Summary
O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.
Abstract
Os procedimentos apresentados descrevem uma metodologia generalizada para infectar mosquitos Aedes aegypti com zika vírus em condições laboratoriais para determinar a taxa de infecção, infecção disseminada e potencial transmissão do vírus na população do mosquito em questão. Esses procedimentos são amplamente utilizados com várias modificações nas avaliações de competência vetorial globalmente. São importantes na determinação do papel potencial que um determinado mosquito (ou seja, espécie, população, indivíduo) pode desempenhar na transmissão de um determinado agente.
Introduction
A competência vetorial é definida como a capacidade no nível de espécies, população e até mesmo um indivíduo, de um determinado artrópode, como um mosquito, carrapato ou mosca de areia de flebotomina, para adquirir e transmitir um agente biologicamente com replicação ou desenvolvimento no artrópode1,2. Com relação a mosquitos e vírus transmitidos por artrópodes (ou seja, arboviroses), o agente é absorvido de um hospedeiro virêmico por uma fêmea de mosquito. Após a ingestão, o vírus deve infectar produtivamente uma pequena população de células epiteliais midgut3, superando vários obstáculos fisiológicos, como a degradação proteolítica por enzimas digestivas, a presença da microbiota (barreira de infecção midgut, ou MIB), e a matriz peritrofídica secretada. A infecção do epitélio midgut deve ser seguida pela replicação do vírus e eventual fuga do midgut para o sistema circulatório aberto do mosquito, ou hemoglifo, o que representa o aparecimento de uma infecção disseminada superando a barreira de escape midgut (MEB). Neste ponto, o vírus pode estabelecer infecções de tecidos secundários (por exemplo, nervos, músculos e corpos de gordura) e continuar a se replicar, embora essa replicação secundária possa não ser estritamente necessária para que o vírus infecte as células acinares das glândulas salivares (superando a barreira da infecção da glândula salivar). O lagross das células acinares da glândula salivar em suas cavidades apical e, em seguida, o movimento no ducto salivar permite a inoculação do vírus em hospedeiros subsequentes na mordida, e completa o ciclo de transmissão1,2,4,5,6,7.
Dado esse mecanismo bem caracterizado e geralmente conservado de disseminação dentro de um vetor de mosquitos, as avaliações de competência vetorial laboratorial são muitas vezes metodologicamente semelhantes, embora existam diferenças nos protocolos1,2. Geralmente, após a exposição ao vírus oral, os mosquitos são dissecados para que tecidos individuais como o midgut, pernas, ovários ou glândulas salivares possam ser testados para infecção viral, infecção disseminada, infecção disseminada/transmissão transovarial potencial e competência de transmissão disseminada/potencial,respectivamente 8. A mera presença de um vírus nas glândulas salivares, no entanto, não é evidência definitiva da capacidade de transmissão, dada a evidência de uma barreira de fuga/saída da glândula salivar (SGEB) em algumas combinações vetoriais/vírus1,2,4,5,7,9. O método padrão para comprovar a competência de transmissão continua sendo a transmissão do mosquito para um animal suscetível10,11,12. No entanto, dado que para muitas arboviroses isso requer o uso de modelos murinas imunocomprometidos13,14,15,16, este método muitas vezes é proibitivo. Uma alternativa comumente utilizada é a coleta da saliva do mosquito, que pode ser analisada por reação de cadeia transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) ou um ensaio infeccioso para demonstrar a presença do genoma viral ou partículas infecciosas, respectivamente. Vale ressaltar que tais métodos de coleta de saliva in vitro podem superestimar12 ou subestimar17 a quantidade de vírus depositado durante a alimentação in vivo, indicando que tais dados devem ser interpretados com cautela. No entanto, o método in vitro é altamente valioso quando analisado na perspectiva da mera presença de vírus na saliva, indicando potencial de transmissão.
