overlapning, der let kan omgås med 1) Sekventiel kanalerhvervelse; 2) Optimeret excitation magt og indsamling gevinst; og 3) Specifikke dichroic filtre til at indsamle smalle FP emission vinduer. MM-strategien bruger Cre /lox rekombination med en selv-excisable Cre recombinase (seCre) til at køre stokastisk udtryk for FP i en cellulær befolkning. En enkelt kopi af MM transgene udtrykker FP på en gensidigt udelukkende måde, mens flere transgener giver anledning til FP kombinationer, hvilket skaber snesevis af forskellige nuancer. Genomisk integration af transgenes er drevet af piggyBac (PB) eller Tol2 gennemførelsessystem24,25,26. Derfor muliggør MM-værktøjskassen og den flerfarvede 'mosaik', som den genererer, samtidig mærkning af flere tilstødende kortikale forfædre og sporing af deres glia nedstigning, herunder kortikale astrocytter, over lange perioder. Farvekontrast som følge af udtrykket af forskellige FP tillade afgrænsning af konturen af PrA og efterfølgende udtrække vigtige oplysninger om deres territoriale volumen (ved hjælp af IMARIS) og komplekse morfologi (ved hjælp af Vaa3D). Den flerfarvede strategi, der præsenteres i detaljer her, er en praktisk og robust metode, der giver hurtig og nem adgang til den kortikale astrocytoverflade og morfologi i vilde typemus på forskellige udviklingsstadier og er let at tilpasse til at undersøge astrocytiske anatomiske træk i musemodeller af neurologiske sygdomme uden brug af transgene reporterlinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de her beskrevne dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer. Dyreprotokoller er blevet godkendt af Charles Darwin dyreforsøg etiske bord (CEEACD / N ° 5).
1. Forberedelse af endotoxinfri plasmider til MAGIC-markører i livmoderelektroporation
- Bakteriel transformation
- På is optøs DH5 alfa-kompetente celler, der opbevares ved -70 °C.
- Agarpladerne med det relevante antibiotikum (100 μg/mL ampicillin eller 50 μg/mL kanamycin) opvarmes ved 37 °C.
- Der tilsættes 1 μL 5-50 ng MAGIC Markers plasmid DNA i 10 μL optøede DH5 alfa-kompetente celler og inkuberes på is i 10 minutter uden blanding.
- For varmechoktransformationen skal du placere aliquot i et 42 °C vandbad i 45 s og derefter placere det straks på is og vente 3-5 minutter.
- Under sterile forhold tilsættes 230 μL SOC-medium og inkuberes i 1 time ved 37 °C.
- Indholdet af aliquot spredes over agarpladen og inkuberes natten over ved 37 °C.
- Plasmid kultur
- Den følgende morgen, under sterile forhold, afhente en koloni fra agar plade og læg den i en 14 mL rør, der indeholder 2 mL LB medium med passende antibiotikum. Lad det inkubere for dagen ved 37 °C i en rysteinkubator ved 300 omdrejninger i minuttet.
- I sidste ende frø 300 mL LB med antibiotikum ved hjælp af 2 mL starterkulturen fra trin 1.2.1 og inkuber natten over ved 37 °C i en rysteinkubator ved 300 omdrejninger i minuttet.
- Plasmid DNA-forberedelse
- Den følgende morgen fortsætte med rensning af MAGIC Markers plasmid DNA (dvs. PB-CAG-Cytbow og Tol2-CAG-Nucbow samt CAG-drevet plasmider udtrykke PB og Tol2 transposases og Cre recombinase) ved hjælp af en endotoksin-fri maxiprep kit efter producentens protokol.
- Dna'et elueres i 200 μL sterilt vand, og koncentrationen estimeres ved hjælp af et spektrofotometer inden opbevaring ved -20 °C.
2. Forberedelse til MAGIC Markører i livmoderen elektroporation (MM IUE)
- Løsningsforberedelse
- Varm 30 ml 0,9% saltvandsopløsning ved 37 °C i et vandbad og hold den varm under hele operationens varighed.
