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Neuroscience

एक चूहा मॉडल में केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर स्थान विशिष्ट रक्त मस्तिष्क बाधा खोलने के लिए एक बेंचटॉप दृष्टिकोण

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61113
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

माइक्रोबबल एजेंटों के साथ केंद्रित अल्ट्रासाउंड रक्त मस्तिष्क बाधा को फोकल और क्षणिक रूप से खोल सकता है। इस तकनीक का उपयोग रक्त मस्तिष्क बाधा में एजेंटों की एक विस्तृत श्रृंखला देने के लिए किया गया है। यह लेख एमआरआई मार्गदर्शन के साथ या बिना कृंतक मस्तिष्क को स्थानीयकृत वितरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Abstract

स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी कृंतक मस्तिष्क को स्थानीयकृत दवा और जीन वितरण के लिए सोने का मानक है। इस तकनीक में एक लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र के लिए सटीक स्थानीयकरण और लक्ष्य दुष्प्रभावों को कम करने सहित प्रणालीगत वितरण पर कई फायदे हैं। हालांकि, स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी अत्यधिक आक्रामक है जो इसकी ट्रांसलेशनल प्रभावकारिता को सीमित करती है, लंबे समय तक वसूली के समय की आवश्यकता होती है, और कई मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करते समय चुनौतियां प्रदान करती है। मिलीमीटर आकार के क्षेत्रों में रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को क्षणिक रूप से खोलने के लिए माइक्रोबबल्स परिसंचारी के साथ संयोजन में केंद्रित अल्ट्रासाउंड (FUS) का उपयोग किया जा सकता है। यह व्यवस्थित रूप से वितरित एजेंटों के इंट्राक्रैनियल स्थानीयकरण की अनुमति देता है जो सामान्य रूप से बीबीबी को पार नहीं कर सकते हैं। यह तकनीक स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के लिए एक गैर-विहीन विकल्प प्रदान करती है। हालांकि, आज तक इस तकनीक को उपकरणों और मानकीकृत तरीकों तक सीमित पहुंच के कारण तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से अपनाया जाना है। इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य FUS BBB खोलने (BBBO) के लिए एक बेंचटॉप दृष्टिकोण प्रदान करना है जो सस्ती और प्रजनन योग्य है और इसलिए किसी भी प्रयोगशाला द्वारा आसानी से अपनाया जा सकता है।

Introduction

बुनियादी तंत्रिका विज्ञान में कई खोजों के बावजूद, न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए उभरते उपचारों की संख्या अपेक्षाकृत सीमित1,2बनी हुई है। न्यूरोलॉजिकल विकारों में शामिल जीन, अणुओं और सेलुलर सर्किटरी की गहरी समझ ने वर्तमान तकनीकों के साथ मनुष्यों में आशाजनक उपचार का सुझाव दिया है3। प्रभावी उपचार अक्सर मस्तिष्क पेनेट्रेबल और साइट-विशिष्ट4, 5,6,7,8होने की आवश्यकता से सीमित होते हैं। हालांकि, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों (उदाहरण के लिए, इंजेक्शन या कैनुला के माध्यम से वितरण) के लिए स्थानीयकृत दवा वितरण के मौजूदा तरीके आक्रामक हैं और खोपड़ी9में एक खोलने की आवश्यकता होती है। इस सर्जरी की आक्रामकता मानव मस्तिष्क में स्थानीयकृत वितरण के नियमित उपयोग को रोकती है। इसके अतिरिक्त, ऊतक क्षति और परिणामस्वरूप भड़काऊ प्रतिक्रियाएं बुनियादी और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए सर्वव्यापी हैं जो इंट्रासैरेब्रल इंजेक्शन10पर भरोसा करते हैं। रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) में एजेंटों को गैर-आवास देने और उन्हें विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में लक्षित करने की क्षमता न्यूरोलॉजिकल विकारों के उपचार पर जबरदस्त प्रभाव डाल सकती है, जबकि साथ ही प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली जांच उपकरण प्रदान करती है।

कम से कम ऊतक क्षति के साथ बीबीबी में लक्षित परिवहन की एक विधि ट्रांसक्रैनियल फोकस्ड अल्ट्रासाउंड (फ्यूएस) है, जिसमें माइक्रोबबल्स के साथमिलकर बीबीबी 11 ,12,13,15,15,16को फोकल और क्षणिक रूप से खोलें। FUS BBB खोलने न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के उपचार के लिए हाल ही में ध्यान प्राप्त किया है, न्यूरोट्रोफिक कारक 17 , 18 ,19, जीन चिकित्सा 20 ,21, 22,एंटीबॉडी 23,न्यूरोट्रांसमीटर24और नैनोकणों25,26 ,28,29जैसे मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करनेकेलिए चिकित्सीय क्षेत्रों को स्थानीयकृत करके स्ट्रोक और ग्लियोमा । अनुप्रयोगों की अपनी विस्तृत श्रृंखला और इसकी गैर-वृद्धि प्रकृति30,31के साथ, फ्यूज बीबीबी उद्घाटन नियमित स्टीरियोटैक्सिक इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन का एक आदर्श विकल्प है। इसके अलावा, मनुष्यों में इसके वर्तमान उपयोग के कारण30,32,इस तकनीक का उपयोग करके प्रीक्लिनिकल जांच को अत्यधिक ट्रांसलेशनल माना जा सकता है। हालांकि, FUS BBB खोलने अभी तक पहुंच की कमी के कारण बुनियादी विज्ञान और पूर्व नैदानिक अनुसंधान में एक व्यापक रूप से स्थापित तकनीक हो गया है । इसलिए, हम इस तकनीक की स्थापना में रुचि रखने वाली प्रयोगशालाओं के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में FUS BBB खोलने के लिए एक बेंचटॉप दृष्टिकोण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