Existem duas abordagens importantes para determinar o papel dos vetores de mosquitos em surtos de doenças arbovirais. O primeiro método envolve a vigilância em campo, na qual os mosquitos são coletados no contexto de transmissão ativa18,19,20,21,22,23,24. No entanto, dado que as taxas de infecção são tipicamente bastante baixas (por exemplo, a taxa estimada de infecção de 0,061% de mosquitos em áreas de circulação ativa do vírus Zika (ZIKV) nos Estados Unidos21), a incriminação de espécies vetoriais potenciais pode ser fortemente tendenciosa pela metodologia de captura25,26 e chance aleatória (por exemplo, amostragem de um indivíduo infectado de 1.600 não infectados)2 . Levando isso em conta, um determinado estudo pode não adquirir mosquitos suficientes tanto em números brutos quanto na diversidade de espécies para amostrar com precisão os mosquitos envolvidos na transmissão. Em contrapartida, as análises de competência vetorial são realizadas em ambiente laboratorial, permitindo um controle rigoroso de parâmetros como a dose oral. Embora não sejam totalmente capazes de representar a verdadeira complexidade da infecção por mosquitos e da capacidade de transmissão em um ambiente de campo, essas avaliações laboratoriais permanecem ferramentas poderosas no campo da arbovirologia.
Com base em diversas análises de competência vetorial com ZIKV em diversas espécies de mosquitos, populações e métodos27,28,29,30,31,32, bem como uma revisão recente das avaliações de competência vetorial1,descrevemos aqui vários dos protocolos associados a um típico fluxo de trabalho de competência vetorial. Nestes experimentos, três Ae. populações de aegypti das Américas (cidade de Salvador, Brasil; República Dominicana; e do baixo Vale do Rio Grande, TX, EUA) foram expostas a uma única cepa de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 ou 6 log10 unidades de formação focal (FFU)/mL por meio de doses de sangue artificial. Posteriormente, foram analisadas evidências de infecção, infecção disseminada e competência de transmissão após vários momentos de incubação extrínseca (2, 4, 7, 10 e 14 dias) por meio de dissecção e ensaio infeccioso baseado em cultura celular. Embora o fluxo de trabalho/protocolos atual seja otimizado para ZIKV, muitos elementos são diretamente traduzíveis para outras arboviroses transmitidas por mosquitos nos níveis de contenção de artrópodes e biossegurança 2 e 3 (ACL/BSL2 ou ACL/BSL3).
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Protocol
Todos os procedimentos realizados nesses protocolos foram realizados em pleno cumprimento dos protocolos aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Filial Médica da Universidade do Texas em Galveston.
1. Amplie o ZIKV em células Vero
- Cultivar células Vero (CCL-81 ou VeroE6) na modificação de Dulbecco do meio essencial mínimo (DMEM) da Eagle suplementado com 10% v/v de soro bovino fetal inativado (FBS) e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (100 U/mL e 100 μg/mL, respectivamente) em uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2 a entre 80-90% de confluência em um frasco de cultura tecidual de 150 cm2.
- Em um armário de biossegurança (BSC), remova o meio e descarte em alvejante de 10% ou uma diluição de trabalho de amônio quaternário duplo(Tabela de Materiais). Inocular imediatamente a monocamada com 1 mL de estoque viral, visando 0,1-1 célula de partícula viral infecciosa. Agitar o frasco imediatamente de tal forma que o inóculo contate a monocamadas em sua totalidade.
- Cubra o médio a um volume de 5 mL usando DMEM suplementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina de 1% (v/v) penicilina-estreptomicina. Em seguida, mova o frasco para a incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2 por 60 min.
- Remova o frasco da incubadora e leve-o para um BSC. Adicione meio adicional a um volume total de 15 mL usando DMEM suplementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina-estreptomicina de 1% (v/v). Mova o frasco para uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2.
- Examine o frasco diariamente sob microscopia de contraste de fase para obter evidências de efeitos citopáticos (CPE). Prossiga para a colheita viral (etapa 1.7) quando apenas aproximadamente 40-50% das células permanecem na monocamada, geralmente 3-5 dias após a infecção, dependendo da cepa de ZIKV sendo utilizada.
- Aspire o supernante e coloque em um frasco cônico de 50 mL. Esclareça o sobrenatante de detritos celulares por centrifugação (3.500 x g por 20 min).
NOTA: Se vários frascos foram infectados de forma idêntica, supernacantes de vários frascos podem ser combinados em tubos cônicos de 50 mL. - Remova o supernatante do tubo cônico de 50 mL para um novo, tomando cuidado para não interromper a pelota. Suplemente o supernatante com FBS inativado a calor a uma concentração final de 30% (v/v). Aliquotar esta mistura em tubos individuais de tampa de parafuso e congelar a -80 °C até usar.