- Forbered en plasmidblanding, der indeholder PB-CAG-Cytbow og Tol2-CAG-Nucbow (endelig koncentration, 0,8 μg/μL hver), PB og Tol2 transponerer (endelig koncentration, 0,4 μg/μL hver), CAG-seCre (endelig koncentration, 0,16 μg/μL) og 0,01% fast grøn farvestof i PBS uden Ca2+ og Mg2+.
BEMÆRK: Til astrocyt anatomiske rekonstruktionsformål kan Tol2-CAG-Nucbow-konstruktionen udelades. Denne plasmid er dog nyttig til at skelne doubletter af tæt sammenstillede astrocytter, og når du bruger MAGIC Markers til at undersøge klonede relationer mellem astrocytter14. - Bedøvelsesopløsning, der indeholder 100 μL ketamin (100 mg/mL) og 100 μL xylazin (20 mg/mL), fortyndet i 2 ml saltvandsopløsning.
- Analgesisk opløsning fremstilles ved fortynding af 0,3 mg/mL buprenorphinbestandsopløsning 1:10 i saltvandsopløsning.
- Forberedelse af operationsmaterialet
- Det kirurgiske værktøj steriliseres (se materialetabel)ved høj temperatur i en glasperle sterilisator eller tilsvarende.
- Placer en dråbe elektrodegel i en 35 mm skål.
- Sæt mikropipetten i mikroinjektorholderen, bryd spidsen af mikropipetten, og stræb dna-opløsningen.
- Placer en 1 μL dråbe Fast Green-opløsning (0,01%) i låget på en 3 cm skål og, ved hjælp af det som reference, justere diameteren af micropipette spids ved at bryde spidsen med fine pincet. Trykparameteren justeres, så mikroinjektoren producerer tilsvarende størrelsesdråber, hvilket muliggør levering af ca. 1 μL DNA-opløsning pr. injektion.
- Forberedelse af den gravide kvindelige mus
- Afveje RjOrl:SWISS gravid mus.
- Der udføres en intraperitoneal injektion med 12,5 μL pr. gram legemsvægt (BW) bedøvelsesopløsning. Vent i 5 minutter, og kontroller, at musen sover ved at klemme tåen.
- Når dyret ikke reagerer på at klemme, injiceres det subkutant med 1,6 μL/g BW smertestillende opløsning.
- Tilsæt en dråbe okulær gel på hvert øje for at forhindre tørring under operationen og læg dyremaven op på opvarmningspuden.
- Barber forsigtigt maven, rengør den med en pude gennemblødt med jod, og desinficer det barberede område med en alkoholpude.
- Arranger et operationsfelt ved at placere sterile kompresser omkring det barberede, rensede og desinficerede område.
3. I livmoderelektroporation (IUE)
- Intraventricular injektion
- Skær et 2 cm lodret snit langs midterlinjen, der starter i den nederste del af maven, gennem huden og derefter gennem den underliggende muskel. Udsæt livmoderhornene ved forsigtigt at manipulere de embryonale poser og vurdere placeringen af livmoderhalsen og antallet af embryonale poser på hver side af livmoderhalsen.
- Orientere hjernen af E15.5 embryo, der skal elektroporated for at se bregma, let genkendes som dens placering matcher med krydset mellem de tre vigtigste blodkar, der løber langs cerebral sprækker.
- Forestil dig en virtuel linje mellem bregma (synlig gennem kraniet) og øjet; indføre mikropipetten mellem den virtuelle linje og den langsgående revne, og tryk derefter på injektorens fodpedal for at levere 1 μL DNA-opløsning i den laterale hjertekammer på den målrettede halvkugle.
BEMÆRK: Når den er injiceret på det rette sted, fremstår den fyldte laterale ventrikel blå, hvilket indikerer, at den er fyldt med DNA-opløsningen.
- Elektroporation
- Påfør elektroderne (se Materialetabel), tidligere dyppet i elektrodegel, på begge sider af det injicerede embryo med anoden, der dækker den injicerede halvkugle. Tryk på elektroporatorens fodpedal for at levere en serie på fire 50 ms impulser på 35 V, hver adskilt af et interval på 950 ms.