ये अध्ययन या तो एक उच्च शक्ति वाली हवा समर्थित FUS विशिष्ट अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर या कम शक्ति विमंदित केंद्रित अल्ट्रासोनिक विसर्जन ट्रांसड्यूसर के साथ आयोजित किए गए थे। ट्रांसड्यूसर को प्रतिक्रियाशील भार और एक मानक बेंचटॉप फ़ंक्शन जनरेटर के लिए डिज़ाइन किए गए आरएफ पावर एम्पलीफायर द्वारा संचालित किया गया था। इन मदों के लिए विवरण सामग्री की तालिकामें पाया जा सकता है ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं यूएबी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) दिशा-निर्देशों के अनुसार की गई थीं ।

1. फोकस्ड अल्ट्रासाउंड ड्राइविंग उपकरण सेटअप

  1. कनेक्ट करने के लिए 50 ओम कोक्सियल बीएनसी केबल का उपयोग करें (1) अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के इनपुट को आरएफ एम्पलीफायर के आउटपुट और (2) आरएफ एम्पलीफायर के इनपुट को फ़ंक्शन जेनरेटर के आउटपुट में करें।
  2. एक 1% शुल्क चक्र के साथ प्रति सेकंड एक बार साइनसॉयड फट करने के लिए समारोह जनरेटर मोड सेट करें।
    1. 50 डीबी आरएफ एम्पलीफायर के साथ उपयोग की जाने वाली 0.8 इंच फोकल दूरी के साथ विमंदित 1 मेगाहर्ट्ज कम पावर विसर्जन ट्रांसड्यूसर के लिए, शुरुआती सेटिंग्स को सेट करें: 1 मेगाहर्ट्ज ज्या तरंग, 1 वी पीक टू पीक, 10k चक्र, 1 अंतराल (या अवधि)।
    2. हवा समर्थित के लिए, 1.1 मेगाहर्ट्ज हाई-पावर ट्रांसड्यूसर, प्रारंभिक सेटिंग्स सेट करें: 1.1 मेगाहर्ट्ज ज्या तरंग, 50 एमवी पीक टू पीक, 11k चक्र, 1 एस अंतराल।
      नोट: जब तक वे जलमग्न न हों, तब तक ट्रांसड्यूसर का संचालन न करें। अल्ट्रासाउंड फोकस पर हाथ या शरीर के अन्य अंग न रखें या ऑपरेट करते समय ट्रांसड्यूसर चेहरे को टच न करें।