2. Preparação de farinhas de sangue artificiais
- No dia em que os mosquitos devem ser expostos a farinhas infecciosas, ligue a fonte de energia (Tabela de Materiais) em uma instalação de contenção de artrópodes, de modo que as unidades de alimentação(Tabela de Materiais) estejam pré-aquecidos quando os mosquitos estiverem preparados para exposição.
- Prepare farinhas de sangue artificiais usando um dos métodos descritos abaixo.
- Método 1: Combinar sangue humano recém-colhido (dentro de uma semana) citado ou heparinizado comprado comercialmente 1:1 v/v com estoque viral (preparado conforme descrito na seção 1).
NOTA: Este método depende da ausência de quaisquer anticorpos para a família vírus/vírus estar presente no sangue. - Se a ausência de anticorpos não puder ser confirmada ou a fonte de sangue for conhecida por ter exposição prévia ao flavivírus, lave e embale manualmente os eritrócitos.
- Em um BSC, adicione 30 mL de sangue humano inteiro a um tubo cônico de 50 mL e cubra até 50 mL com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).
- Centrifugar a 3.500 x g por 20 min.
- Aspire o supernatante, derramando suavemente em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou diluição de trabalho de amônio quaternário duplo, tomando cuidado para não descartar a pelota de eritrócito.
- Adicione 10 mL de PBS e bata suavemente a parte inferior do tubo cônico contra a parte inferior do BSC de tal forma que a pelota eritrócito tenha sido reconstituída. Leve o volume da suspensão até 50 mL com PBS. Misture por inversão suave.
- Repetição de passos 2.2.2.1−2.2.2.4 um total de 4-6x. Confirme se o supernatante é claro ou apenas ligeiramente rosa e não mais opaco. Remova todo o supernatante usando uma pipeta sorológica. Resuspend a pelota eritrócito em 1-2 mL de PBS.
- Monte a farinha de sangue: 350 μL de eritrócitos embalados, 100 μL de 10% de sacarose, 200 μL de FBS inativados pelo calor, ATP recombinante de 900 μM e 2 mL de estoque de vírus apropriadamente diluído usando DMEM complementado com FBS inativados por calor de 2% v/v e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina.
- Método 1: Combinar sangue humano recém-colhido (dentro de uma semana) citado ou heparinizado comprado comercialmente 1:1 v/v com estoque viral (preparado conforme descrito na seção 1).
- Sobreponha uma unidade de reservatório padrão de 3 mL(Tabela de Materiais) com a pele de um rato não infectado (outras opções incluem filme de parafina, membranas colágenas ou invólucro de salsicha).
- Coloque o reservatório coberto em toalhas de papel branco. Adicione ~2 mL de farinha de sangue infecciosa ao reservatório 1 mL de cada vez. Inspecione a toalha debaixo do alimentador para obter qualquer evidência de vazamento. Se houver vazamentos, recupere a farinha de sangue dos alimentadores e descarte as tampas. Sele os alimentadores com plugues. Mais uma vez confirme que não há vazamentos.
3. Backtitration of bloodmeals/plaque assay
- Utilizando o volume restante da farinha de sangue preparada, realize uma série de diluição serial de 10x (ou seja, 6 diluições, variando de diluído 10x a 1.000.000x) utilizando DMEM complementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina-estreptomicina de 1% (v/v).
- Alíquota 100 μL das diluições nos poços de 24 ou 12 placas de poços das mais diluídas para as mais concentradas.
- Incubar por 1h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
- Ao final do período de incubação de 1 h, leve as placas de volta ao BSC e adicione 1 mL ou 2 mL de sobreposição de metilcelulose aos 24 poços ou 12 placas de poço, correspondentemente.
- Coloque as placas sobrepostas de volta em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 3-7 dias (dependente de cepa do vírus).
- Após a incubação, remova as placas da incubadora e leve para o BSC. Descarte a sobreposição de metilcelulose em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou desinfetante de amônio quaternário duplo.
- Lave cada poço 2x com PBS, descartando a lavagem em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou amônio quaternário duplo.
- Adicione ~1 mL de metanol:acetona (1:1 v:v) e deixe as células fixarem na placa por pelo menos 30 minutos no BSC à temperatura ambiente (RT). Descarte metanol:acetona de acordo com a política institucional sobre resíduos orgânicos.
- Visualize o ZIKV usando um dos dois métodos descritos abaixo.