- Fugt embryoet med opvarmet saltvandsopløsning.
BEMÆRK: Embryonerne skal holdes fugtige ved hjælp af opvarmet saltvandsopløsning under hele kirurgisk indgreb, og livmoderen bør ikke tørre ud. - Gentag trin 3.1.2-3.2.2 for hvert foster.
- Når alle målrettede embryoner er blevet elektroporated, erstatte livmoderhorn i maven ved forsigtigt at skubbe dem med pincet tilbage til deres oprindelige position. Fyld bukhulen med opvarmet saltvandsopløsning for at forhindre livmoderen i at tørre, mens suturer er lavet.
- Luk først mavemusklen med en kontinuerlig absorberbar sutur, og derefter huden med flere individuelle sting (~ 10) ved hjælp af 4-0 sutur.
- Sæt dyret i et rent bur, liggende på sin side på et rent køkkenrulle og drej dyret til den anden side hver 5-10 minutter, indtil det vågner op og begynder at bevæge sig alene.
- Vurder dyrets tilstand den følgende dag, især hvis der er lavet en rede.
BEMÆRK: Der kræves ingen posturgery behandling. I mangel af en rede, ethvert tegn på smerte (f.eks. prostration, shaggy pels) og / eller kraftig blødning, skal dyret straks aflives.
4. Vævshøst og -sektion
- Vævsindsamling
- Der injiceres intraperitonealt phenobarbital (100 mg/kg legemsvægt) for terminalbedøvelse på det ønskede høsttidspunkt. I dette tilfælde var høsttiderne på postnatal (P) dage P4, P7 og P21.
- Udfør intrakardi perfusion ved hjælp af kold præfabrikeret paraformaldehydbaseret opløsning.
- Disseker hjernen ud, og placer den natten over ved 4 °C i den paraformaldehydbaserede opløsning til anbringelse.
- Histologi
- Den følgende morgen skylles hjernen 3x i 10 minutter med 1x PBS.
- Indlejre hjernen i 3% agarose opløst i 1x PBS.
- Skær 80 μm sektioner ved hjælp af en vibrerende-blade mikrotome.
- Saml sektioner i en 24 brønd plade forpåfyldt med 1x PBS.
- Monteringssektioner i monteringsmediet (se Materialetabel) mellem rutsjebanen og coverlip. Hold de monterede rutsjebaner ved -20 °C for optimal fluorescerende proteinbevarelse og langtidsopbevaring.
5. Konfokal billeddannelse med flere kanaler
- Indstillinger for mikroskop
- Konfigurer konfigurationen af det konfokale mikroskop til separat at ophidse mCerulean/mTurquoise2,EYFP, tdTomato/mCherry ved hjælp af henholdsvis 440, 515 og 559 nm laserlinjer.
- Brug en 20x 0,8 NA (eller højere NA) mål og justere XY prøveudtagning og Z-trins størrelse i henhold til Nyquist kriterier.
BEMÆRK: Billeder erhvervet med højere opløsning (f.eks 60x 1,4 NA olie mål) og dekonvolution algoritmer vil muliggøre genopbygning af de finere detaljer i astrocyt arbors. Forsøgsviseren skal dog huske på, at de fineste astrocytprocesser muligvis ikke løses ved konventionel optisk billeddannelse.
- Erhvervelse af billede
- Find de klareste astrocytter i det elektroporated område.
- Da navngivne celler, der er placeret tæt på overfladen, kan se lysere ud end dem, der er dybere i udsnittet, skal du justere anskaffelsesindstillingerne på overfladecellerne for at undgå at mætte billederne.
- Juster anskaffelsesindstillingerne separat for hver af de tre kanaler, samtidig med at du sørger for at undgå pixelmætning ved hjælp af HiLo LUT, der viser nulværdier som blå og maksimale pixelværdier som røde.