2. फोकस्ड अल्ट्रासाउंड बेंचटॉप सेटअप

  1. 3डी-स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम और स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम होल्डर को प्रिंट करें।
  2. एक पीवीसी पाइप(चित्रा 1a)पकड़े एक क्लैंप का उपयोग कर XYZ पोजिशनर के लिए ट्रांसड्यूसर कनेक्ट करें । बोल्ट एक्स-एक्सिस स्लाइड पर क्लैंप और एक विंग नट के साथ ताला ।
    1. यदि उच्च शक्ति वाले अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर रहे हैं, तो इसे मैग्नेट की एक मिलान जोड़ी का उपयोग करके पीवीसी पाइप से दें। सुनिश्चित करें कि एक चुंबक में एक छेद है और दूसरे में एक मिलान फलाव है। पीवीसी पाइप के नीचे कैप करें और एपॉक्सी का उपयोग करके चुंबकों में से एक को संलग्न करें (चित्रा 1bदेखें)।
    2. एपॉक्सी का उपयोग करके उच्च शक्ति वाले अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के शीर्ष केंद्र में दूसरा चुंबक संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि यह ट्रांसड्यूसर(चित्रा 1c)के केंद्र में है।
  3. यदि उच्च शक्ति वाले अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर रहे हैं, तो XYZ पोजिशनर को शून्य करने के लिए एक सूचक बनाएं। इस सूचक की नोक ट्रांसड्यूसर फोकस के केंद्र के अंतरिक्ष में स्थान को इंगित करती है जब अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर XYZ पोजिशनर से जुड़ा होता है। ट्रांसड्यूसर की फोकल दूरी की लंबाई के साथ-साथ ट्रांसड्यूसर(चित्र 1डी)की मोटाई के लिए 18 जी सुई कटौती से एक सूचक बनाएं।
    1. एक तीसरे चुंबक के लिए एपॉक्सी लागू करें (यह चुंबक पीवीसी कैप चुंबक के साथ भी जोड़ता है) और इसे सूचक के शीर्ष पर संलग्न करें। सूचक तो XYZ नल(चित्रा 1d)के लिए पीवीसी पाइप पर चुंबक को संलग्न करने में सक्षम हो जाएगा ।
  4. यदि कम शक्ति वाले विसर्जन ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर रहे हैं, तो सूचक और बढ़ते क्लिप के लिए फ़ाइल को 3डी-प्रिंट करें।
    1. पीवीसी पाइप पर बढ़ते क्लिप क्लिपिंग द्वारा पीवीसी पाइप के लिए कम शक्ति विसर्जन ट्रांसड्यूसर संलग्न करें और अंगूठी(चित्रा 1f)में ट्रांसड्यूसर डालें।
  5. एक साथ एक्रेलिक शीट से काटे गए टुकड़ों को एक साथ चिपकाकर पानी का स्नान करें जो स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम(चित्रा 1e)के ऊपर जानवर के सिर के शीर्ष पर आराम करने में सक्षम होंगे।
    1. स्नान के नीचे एक खोलने को काटें जो जानवर के सिर के आकार के बारे में है। पानी के स्नान में छेद को पॉलीमाइड टेप से ढक दें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि पानी पॉलीमाइड टेप के आसपास लीक न हो क्योंकि यह चूहे के फर को गीला कर सकता है और हाइपोथर्मिया का कारण बन सकता है।
  6. एमआरआई दृश्यमान तरल पदार्थ (जैसे, विटामिन ई तेल) के साथ 4 मिमी व्यास पतली खोल वाले प्लास्टिक या कांच के क्षेत्र को भरकर एमआरआई प्रत्ययी बनाएं और इसे सील करें। इसे एमआरआई फिड्यूशियल होल्डर में 3डी-प्रिंटेड स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम(चित्रा 2a)के दाईं ओर रखें ।
  7. पशु स्थिति के लिए एक अच्छे स्थान पर XYZ पोजिशनर के लिए 3डी-मुद्रित फ्रेम धारक को मजबूती से सुरक्षित करें। वाई-एक्सिस रेल पर मिलान चैनल में फ्रेम धारक के रोस्ट्रल छोर पर टैब स्लाइड करें और सेट शिकंजा(चित्रा 1h,लाल तीर) के साथ सुरक्षित करें।
  8. XYZ पोजिशनर ड्राइविंग के लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करके और कनवर्टर में प्लग करके एक कंप्यूटर पर सीरियल कनवर्टर के लिए यूएसबी स्थापित करें। पीसी पर रनटाइम पर्यावरण और मोटर नियंत्रक सॉफ्टवेयर स्थापित करें।
    1. सुनिश्चित करें कि कंट्रोलर सॉफ्टवेयर के फ्रंट पैनल पर पोर्ट सेलेक्शन ड्रॉपडाउन कंट्रोल में यूएसबी टू सीरियल कनवर्टर का चयन करके सॉफ्टवेयर में उचित सीरियल पोर्ट का चयन किया जाए। यूएसबी को 9-पिन सीरियल क्रॉसओवर केबल (जैसे, RS232 नल मॉडेम केबल) का उपयोग करके स्टेपर मोटर कंट्रोलर बॉक्स से सीरियल कनवर्टर से कनेक्ट करें।
    2. यह परीक्षण करने के लिए नियंत्रक सॉफ्टवेयर चलाएं कि स्टेपर मोटर्स को सॉफ्टवेयर नियंत्रण के तहत संचालित किया जा सकता है। इस कदम के लिए स्थानीय आईटी सहायता की सहायता की आवश्यकता हो सकती है।

3. इंट्राक्रैनियल लक्ष्यीकरण प्रक्रिया

नोट: इन प्रयोगों के लिए 250-350 ग्राम वजनी नर स्प्राग डावले चूहों का इस्तेमाल किया गया था। जानवरों को पानी और चूहा चाउ के लिए मुफ्त पहुंच था, और एक 12:12 घंटे प्रकाश पर बनाए रखा गया: अंधेरे चक्र ।