- Após a remoção do metanol:acetona, colora imediatamente com uma solução violeta cristalina (0,25% w/v em 30% de metanol) por 5 min. Enxágüe 2x na água da torneira e deixe secar, depois visualize diretamente de olho para evidências de placas ou destruição de monocamadas.
- Alternativamente, realize o ensaio de formação de foco.
- Deixe as placas secarem até que não haja restos orgânicos.
NOTA: Este deve levar ~2−3 h fora do BSC, mas pode ser acelerado por secagem de ar em um BSC ou capô de fumaça química. - Lave cada poço 3x por 15 min cada em PBS não ester (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital. Remova o PBS e adicione 1 mL de solução de bloqueio (PBS + 3% FBS) a cada poço e arrase por 15 min no RT.
- Adicione 100 μL por poço de α-ZIKV ou anticorpo primário α-flavivirus (por exemplo, híbridoma do grupo flavivírus D1-4G2-4-15 [4G2]) a uma solução de diluição de 1:2.000 na solução de bloqueio. Incubar com balanço por um mínimo de 4h (preferencialmente durante a noite, não excedendo 18 h) na RT.
- Remova o anticorpo primário e lave 3x por 15 min cada com PBS (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital.
- Adicione 100 μL por poço do anticorpo secundário (cabra α mouse hrp-rotulado) diluído 1:2.000 no buffer de bloqueio. Incubar com balanço por 1h na RT.
- Lave 3x por 15 min cada com PBS (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital.
- Alíquota 100 μL de reagente de desenvolvimento de substrato(Tabela de Materiais) por poço. Placas de rocha na RT por 15 minutos.
- Interrompa a reação após o desenvolvimento de focos/placas removendo o substrato e enxaguando as placas 2x com água da torneira. Despeje a água da torneira e deixe as placas secarem antes de quantificar.
- Conte focos virais para determinar o número de FFU presente na amostra dada.
- Deixe as placas secarem até que não haja restos orgânicos.
4. Administração de farinhas de sangue
- Use mosquitos Ae. aegypti 2-4 dias após a eclosão. Classifique mosquitos fêmeas em caixas de papelão 0,5 L com tampas de tela e prive-os de açúcar (geralmente 36-48 h antes da farinha de sangue infecciosa). Forneça água ad libitum através de bolas de algodão saturadas de água.
- Remova as bolas de algodão saturadas de água na manhã em que os mosquitos serão expostos à farinha de sangue infecciosa.
- Anexar reservatórios contendo farinhas de sangue artificiais à unidade de alimentação leva dentro de uma caixa de luvas de plástico transparente.
- Dentro do porta-luvas, coloque uma caixa de papelão 0,5 L com tampa de tela, contendo 50-100 mosquitos Ae. aegypti famintos, sob a unidade de alimentação ligada ao reservatório.
NOTA: Mosquitos apropriadamente famintos geralmente se alimentam dentro de 20 minutos. A alimentação pode ser prolongada conforme necessário para aumentar o tamanho da amostra em populações mais lentas, embora isso não deva se estender além de 60 minutos, porque o título viral (ZIKV) pode diminuir dentro do alimentador após ~60 min. - Após a conclusão da alimentação, remova o reservatório e mergulhe em alvejante recém-feito 10%.
- Mosquitos anestesizem a frio por incubação para 30 s a -20 °C ou por 5 min em uma geladeira.
- Dentro do porta-luvas, despeje os mosquitos em uma placa de Petri no gelo. Conte e classifique as fêmeas engorgadas de mosquitos não engorgados. Descarte os mosquitos não engorgados por imersão em um tubo cônico de tubo de 50 mL cheio de 70% de etanol. Enquanto os mosquitos ainda estão anestesiados, despeje-os de volta na caixa de papelão 0,5 L e cubra rapidamente com a tela e a tampa. Corte a malha de tela em excesso da caixa e fixe a malha com fita.
- Adicione uma bola de algodão saturada com sacarose estéril filtrada 10% aquosa na tela de cada caixa. Coloque todas as caixas de mosquitos em um grande recipiente secundário de plástico com uma esponja úmida para manter a umidade.
- Coloque recipiente secundário contendo caixas de mosquitos em uma incubadora com temperatura de 27 ± 1 °C (ou conforme apropriado para simular condições na região de interesse) com 80% ± 10% de umidade relativa e um ciclo claro de 16:8:escuro). Mantenha os mosquitos com acesso a ad libitum a 10% de sacarose até a conclusão dos experimentos.