BEMÆRK: Et tilstrækkeligt afbalanceret billede bør kun vise nogle få blå og næsten ingen røde pixels. - Erhverve flisebelagt 1.024 x 1.024 pixel Z-stakke ved hjælp af motoriserede fase af mikroskopet, med en 10% overlapning mellem tilstødende stakke til efterfølgende at muliggøre mosaik rekonstruktioner af det elektroporated område eller zonen af interesse.
6. Territorial segmentering af astrocyt
BEMÆRK: Dette udføres ved hjælp af et kommercielt softwareprogram (f.eks. IMARIS).
-
Udarbejdelse af datasættet
- Beskær de mærkede astrocytter i 3D-rekonstruktionen (250 x 250 pixel) ved at markere celler, der er helt omsluttet af den afbildede vævssektion.
BEMÆRK: Det er også muligt at arbejde direkte på større diskenheder, hvis den anvendte computer kan håndtere dem. - Klik på knappen Blå overflade på værktøjslinjen Objekt i visningen Overfør for at oprette en ny Surface for hver astrocyt.
- Hvis du vil opnå en bedre visualiseringskontrast, skal du først justere de minimale og maksimale farvekontrastværdier ved at klikke på Rediger | Vis visningsjusteringsindstillingen, og træk i begge håndtag. Hvis det er nødvendigt, kan du ændre kanalfarven ved at klikke direkte på kanalnavnet i vinduet Skærmjustering for at vælge en ny farve.
BEMÆRK: Fortrinsvis altid arbejde med den samme farve display for at forhindre visuel bias. - Klik på Rediger | Egenskaber for billede for manuelt at angive voxelstørrelsen i mikrometre. Hvis voxel-størrelsen ikke er nøjagtig, vil volumenberegningerne være forkerte.
- Gem de nye indstillinger.
- Beskær de mærkede astrocytter i 3D-rekonstruktionen (250 x 250 pixel) ved at markere celler, der er helt omsluttet af den afbildede vævssektion.
-
Segmentering af overflade
- Brug det blå ikon til at introducere en overflade. Der vises et Surface-ikon og -felt på scenelisten. En lydstyrkeboks gør det muligt at se/skjule datasættet.
- Marker overfladelinjen, og klik på Spring automatisk oprettelse over | Rediger manuelt.
- Klik på Kontur | Synlighed , og klik på Ingen. Flyt derefter til visningen Vælg, og klik på knappen Tegning.
- Klik på Tilstand for at vælge tegningstilstand.
- Brug det hurtige og effektive halvautomatiske isoline-tegneværktøj. Definer celledispositionen ved at flytte musemarkøren på den. Hvis isolineeksemplet ikke svarer til astrocyttens kontur, skal du justere musemarkørens placering. Hvis du vil validere eksemplet, skal du venstreklik på markeringen. Hvis du vil rette potentielle fejl, skal du bruge vinduet Tavle til at slette den aktuelle Z-plankontur eller trykke på Ctrl + Z.
- Bruge udsnit | Placer for at navigere gennem Z-flyene, flyt til det næste plan ved at ændre Z-plannummeret og starte en ny kontur. Start fortrinsvis fra midten af cellen og flyt derefter til ekstremiteterne.
- Når der er tegnet konturer i alle de Z-planer, der indeholder astrocyten, skal du klikke på Opret overflade. Før du opretter en overflade, skal du kontrollere, at alle komponenterne er tilsluttet. Hvis ikke, skal du vælge de største eller forbinde relevante data, før du eksporterer volumendata.
- Kontroller de kvantitative data, der vises i datapanelet, og eksporter statistik i regnearksformat, og gem volumenværdi og enhed.
- Gem overfladen under et nyt navn for at få adgang til den senere.
7. Sporing astrocyt arborization
BEMÆRK: Dette gøres ved hjælp af open access softwareprogram Vaa3D.
- Udarbejdelse af datasættet
- Indlæs billedstakken, og søg efter isolerede astrocytter eller astrocytter i nærheden, der viser forskellige farver.