  1. जानवर को संज्ञाहरण (ऑक्सीजन के साथ 3% आइसोफ्लुन) के नीचे रखें और अंगुली चुटकी के जवाब की कमी की जांच करें। फिर कैथेटर नीचे बताए गए अनुसार डालें।
    1. बनाने के लिए एक दीपक के साथ पूंछ गर्म नस हिट करने के लिए आसान है। जानवर को गरम न करें या पूंछ को जलाने के लिए सावधान रहें।
    2. एक बार जब जानवर सो जाता है (पैर की अंगुली चुटकी का जवाब नहीं देता है), तो 24 जी पूंछ नस कैथेटर डालें जिसका उपयोग माइक्रोबबल, इवांस ब्लू डाई (ईबीडी), एमआरआई का उपयोग करने पर गाडोबुट्रोल एमआरआई कंट्रास्ट और ब्याज के प्रयोगात्मक एजेंट को वितरित करने के लिए किया जाएगा। एक बार नस मारा जाता है, खून म्यान भर जाएगा, धीरे से भीतर की सुई को दूर करते हुए नस में आगे म्यान धक्का ।
      नोट: स्टुअर्ट और श्रोडर३३ की तरह एक गाइड देखें अगर पहली बार चूहा पूंछ नस इंजेक्शन कर रही है ।
    3. यदि रक्त प्रवाह नहीं है, तो धीरे-धीरे कैथेटर म्यान को नस से बाहर ले जाएं ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि सुई ने नस के माध्यम से प्रहार किया हो। यदि कैथेटर को थोड़ा वापस खींच लिया जाता है, तो पहले प्रहार नस के माध्यम से चला गया और कैथेटर प्लेसमेंट को पूंछ पर किसी अन्य स्थान पर पुनः आरंभ करने की आवश्यकता होगी जो पिछले स्थान पर रोस्ट्रल है।
  2. कैथेटर प्लग को खारा भरें और कैथेटर पोर्ट के अंत में कैथेटर प्लग को स्क्रू करें जैसे ही पोर्ट खून से भर गया है। ध्यान से कैथेटर और पूंछ के आसपास प्रयोगशाला टेप लपेटें इसे जगह में रखने के लिए । शीर्ष पर एक छोटे से टुकड़े के साथ शुरू करें और कौडल दिशा में काम करें, कैथेटर प्लग के अंत को उजागर करते हैं।
  3. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम(चित्रा 2a)पर संज्ञाहरण कनेक्टर पर संज्ञाहरण लाइन प्लग और काटने बार पर मुंह रखकर और दोनों कान नहरों में कान सलाखों के मार्गदर्शन द्वारा फ्रेम में जानवरों के सिर को ठीक है, तो सेट शिकंजा कस । सुनिश्चित करें कि जानवरों के सिर सुरक्षित और स्तर है।
  4. जानवर को एमआरआई बेड में ले जाएं और एनेस्थीसिया लाइन को नाक शंकु से कनेक्ट करें। इस प्रोटोकॉल में एक 9.4 टी छोटे बोर पशु एमआरआई का इस्तेमाल किया गया था।
  5. कोरोनल और अक्षीय टी-2-भारित छवियां एकत्र करें जो पूरे मस्तिष्क के साथ-साथ एमआरआई प्रत्ययी(चित्रा 2b)को समन्वित मापन के लिए कैप्चर करते हैं। स्थानीय एमआरआई भौतिक विज्ञानी प्रदान करें या निम्नलिखित जानकारी तकनीकी ताकि वे एमआरआई प्रोटोकॉल का निर्माण कर सकें।
    1. कोरोनल छवियों(चित्रा 2b शीर्ष) के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: छवियों की संख्या: 27, चौड़ाई: 62.2 मिमी, ऊंचाई: 62.2 मिमी, गहराई: 37.97 मिमी, स्वर आकार: 0.24 x 0.24 x 1.41मिमी 3.
    2. अक्षीय छवियों के लिए(चित्र 2b नीचे), निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: छवियों की संख्या: 13, चौड़ाई: 61.47 मिमी, ऊंचाई: 53.81 मिमी, गहराई: 16.7 मिमी, स्वरील आकार: 0.41 x 0.21 x 1.29मिमी 3.
      नोट: जब तक विमान संकल्प में कोरोनल 0.25 मिमी के करीब है और छवियों पूरे मस्तिष्क और प्रत्ययी को कवर के रूप में इन सटीक मापदंडों के लिए आवश्यक नहीं है।
  6. एमआरआई प्रत्ययी से मस्तिष्क क्षेत्र है कि FUS के साथ लक्षित किया जाएगा करने के लिए दूरी रिकॉर्डिंग द्वारा उपरोक्त छवियों से समन्वय माप ले लीजिए।