5. Aquisição e processamento de amostras
- Nos dias de pós-alimentação especificados, aspire um número predeterminado de mosquitos das caixas apropriadas usando um aspirador mecânico dentro de um porta-luvas. Tampe o tubo de coleta com uma rodada de algodão após a aquisição do número necessário de mosquitos.
- Mosquitos anesthetize frio por incubação por 30 segundos a -20 °C ou por 5 minutos a 4 °C.
- Dentro do porta-luvas, despeje os mosquitos em uma placa de Petri no gelo. Usando dois pares de fórceps, remova todas as seis pernas de cada mosquito e coloque em um tubo de microcentrifusidade de fundo redondo de 2 mL pré-rotulado contendo um rolamento de esfera de aço inoxidável esterilizado (7/32") e 500 μL de mídia de coleta de mosquitos (MCM) composta de DMEM, 2% FBS, 1% penicilina-estreptomicina e 2,5 μg/mL de anfotericina.
- Coloque suavemente o mosquito em uma gota de óleo mineral para contê-lo, tomando cuidado para não permitir qualquer contato entre o óleo e a cabeça do mosquito e proboscis.
- Insira o proboscis do mosquito em uma ponta de pipeta de 10 μL preenchida com 10 μL de FBS inativados pelo calor.
NOTA: Alternativamente, a pipeta pode ser preenchida com sacarose, sangue ou óleo mineral. O óleo permite visualização direta de bolhas de saliva através de microscopia leve. - Deixe o mosquito salivar por 30 minutos. Ejete a ponta de micropipette contendo FBS + saliva em um tubo de microcentrifuuge contendo 100 μL de MCM, em seguida, coloque a carcaça em um tubo de microcentrifuuge fundo redondo separado de 2 mL contendo um rolamento de esfera de aço esterilizado e 500 μL de MCM. Certifique-se de que os tubos utilizados para os corpos, pernas e saliva sejam rotulados para que fique claro que todas as três amostras se originaram do mesmo mosquito.
- Enquanto os mosquitos estão salivando, realize etapas 5.3-5.5 nos mosquitos restantes.
- Transporte os tubos contendo os corpos e pernas para um dispositivo de homogeneização de tecido de moagem de contas contido dentro de um BSC. Triturar todas as amostras de corpo e perna a 26 Hz por 5 minutos para liberar partículas virais para o supernante. Esclareça todas as amostras por centrifugação a 200 x g por 5 min para pelotas de detritos celulares.
NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser congeladas a -80 °C, ou avaliadas imediatamente.
6. Detecção de ZIKV por ensaio infeccioso
- Em um BSC, prepare 24 placas de cultura de tecido bem com células Vero (105 células por poço) 24 h antes do início do ensaio infeccioso. Rotule cada poço com a identidade de um único mosquito/amostra.
- Se as amostras foram congeladas a -80 °C, deixe descongelar.
- Remova a mídia das placas celulares Vero antes da inoculação com amostras de uma placa de cada vez.
- Para amostras contendo corpos ou pernas, alíquota cuidadosamente de 100 μL de supernanato clarificado em cada poço, tomando cuidado para não perturbar os detritos celulares do mosquito da pelota.
NOTA: As amostras de saliva podem ser diluídas 1:1 (v/v) com MCM antes da inoculação nas células para conservar amostras para titulação posterior, se necessário. - Mova as placas para uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 1h.
- Devolva as placas ao BSC e adicione ~1 mL de sobreposição de metilcelulose a cada poço. Coloque as placas sobrepostas de volta em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 3-7 dias (vírus/dependente de cepas).
- Realize fixação e visualização conforme descrito nas etapas 3.6-3.9.
- Quanto à pontuação através de um ensaio de formação de foco, quantifique os poços positivos por exame sob um microscópio leve. A detecção de coloração intracytoplasmática das células em um poço indica a presença de vírus. As amostras são pontuadas apenas como focus-positive ou -negativo.