BEMÆRK: Rekonstruktionens opløsning kan forbedres ved at øge den objektive nationale handlingsplan og stikprøver. I sidste ende kan de fineste astrocytprocesser imidlertid ikke spores nøjagtigt på grund af opløsningsgrænsen for konfokal mikroskopi. Man bør være omhyggelig med at undgå oversegmentering ud over opløsningen af de erhvervede billeder. - Brug Fiji til at beskære billedstakke på 250 x 250 pixel omkring hver astrocyt.
- Da Vaa3D-sporing kun udføres på én farve, skal du vælge én kanal og deaktivere de andre kanaler.
- Konverter billedet til RGB, og gem det i .tiff format.
- Indlæs billedstakken, og søg efter isolerede astrocytter eller astrocytter i nærheden, der viser forskellige farver.
- Arbor-sporing
- Åbn RGB-billedet i Vaa3D. Gå til | Data | Geometri derefter billede resampling, og justere X / Y og Z voxel størrelsesværdier.
BEMÆRK: Mens rekonstruere astrocyt arbors, bør man sørge for ikke at spore detaljer finere end den opløsning, som billederne. - Åbn et 3D-vindue ved at klikke på Visualiser | 3D-fremviser for hele billedet. Højreklik på et 3D-billede, og vælg 1 højreklik for at definere markør. Peg med markøren i midten af astrocyten, og højreklik derefter for at angive en markør.
BEMÆRK: Klik på Escape for at få adgang til 3D-visningen igen. - Gå til avanceret | 3D-sporing | Vaa3D-Neuron2-auto-sporing.
- Vælg den kanal, plug-in'en skal anvendes på, i det nyåbnede vindue.
- Vælg en baggrundstærskel (ofte mellem 30 og 90). Tilpas denne værdi for hver astrocyt, hvis det er nødvendigt.
- Fjern markeringen af Radius fra 2D, og behold auto-down-prøven, og auto-resample kontrolleres.
- Sæt cnn_type til 3, length_thresh ved 1 og SR_ratio kl. 0,1.
- Når du har klikketpå ok , skal du kontrollere, at plug-in'en automatisk genererer to filer baseret på det oprindelige navn. Suffikset -ini.swc og -coordinateX-coordinateY-coordinateZ-app2.swc tilføjes. Føj manuelt en karakteristisk etiket til disse navnefiler for ikke at overskrive dem, mens du fortsætter med at køre plug-in'en.
- Åbn Objektstyring, gå til Neuron | Stregstruktur, vælg den sporede astrocyt, klik på Visningstilstand, og vælg Altid linjetilstand.
- Gå tilbage til 3D-vinduet, hvor et skelet af astrocyten vises.
BEMÆRK: Hvis segmentering og signal ikke stemmer overens, skal du gentage trin 7.2.3-7.2.10 og justere tærsklen, indtil de gør det. Sørg for at indtaste de andre parametre igen, når de nulstilles, når plug-in'en genstartes. - Højreklik på skelet og vælg førstevalg neuron | linje # 1 ... APP2_Tracing at få adgang til kvantitative målinger, der vises på et nyt vindue Surface| Anmærkning af objekt.
BEMÆRK: På grund af den begrænsede opløsning af lysmikroskopi giver målinger, der vises under de anførte punkter Antal grene og antal bifurcationer kun et groft skøn over astrocyt arbor kompleksitet.