    1. स्कैनर में, चरण 3.5 में एकत्र कोरोनल छवियों पर, उस छवि को ढूंढें जिसमें प्रत्यूषी सबसे बड़ा है, जो प्रत्यूषी के केंद्र का संकेत देता है। मिमी में ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के लिए प्रत्ययी के शीर्ष से दूरी रिकॉर्ड (एमआरआई सॉफ्टवेयर एक पैमाने या बिंदु माप उपकरण होगा, स्थानीय एमआरआई तकनीक या कैसे यह करने के लिए पर भौतिक विज्ञानी से परामर्श) दोनों मध्यागत/पार्श्व दिशा में और पृष्ठीय वेंट्रल दिशा में(चित्रा 2b,शीर्ष) ।
    2. स्कैनर में, चरण 3.5 में एकत्र अक्षीय छवियों पर, छवि है कि प्रत्ययी के बहुत ऊपर से पता चलता है और दोनों पृष्ठीय/ventral दिशा में लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र के लिए प्रत्ययी के केंद्र से दूरी को मापने और मध्य/पार्श्व दिशा में(चित्रा 2b, नीचे) लगताहै ।
    3. दो औसत/पार्श्व माप की तुलना करें और यदि वे औसत का उपयोग अलग कर रहे हैं । इन समन्वय माप XYZ पोजिशनर के साथ लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र के लिए FUS फोकल प्वाइंट मार्गदर्शन के लिए बाद में कदम ४.३ में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  7. एमआरआई प्रेग्नेंसी इमेज लीजिए। FUS BBB खोलने(चित्र 4)के बाद एकत्र छवियों के लिए इन छवियों की तुलना करें । T1-भारित छवियों को बाद में BBB खोलने की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, T2-भारित छवियों को बाद में यह सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि FUS उपचार३४के बाद कोई ऊतक क्षति नहीं हुई है ।
    1. टी 1-भारित अक्षीय छवियों के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: चौड़ाई: 30 मिमी, ऊंचाई: 51.2 मिमी, गहराई: 3.0 मिमी, स्वर आकार: 0.23 x 0.23 मिमी3,छवियों की संख्या: 13।
    2. टी 2-भारित अक्षीय छवियों के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: चौड़ाई: 30 मिमी, ऊंचाई: 51.2 मिमी, गहराई: 2.6 मिमी, स्वर आकार: 0.2 x 0.2 मिमी3,छवियों की संख्या: 13।
    3. टी 1-भारित कोरोनल छवियों के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: चौड़ाई: 30 मिमी, ऊंचाई: 30 मिमी, गहराई: 27 मिमी, स्वर आकार: 0.16 x 0.16 x 1मिमी 3,छवियों की संख्या: 27।
    4. टी 2-भारित कोरोनल छवियों के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: चौड़ाई: 30 मिमी, ऊंचाई: 30 मिमी, गहराई: 27 मिमी, स्वर आकार: 0.12 x 0.12 x 1मिमी 3,छवियों की संख्या: 27।
      नोट: चरण 3.5 के रूप में, इन इमेजिंग मापदंडों को सूचीबद्ध के समान नहीं होना चाहिए। इन छवियों में चरण 3.5 में एकत्र किए गए लोगों की तुलना में एक छोटा एफओवी और उच्च रिज़ॉल्यूशन है।
  8. जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखते हुए, एमआरआई बिस्तर से जानवर को बेंचटॉप फ्यूज सेटअप तक जल्दी से परिवहन करें। सुनिश्चित करें कि जानवर संज्ञाहरण के प्रभाव में स्थानांतरण के लिए सोते रहें।
  9. लंबे समय तक स्थानांतरण के समय के लिए, स्थानांतरण के लिए एक बॉक्स का उपयोग करें जो जानवर और फ्रेम को फिट करने के लिए काफी बड़ा है। एनेस्थीसिया प्लग के साथ अभी भी जुड़ा हुआ है, जानवर और बॉक्स के अंदर फ्रेम जगह है और अतिरिक्त आइसोफ्लुनाणे कुछ मिनट के लिए बॉक्स को भरने के लिए अनुमति देते हैं । संज्ञाहरण रेखा को अनप्लग करें और जल्दी से स्थानांतरित करें।