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Representative Results
Três populações de Ae. aegypti das Américas (Salvador, Brasil; República Dominicana; e o Vale do Rio Grande, TX, EUA) foram expostos a um surto de ZIKV das Américas (ZIKV Mex 1-7, Estado de Chiapas, México, 2015) sobre uma gama de de farinha de sangue (4, 5 e 6 log10 FFU/mL) apresentados em um eritrócito humano lavado. Nos dias 2, 4, 7, 10 e 14 pós-infecção, subconjuntos de mosquitos foram processados para determinar as taxas de infecção, disseminação e potencial de transmissão.
Em um título de farinha de sangue de 4 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1−7, Ae. aegypti de Salvador, Brasil, foi infectado a taxas de 12,5% e 11,1% após 4 e 14 dias de incubação extrínseca, respectivamente, sem evidência de infecção disseminada observada nas pernas avaliadas, e nenhum vírus detectado na saliva(Figura 1a). O aumento do título para 5 log10 FFU/mL resultou em um aumento marginal da infectividade com taxas de 22,2%, 33,3% e 22,2% nos dias 4, 10 e 14 pós-infecções, respectivamente. Semelhante ao observado na coorte exposta a 4 log10 FFU/mL, não foram observadas infecções disseminadas ou competência de transmissão a qualquer momento(Figura 1b). No maior titulação examinado (6 log10 FFU/mL) não foram identificadas infecções após 2 dias de incubação, mas as infecções foram observadas em todos os outros pontos de tempo, chegando a 88,9% em 10 dias de incubação extrínseca. O ZIKV foi detectado nas pernas dos mosquitos examinados aos 10 e 14 dias após a infecção (22,2% e 66,7%, respectivamente), indicando que o ZIKV havia se disseminado no hemocoel, embora o ZIKV infeccioso tenha sido observado na saliva nestes pontos de tempo(Figura 1c).
A população de Ae. aegypti da República Dominicana mostrou-se a mais suscetível à infecção por ZIKV e foi competente após a exposição a todos os de farinha de sangue testados. Algum nível de infecção foi observado em todos os pontos de tempo nas três doses testadas, com a menor taxa observada 2 dias após a infecção em 4 log10 FFU/mL (25%) (Figura 1d). Com os peitos de farinha de sangue de 5troncos 10 e 6 log10 FFU/mL as taxas de infecção atingiram 100%, com infecção de 100% observada logo após 4 dias pós-infecção na população de mosquitos expostos a 6troncos 10 FFU/mL ZIKV(Figura 1e,f). Mosquitos alimentados com as três doses demonstraram disseminação por 7 dias após a infecção, pico de 44,4% (4 log10 FFU/mL, 14 dias pós-infecção), 88,9% (5 log10 FFU/mL, 1 e 14 dias pós-infecção) e 100% (6 log10 FFU/mL, 10 dias pós-infecção). A transmissão-competência foi observada após as três doses (11,1%, 22,2% e 22,2% aos 4, 5 e 6 log10 FFU/mL, respectivamente), mas apenas após um período de incubação extrínseca de 14 dias (EIP) (Figura 1d−f).
A população de Ae. aegypti do Vale do Rio Grande, TX, mostrou-se relativamente refratária à infecção pelo ZIKV. Mosquitos expostos a de farinha de sangue de 4 tronco10 FFU/mL, foram infectados já em 4 dias após a infecção, com taxas de infecção entre 22,2% e 44,4%. Com essas condições de exposição, foram observadas infecções disseminadas aos 14 dias pós-infecção a uma taxa de 11,1%, e não foi observada competência de transmissão(Figura 1g). Um aumento de dez vezes no título de farinha de sangue produziu um resultado em grande parte semelhante, com infecções observadas a partir de 4 dias após a exposição (33,3% e 44,4%), enquanto infecções disseminadas foram encontradas após 14 dias de incubação extrínseca a uma taxa de 22,2%(Figura 1h). Por fim, na coorte exposta a uma farinha de sangue de 6 log10 FFU/mL, observou-se infecção a partir do ponto de tempo pós-infecção de 2 dias (22,2%) e atingiu picos de 4, 10 e 14 dias após a infecção (66,7%). As infecções disseminadas nessa condição passaram a ser observadas aos 7 dias após a infecção (11,1%) e atingiram 44,4% aos 14 dias após a infecção. Observou-se que apenas um único mosquito (11,1%) foi operado com transmissão em 10 dias após a infecção(Figura 1i).