- Åbn RGB-billedet i Vaa3D. Gå til | Data | Geometri derefter billede resampling, og justere X / Y og Z voxel størrelsesværdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroporation af MAGIC-markører i embryonale kortikale forfædre gør det muligt at mærke astrocytter fra tidlige til sene stadier af udvikling af hjernebarken (Figur 1). Disse astrocytter blev fundet i alle kortikale lag på forskellige postnatale stadier (P4, P7, P21), da de spredte sig bredt i hele hjernebarken. De blev vurderet med flisebelagte konfokale billeder erhvervet med et 20x 0,8 NA (eller højere NA) mål og samlet som Z-stack rekonstruktioner (Figur 2). MAGIC Markers kombinatoriske mærkning aktiveret individualisering af kortikale astrocytter og udvinding af oplysninger om deres volumen og morfologi. Ved hjælp af den kommercielle billedanalysesoftware blev konturen af de enkelte astrocytter afgrænset på hver enkelt optisk del af konfokale billedstakke for at segmentere og rekonstruere det territoriale domæne, der er besat af hver astrocyt (Figur 3). Fra de samme Z-billedstakke blev den forgrenede morfologi af enkeltstående kortikale astrocytter segmenteret ved hjælp af open access-softwaren, der tillader ekstraktion af skelettet af de vigtigste astrocytprocesser (Figur 4). Disse segmenterings - og sporingsværktøjer gav en semikvantitativ vurdering af stigningen i territorial volumen (figur 3) og morfologisk kompleksitet (figur 4), der opstod for individuelle kortikale astrocytter fra tidlige til sene postnatale stadier14. Disse metoder afslørede også heterogeniteten af volumen og morfologi , der blev udvist af særskilte kortikale astrocytter på samme udviklingsstadium, som illustreret i figur 2, figur 3og figur 4.
Figur 1: Skematisk repræsentation af MAGIC Markers (MM) i livmoderelektroporation (IUE) for at mærke kortikale forfædre og deres nedstigning under hjernens udvikling. (A) MM værktøjskassen består af flere plasmider kodning PB-Cytbow, Tol2-Nucbow,PB og Tol2 transposases, og selv-excisable Cre recombinase (seCre). I MM konstruktioner, tre par uforenelige lox sites (loxN, lox2272, og loxP) flanke fire forskellige FP kodning sekvenser (EBFP2, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, tdTomato / mCherry) og skabe gensidigt udelukkende muligheder for excision på Cre rekombination. Før Cre handling, kun det første gen (EBFP2) er udtrykt. Efter Cre-medieret excision induceret af seCre udtrykkes enten tdTomato/mCherry (rød FP), EYFP (grøn FP) eller mTurquoise2/mCerulean (cyan FP). Co-udtryk for FP fra flere MAGIC Markers kopier giver farvekombinationer i cytoplasma (PB-CAG-Cytbow) eller kerne (Tol2-CAG-Nucbow) af mærkede celler. PB og Tol2 gennemførelse endfeet indramning mm kassetter tillade deres integration i genomet af kortikale forfædre, når MM konstruktioner er coelectroporated sammen med PB og Tol2 transposases kodning plasmider. (B-G) Grafisk illustration af IUE på hinanden følgende trin, herunder laparotomi af bedøvede gravide mus (B), injektion af MM plasmidblandingen (C) i embryonernes laterale ventrikler (D), levering af elektriske impulser gennem omhyggeligt placerede pincet (E) til at målrette kortikale forfædre i en af de to hjernehalvdele (F) og suturering af gravid mus ( maveG). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Efter i livmoderen elektroporation af MAGIC Markører værktøjskasse, multicolor astrocytter blev fundet spredt i hele hjernebarken på postnatal stadier. IUE af plasmider kørsel MM, seCre, PB, og Tol2 transposases udtryk i E15.5 mus kortikale forfædre resulterede i mærkning af lag 2-3 neuroner og astrocytter på P4, P7, og P21. Udtryksniveau og farvepalet afhang af antallet af MM-transgener integreret i genomet af kortikale forfædre. Montage af maksimale intensitetsfremskrivninger fra flisebelagte konfokale billedstakke erhvervet på 80 μm sagittal hjernesektioner. Skalalinje: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Segmentering af kortikale astrocyt territoriale domæne på forskellige udviklingsstadier. Maksimal intensitet fremskrivninger af beskåret confocal Z-stack indramning enkelte astrocytter (A-F) og deres tilknyttede territoriale domæne segmenteret med den kommercielle software (A'-F ')på tre forskellige udviklingsstadier: P4 (A-B, A'-B '),P7 (C-D, C'-D '),og P21 (E-F, E'-F '),hhv. Skalalinje: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sporing