4. केंद्रित अल्ट्रासाउंड प्रक्रिया

  1. FUS बेंचटॉप सेटअप पर पहुंचने पर, तुरंत एनेस्थीसिया लाइन को नाक शंकु में प्लग करें और ऑक्सीजन के साथ 1.5-3% आइसोफलुनेन चलाना जारी रखें। जानवर के जागने से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके ऐसा करें।
  2. फ्रेम धारक में फ्रेम स्लाइड और यह जगह में मजबूती से तस्वीर । जानवर के सिर को शेव करने के लिए क़ैंची का इस्तेमाल करें। अतिरिक्त बालों को ब्रश करें और सिर पर हेयर रिमूवर क्रीम लगाएं। 3 मिनट के लिए बैठते हैं और पानी और धुंध के साथ दूर पोंछते हैं।
  3. यदि एमआरआई लक्ष्यीकरण के लिए उपलब्ध नहीं है, तो एक मानक (3डी-मुद्रित नहीं) स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम का उपयोग करें ताकि इंगकर्ता टिप को छूकर ब्रीग्मा को सूचक स्थिति को शून्य किया जा सके (इसके लिए एक खोपड़ी चीरा की आवश्यकता होगी) और सॉफ्टवेयर को रद्द करना या निर्देशांक रिकॉर्ड करना। सॉफ्टवेयर में अप 50 बटन पर क्लिक करके और ट्रांसड्यूसर के लिए सूचक स्वैप करके XYZ कैरिज को 50 मिमी तक ले जाएं। पहले35वर्णित चूहे के मस्तिष्क एटलस के आधार पर, सॉफ्टवेयर में कदम बटन का उपयोग करके वांछित मस्तिष्क निर्देशांक पर जाएं। यदि एमआरआई के बजाय इस विधि का उपयोग कर रहे हैं, तो धारा 4.6 पर छोड़ दें।
  4. यदि एमआरआई मार्गदर्शन का उपयोग कर रहे हैं, सूचक संलग्न करें और सूचक एमआरआई प्रत्ययी(चित्रा 1d,जी)के स्थान पर ले जाएं । बहुत ऊपर और एमआरआई प्रत्ययी के केंद्र में सूचक स्थिति (प्रत्ययी धारक के शीर्ष में एक छोटा सा छेद इशारा करने के लिए प्रदान की जाती है) । नल स्थिति बटन पर क्लिक करें जो बिंदु है जिसमें से एमआरआई छवि में सभी दूरी की गणना की गई थी ।
  5. सूचक को हटा दें और पोजिशनर को मध्यागत/पार्श्व निर्देशांक और रोस्ट्रल/कौडल निर्देशांक पर ले जाएं । पानी स्नान और अल्ट्रासाउंड जेल के प्लेसमेंट के लिए अनुमति देने के लिए अप 50 बटन दबाकर स्थिति को बढ़ाएं। अगर जेड-एक्सिस यात्रा के शीर्ष पर पहुंच जाता है, तो नलिंग स्थान अमान्य हो जाएगा। ट्रांसड्यूसर जोड़ने के बाद पृष्ठीय/वेंट्रल समन्वय स्थापित किया जाएगा।
  6. जानवर की खोपड़ी पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें और पॉलीमाइड टेप खिड़की के साथ जानवर के ऊपर पानी स्नान रखें जेल पर दबाया। सुनिश्चित करें कि अल्ट्रासाउंड जेल में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
  7. पानी स्नान को डिगास्ड पानी से भरें।
  8. यदि उच्च शक्ति वाले ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर रहे हैं, तो पोजिशनर को कम करें ताकि चुंबक पानी के ठीक ऊपर हो। हवा के बुलबुले को चेहरे के नीचे फंसने से रोकने और मैग्नेट को जोड़ने के लिए एक कोण पर पानी में ट्रांसड्यूसर को सावधानीपूर्वक कम करके ट्रांसड्यूसर को पोजिशनर से जोड़ें।
  9. यदि कम शक्ति वाले विसर्जन ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर रहे हैं, तो ट्रांसड्यूसर क्लिप के ठीक ऊपर पानी में पोजिशनर को कम करें। फिर हवा के बुलबुले को चेहरे के नीचे फंसने से रोकने के लिए धीरे-धीरे इसे एक कोण पर पानी में कम करके ट्रांसड्यूसर को क्लिप करें।
    नोट: बुलबुले के लिए ट्रांसड्यूसर चेहरे के नीचे देखते समय एक पारदर्शी स्नान सहायक होता है।
  10. पोजिशनर को पृष्ठीय/वेंट्रल समन्वय में कम करें।
  11. आरएफ पावर एएमपी चालू करें।
  12. कैथेटर प्लग और इंजेक्शन में सुई टिप चिपका कर 3% इवांस ब्लू डाई (ईबीडी) के 1 एमएल/किलो इंजेक्ट करें । इसे 5 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें।
  13. बुलबुला शेखर के साथ हिंसक रूप से मिलाते हुए माइक्रोबबल्स को सक्रिय करें।
    1. 5x माइक्रोबबल्स के 30 μL/kg की खुराक तैयार करें (बबल कॉन 1.2 x10 10/एमएल) 0.2 मिलील नमकीन में 2 FUS उपचार और 18 गे पंखों वाले जलसेक सेट में ट्यूबिंग के लिए खाते में। उदाहरण के लिए, यदि चूहे का वजन 200 ग्राम है, तो खारा के 1 मिलील में 30 माइक्रोबबल के साथ 18 जी सुई टिप युक्त सिरिंज भरें।
      नोट: पंखों वाले जलसेक सेट के साथ लेने और इंजेक्शन लगाने दोनों के लिए 18 जी सुई युक्तियों का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
    2. माइक्रोबबल्स का एक समान वितरण प्राप्त करने के लिए कई बार सिरिंज को उलटें। फिर पंखों वाले जलसेक सेट को संलग्न करें और भरें। जलसेक पंप पर सिरिंज की स्थिति और 6 एमएल/एच की दर से ०.२ एमएल देने के लिए जलसेक पंप सेट करें । यह 2-मिनट FUS एक्सपोजर पर माइक्रोबबल्स का धीमा अर्क प्रदान करेगा।
    3. कैथेटर प्लग में पंखों वाली सुई डालें।
  14. सबसे पहले, जलसेक पंप चलाएं, 3 एस प्रतीक्षा करें और फ़ंक्शन जनरेटर पर आउटपुट सक्षम बटन दबाकर FUS उपचार शुरू करें (सामग्री की तालिकामें फ़ंक्शन जनरेटर पर"लेबल") । माइक्रोबबल्स को साफ करने की अनुमति देने के लिए बीच में 5 मिनट के साथ प्रति क्षेत्र इन दो बार दोहराएं।
    1. जब जलसेक पंप 2 मिनट पर बंद हो जाता है तो FUS उपचार को रोकने के लिए फ़ंक्शन जनरेटर पर फिर से बटन दबाएं।
    2. माइक्रोबबल्स को साफ करने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। फिर जलसेक और दूसरा FUS उपचार शुरू करें।
    3. दूसरे FUS उपचार के तुरंत बाद, गैडोबुट्रोल कंट्रास्ट (यदि एमआरआई का उपयोग कर रहे हैं) और ब्याज के एजेंट, उदाहरण के लिए, वायरल कणों को इंजेक्ट करें। सभी एजेंटों की कुल वितरित मात्रा 5 एमएल/किलो से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
      नोट: ब्याज के एजेंट के डिलीवरी (उदाहरण के लिए, FUS BBB खोलने से पहले या बाद में) का समय उपयोग किए गए एजेंट के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  15. आरएफ पावर एम्प बंद करें और तुरंत पशु को एमआरआई में वापस परिवहन करें।