Figura 1: Dados representativos de competência vetorial de várias populações de Ae. aegypti para ZIKV Mex 1-7. (a−c) Competência vetorial do Ae. aegypti de Salvador, Brasil (F2). (d−f) Competência vetorial do Ae. aegypti da República Dominicana (F6). (g−i) Competência vetorial do Ae. aegypti do Vale do Rio Grande, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti exposto a 4 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti exposto a 5 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti exposto a 6 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. Em cada ponto de tempo (2, 4, 7, 10 e 14 dias pós-infecção) foi coletado e amostrado um subconjunto de mosquitos. As taxas de infecção, disseminação e transmissão são apresentadas como o número de amostras positivas de carcaça/perna/saliva sobre o número de mosquitos avaliados naquele momento. Infecção representada em azul, infecções disseminadas representadas em verde, e taxa de transmissão representada no vermelho. Os dados desta figura são modificados de Roundy e Azar et al.32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos aqui descritos fornecem um fluxo de trabalho generalizado para a realização de análises de competência vetorial. Como estrutura geral, muitas dessas metodologias são conservadas ao longo da literatura. No entanto, há espaço substancial para modificações (revisadas em Azar e Weaver1). Vírus (por exemplo, linhagem viral, armazenamento de vírus de desafio, histórico de passagem viral), entomologia (por exemplo, colonização laboratorial de populações de mosquitos, imunidade inata, microbioma/virome do mosquito) e variáveis experimentais (por exemplo, composição de farinha de sangue, alimentação sanguínea sequencial e temperatura de incubação) são conhecidas por afetar a competência vetorial. A variabilidade metodológica em estudos de competência tem se mostrado problemática no contexto do surto de ZIKV porque impediu as mecatálises formais1,33.
Dentro dessa metodologia geral, a importância da fome adequada de mosquitos e maquiagem de farinha de sangue não pode ser exagerada. A desidratação é conhecida por conduzir o comportamento de alimentação sanguínea de mosquitos em paradigmas laboratoriais34, ressaltando o valor da fome de açúcar e água antes de oferecer uma farinha de sangue infecciosa. Enquanto a privação de açúcar por 36-48 h e a água por 2-4 h antes da exposição à farinha de sangue é bem tolerada pelo Ae. aegypti,vale ressaltar que esses mosquitos são notoriamente fáceis de trabalhar em condições laboratoriais2. Tais regimes agressivos de fome podem não ser tão bem tolerados por outras espécies de mosquitos, necessitando de algum grau de otimização interna. Da mesma forma, o conteúdo da farinha de sangue pode ser informado pela preferência do host. Por exemplo, o uso de sangue humano para preparar uma farinha de sangue para mosquitos antropofílicos como o Ae. aegypti é inteiramente apropriado, mas as farinhas de sangue humanas feitas para espécies ornitofílicas como culex quinquefasciatus podem ser menos eficazes35. Além disso, no que diz respeito à montagem de farinha de sangue, o uso de produtos sanguíneos relativamente frescos é altamente aconselhável para minimizar a hemólise dos eritrócitos.
Uma das maiores limitações da avaliação da competência vetorial como um todo e dos procedimentos aqui descritos é que esses estudos estão em grande parte limitados à investigação de vírus que utilizam mosquitos que podem ser mantidos em condições laboratoriais. Ae. aegypti, embora um vetor altamente relevante para uma infinidade de patógenos de importância clínica, também passa a ser um dos mosquitos mais fáceis de criar e manter em colônias de laboratório1,31,36,37. Sem surpresa, a competência das populações de Ae. aegypti é, muitas vezes, a mais caracterizada entre os mosquitos vetoriais comuns2. Isso é particularmente problemático no contexto das arboviroses que mantêm os ciclos de transmissão enzoóticas e urbanas38,39,40, uma vez que a competência vetorial geralmente só é conduzida no contexto dos mosquitos urbanos mais tratáveis.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos a equipe do Centro Mundial de Referência para Vírus Emergentes e Arboviroses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, por seu trabalho incansável na curadoria e fornecimento de muitas das cepas virais usadas para nossos e outros grupos experimentos de competência vetorial. O trabalho apresentado foi financiado pelas bolsas McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e nih grants AI120942 e AI121452.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| 7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
| Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
| Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
| Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
| Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
| Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
| Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
| Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
| Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
| Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
| FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
| Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
| Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
| InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
| Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
| Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
| Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
| Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
| O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
| PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
| Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
| Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
| Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
| ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
| TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
| TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
| Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
| Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
References
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