af kortikal astrocyt arborization. Eksempler på to forskellige astrocytter beskåret af konfokale Z-stakke (A-D) og rekonstruktion af deres arborization groft segmenteret med Vaa3D (A'-D ') indsamlet i to forskellige udviklingsstadier: P7 (A-B, A'-B ') og P21 (C-D, C'-D '),henholdsvis. Skalalinje: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I livmoderelektroporation (IUE) af MAGIC-markører i kortikale forfædre (figur 1) aktiverede mærkning af astrocytter i hele den postnatale hjernebark på forskellige postnatale stadier (P4-P7-P21, Figur 2). Interessant nok er fasen af IUE ikke kritisk, da elektroporation udført fra E13.5 til E15.5 giver lignende mærkningsmønstre vedrørende kortikale astrocytter14. Placeringen af mærkede pyramide neuroner i kortikale parenchyma varierer dog med elektroporationsstadiet. Faktisk IUE udføres på E15 mærker lag 2-3 neuroner mens IUE udføres på E13 etiketter pyramide neuroner i alle kortikale lag, fra lag 5 til lag 2-36,27. Denne fælles mærkning af kortikale pyramide neuroner efter MM IUE er den vigtigste begrænsning af denne metode, da det forhindrer semiautomatisk segmentering af astrocytmorfologi i lag, hvor tæt neuronal mærkning forstyrrer astrocytprocessernes anerkendelse. Skulle det være et problem, mm kunne elektroporated på postnatal stadier som i PALE. På P4, mærkning af radiale glia fibre stadig er til stede på dette tidspunkt kan også forstyrre Vaa3D arbor segmentering. Mens besværlige, en løsning, hvis man ønsker at gå videre med astrocyt arbor genopbygning på dette tidspunkt er manuelt at fjerne radiale glial fibre ved gradvist at erstatte radial fiber signal med sorte pixels omkring astrocyt af interesse ved hjælp af Adobe Photoshop.
På trods af denne begrænsning er MM IUE en kraftfuld teknik, når den udføres tilstrækkeligt. Et par kritiske skridt skal håndteres med forsigtighed: 1) embryoner skal holdes fugtige under hele kirurgi procedure og omhyggeligt manipuleret for at øge deres overlevelse; 2) ved hjælp af glas kapillærer med en stor diameter eller klemme embryonale poser for stramt kan føre til pose brud og dermed embryoner død; 3) under DNA-injektion skal blodkar undgås for at forhindre blødning; 4) hele proceduren bør ikke vare mere end 40 minutter fra anæstesi til sutur for at maksimere embryoets overlevelse; 5) stress spiller en afgørende rolle i IUE succes og derfor ekstra kilder til stress såsom ændring af bur, transport, lyde og vibrationer skal undgås fra 5 dage før operationen til 7 dage efter fødslen for at forhindre abort og kannibalisme.
Bemærk, at forsøgsfolk, der ønsker specifikt at målrette celler født på et givet stadium, kan bruge MM-værktøjskassen uden at tilføje piggyBac og Tol2 transponerer sådan, at kun de celler, der er født på tidspunktet for elektroporationen, udtrykker kombinatoriske etiketter. En anden fordel ved metoden er den fleksibilitet, den giver med hensyn til tætheden af mærkede celler og deres placering i forskellige hjerneområder. Tættere mærkning af kortikale astrocytter kan opnås ved at øge den samlede koncentration af MM-transgener, samtidig med at plasmidforholdet holdes konstant (1:10-forhold for Cre recombinase/MM-konstruktioner og 1:2-forhold for transponerings-/MM-konstruktioner). I modsætning til monokrome tilgange, såsom elektroporation af enkeltfarvede transposoner eller Cre-elektroporation i Ai9-mus, hvor evnen til at fremhæve individuelle astrocytter kræver sparsom mærkning, gør farvekontrast, der tilbydes af MAGIC Markers-strategien, det muligt at individualisering af astrocytter over en bred vifte af mærkningstætheder. Derudover tillader placering af elektrodesonderne i forskellige retninger at målrette forskellige hjerneregioner som den potentielle striatum (anode i ventralpositionen, modsat den dorsale position, der kræves for at opnå elektroporation i hjernebarken) eller hippocampus (anode i medial position)28. Endelig kan IUE udføres i forskellige musstammer som udavlede (OF1, schweiziske) og indavlede (C57BL/6J eller N) mus, hvilket åbner vejen for brug af MM-værktøjskassen i transgene dyresygdomsmodeller. For at opnå IUE i indavlede mus bør man dog tilpasse antallet af impulser (tre impulser til C57BL/6 mus mod fem impulser i schweizisk), spænding (30 V i stedet for 35 V) og smertestillende dosis (0,15 mg/mL buprenorphinbestandsopløsning og et injiceret volumen på 0,8 μL/g BW).