5. बीबीबी खोलने की एमआरआई पुष्टि

  1. यदि एमआरआई उपलब्ध नहीं है, तो धारा 6 पर छोड़ दें और बीबीबी खोलने की पुष्टि के लिए ईबीडी अभिव्यक्ति का उपयोग करें।
  2. पशु को एमआरआई बिस्तर पर वापस रखें सटीक एक ही स्थान पर चरण 3.7 में और संज्ञाहरण लाइन में प्लग करें।
  3. बीबीबी खोलने(चित्रा 3बी,ई)के क्षेत्र में गैडोबुट्रोल एमआरआई वृद्धि की कल्पना करने के लिए चरण 3.7 में उपयोग किए जाने वाले एक ही इमेजिंग मापदंडों के साथ एमआरआई पोस्ट स्कैन एकत्र करें।

6. परफ्यूजन और ऊतक संग्रह

  1. जब तक रक्त पूरी तरह से स्पष्ट नहीं होता है तब तक ठंडे 4% फॉर्मेलिन के साथ जानवर को पर्फ्यूज करें।
  2. मस्तिष्क को निकालें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% फॉर्मेलिन या पीएफए में रखें। इसके बाद, मस्तिष्क डूबने तक 30% सुक्रोज समाधान में मस्तिष्क रखें (लगभग 2-3 दिन)। अंत में, तरल नाइट्रोजन में या सूखी बर्फ पर फ्लैश फ्रीज करें और क्रायोस्ेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. अक्टूबर में मस्तिष्क को फ्रीज करें और क्रायोसेक्शन लें।
  4. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए खंडों को ठीक और कवर करें। ईबीडी उत्तेजन चोटियों पर 470 और 540 एनएम और उत्सर्जन चोटियों पर 680 एनएम पर। समग्र सेलुलर आकृति विज्ञान की कल्पना करने के लिए DAPI बढ़ते माध्यम के साथ कवरलिप।

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Representative Results

यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि माइक्रोबबल्स के साथ केंद्रित अल्ट्रासाउंड कम शक्ति विसर्जन ट्रांसड्यूसर(चित्रा 3)और फ़्यूस ट्रांसड्यूसर(चित्रा 4)दोनों के साथ ऊपर निर्दिष्ट मापदंडों का उपयोग करके स्थानीय बीबीबी खोलने को प्रेरित कर सकता है। सबसे पहले, शुरुआती प्रयोगों में, कम शक्ति वाले विसर्जन ट्रांसड्यूसर को एक मस्तिष्क गोलार्द्ध या तो पूर्वकाल(चित्रा 3b)या मध्य(चित्रा 3a)के लिए लक्षित किया गया था। जानवरों को तब 2 घंटे बाद परफ्यूजन(चित्रा 3a)या बिना परफ्यूजन(चित्रा 3b)और 10 माइक्रोन जमे हुए मस्तिष्क वर्गों के साथ बलिदान किया गया था। FUS BBB खोलने ईबीडी ऑटोफ्लोरेसेंस (उत्तेजन: 470 और 540 एनएम, उत्सर्जन: 680 एनएम) द्वारा लक्षित गोलार्द्ध (सफेद तीर चित्रा 3ए और3बी)द्वारा स्पष्ट किया गया था।

हमने ईबीडी ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ बीबीबी खोलने के स्पष्ट दृश्य के लिए जानवरों को छिद्रित करना सबसे अच्छा पाया है। हालांकि, BBB खोलने अभी भी रक्त वाहिकाओं(चित्रा 3b)समाशोधन के बिना कल्पना की जा सकती है । बीबीबी खुलने के बाद ईबीडी की सेलुलर तेज और निकासी बीबीबी खुलने के 30 मिनट बाद शुरू होती है और 24 घंटे37से अधिक बढ़ जाती है। ईबीबीडी ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ बीबीबी खोलने के मूल्यांकन के लिए, बीबीबी खोलने के 15 मिनट और 3 घंटे के बीच जानवर का बलिदान करना सबसे अच्छा है। हालांकि अंततः, बलिदान का समय उस एजेंट पर निर्भर करेगा जो दिया गया था। उदाहरण के लिए, एएवी अध्ययन में, बीबीबी खोलने के बाद 3 सप्ताह और एएवी डिलीवरी(चित्रा 5सी)उपयुक्त हो सकता है।