I sammenligning med transgene dyreavl eller PALE og StarTrack tilgange, denne metode giver flere fordele. Til at begynde med bruger den i modsætning til avlsstrategien få dyr. Det giver også mulighed for mærkning af kortikale astrocytter siden de tidligste stadier af deres udvikling, herunder embryonale stadier, i modsætning til PALE4, som er afhængig af postnatal elektroporation. I forhold til de tolv reporterkonstruktioner, der anvendes i StarTrack-tilgang8, er denne strategi kun baseret på to flerfarvede transgener, hvilket gør DNA-mixforberedelse og billeddannelse enklere. Desuden bestemmes balancen mellem de forskellige farver stokastisk udtrykt af MM i sig selv af transgeneternes struktur og afhænger ikke af eksperimentatorens blanding af forskellige komponenter. Desuden kan denne strategi strække sig ud over simpel anatomisk overvejelse og kan med succes anvendes til flerklonal analyse af astrocytudvikling, som det fremgår af tidligere offentliggjort arbejde14. Dette arbejde, ved hjælp af sjældne farvekombinationer af cytoplasmiske og nukleare markører til at definere kortikale astrocyt kloner, viste, at de viser omfattende variation med hensyn til rumlig distribution, strukturel organisation, antal og undertype af genererede celler.
Kortikale astrocytter født af MM-mærkede kortikale forfædre udviste betydelig farvekontrast og spredte sig bredt over hele hjernebarken (Figur 2). Simple erhvervelser af Z-stakker med flere kanaler ved hjælp af konfokal mikroskopi blev brugt til at få adgang til vigtige astrocytfunktioner såsom deres territoriale volumen (figur 3) og deres morfologiske kompleksitet (figur 4) på flere postnatale stadier. Ud over astrocytter kan denne metode tilpasses til at studere morfologien af andre gliaceller såsom oligodendrocytter. Det skal dog huskes, at den begrænsede opløsning, der tilbydes af konfokal mikroskopi, kun kan give en delvis gengivelse af astrocytmorfmorologisk kompleksitet. Mens billeder opnået med højere opløsning (f.eks 63x 1,4 NA olie mål) og dekonvolution algoritmer kan bruges til at rekonstruere finere oplysninger om astrocyt arbors14, de fineste processer kan ikke løses med konventionel optisk billedbehandling. Ikke desto mindre vil den strategi, der præsenteres her, være af interesse for at screene effektivt for en potentiel fænotype, der påvirker kortikal astrocytvolumen eller morfologi i musemodeller af neurologiske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker S. Fouquet og billeddannelse og dyrekernefaciliteter på Institut de la Vision og Institut des Neurosciences de Montpellier (MRI og RAM) for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af stipendier fra Région Ile-de-France og Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer til S.C og fra Université Paris-Saclay (Initiativer Doctorales Interdisciplinaires) til LA ved hjælp af støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC-SG 336331, PI J. Valette) til E.H., af Agence Nationale de la Recherche i henhold til kontrakter ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Frankrig BioImaging) , af Fondation pour la Recherche Médicale (ref. DBI20141231328), af Det Europæiske Forskningsråd (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) og af ATIP-Avenir program (PI K. Loulier).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
- García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
- Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).
- Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
- Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).
- Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
- Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
- Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).