बाद के प्रयोगों में, FUS ट्रांसड्यूसर को या तो हिप्पोकैम्पस(चित्रा 4ए-सी)या पूर्वकाल सिंगुलेट कॉर्टेक्स(एसीसी) (चित्रा 4 डी-एफ)और ईबीडी के अलावा, एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट गाडोबुट्रोल (०.१ एमएल/किलो) को वीवो में बीबीबी के लक्षित उद्घाटन को सत्यापित करने के लिए आईवी इंजेक्ट किया गया था । चित्रा 4b,ई शो बढ़ाया एमआरआई विपरीत जहां gadobutrol विपरीत ऊतक में प्रवेश किया है 1 घंटे BBB खोलने और इसके विपरीत एजेंट इंजेक्शन के बाद । यह विपरीत परिवर्तन स्पष्ट है जब एमआरआई पूर्वान की तुलना FUS प्रक्रिया से पहले लिया(चित्रा 4a, d)। तब बीबीबी खुलने के 1.5 घंटे बाद जानवरों की बलि दी गई और 10 माइक्रोन क्रायोसेक्शन एकत्र किए गए। ईबीडी ऑटोफ्लोरेसेंस FUS लक्षित क्षेत्रों में स्पष्ट है और बीबीबी खोलने के स्थान का संकेत देता है(चित्रा 4सी, एफ)। यह आंकड़ा इस बात पर प्रकाश डालता है कि एमआरआई कंट्रास्ट को कभी-कभी देखना मुश्किल कैसे हो सकता है (जैसा कि चित्रा 4b और चित्रा 4e केबीच अंतर में); इसलिए, यह चित्रा 4fमें फ्लोरेसेंस माइक्रोग्राफ में के रूप में ईबीडी ऑटोफ्लोरेसेंस के विज़ुअलाइज़ेशन के साथ बीबीबी खोलने की पुष्टि करने के लिए उपयोगी है ।

यह आकलन करने के लिए कि क्या इस तकनीक का उपयोग हिप्पोकैम्पस में बीबीबी खोलने के तुरंत बाद लक्षित जीन डिलीवरी AAV9-hsyn-GFP और gadobutrol कंट्रास्ट के लिए किया जा सकता है , चतुर्थ (टाइटर: १.३२ x10 14 जीसी/एमएल, ०.०५ एमएल/किलो) इंजेक्शन थे । जानवर तो श्री BBB खोलने के बाद 30 मिनट छवि और 3 सप्ताह बाद perfusion द्वारा बलिदान किया गया । जीएफपी अभिव्यक्ति के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए 10 माइक्रोन क्रायोसेक्शन एकत्र किए गए थे। BBB खोलने लक्ष्य हिप्पोकैम्पस(चित्रा 5ए, बी)में gadobutrol विपरीत द्वारा स्पष्ट किया गया था । इसके अलावा, जीन वितरण ग्रीन फ्लोरेसेंस(चित्रा 5c)द्वारा स्पष्ट लक्ष्य हिप्पोकैम्पस में जीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा पुष्टि की गई थी । ध्यान दें कि इस समय बिंदु ईबीडी ने मंजूरी दे दी है और केवल वेंट्रिकल्स(चित्र 5सी)में स्पष्ट है।

Figure 1
चित्रा 1: FUS बेंचटॉप सेटअप। (a)XYZ पोजिशनर सहित FUS सेटअप, ट्रांसड्यूसर के अटैचमेंट के लिए 30 एमएम व्यास पीवीसी पाइप, 3डी प्रिंटेड स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम और इन्फ्यूजन पंप । (ख)पीवीसी पाइप का अंत छाया हुआ है, और एक चुंबक एपॉक्सी के साथ जुड़ा हुआ है । (ग)एक और मैचिंग चुंबक एपॉक्सी के साथ हाई-पावर ट्रांसड्यूसर के शीर्ष केंद्र से जुड़ा हुआ है । (घ)इसके अलावा, एमआरआई प्रत्ययी के शीर्ष और केंद्र में पोजिशनर को निरस्त करने के लिए एक और मिलान चुंबक सूचक से जुड़ा हुआ है। (ङ)सूचक को अंततः उच्च शक्ति वाले ट्रांसड्यूसर से बदल दिया जाता है और एक पानी स्नान को अल्ट्रासाउंड जेल के साथ जानवर के सिर में मिलाया जाता है। (च)कम शक्ति वाले विसर्जन ट्रांसड्यूसर को पीवीसी पाइप से 3डी प्रिंटेड ट्रांसड्यूसर क्लिप से अटैच किया जा सकता है। (छ)पोजिशनिंग के लिए ट्रांसड्यूसर को 3डी-प्रिंटेड पॉइंटर से बदल दिया जाता है और पोजिशनर को एमआरआई फिड्यूशियल के शीर्ष और केंद्र में निरस्त कर दिया जाता है । (ज)स्थिर 3डी-मुद्रित फ्रेम धारक एमआरआई के बाद जानवर को उसी स्थिति में वापस लाने की अनुमति देता है यदि कई FUS उपचारों की आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एमआरआई निर्देशित निर्देशांक के लिए एमआरआई प्रत्ययी के साथ स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम। (क)पशुओं को पहले एमआरआई प्रत्ययी से सुसज्जित 3डी-मुद्रित स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में तैनात किया जाता है । (ख)फ्रेम को एमआरआई बिस्तर के अंदर रखा जाता है और प्रत्ययी (बिंदीदार सर्कल) से लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र तक की दूरी को पृष्ठीय/वेंट्रल (डी/वी) मापन के लिए दोनों कोरोनल छवियों का उपयोग करके मापा जाता है और रोस्ट्रल/कौडल (आर/सी) माप, मध्यीय/पार्श्व (एम/एल) माप दोनों कुल्हाड़ियों से एकत्र किया जा सकता है । जानवरों को फ्रेम में रखा जाता है और एफयूएस स्टेशन में स्थानांतरित कर दिया जाता है जहां एक सूचक का उपयोग प्रत्ययी स्थान पर XYZ पोजिशनर को शून्य करने के लिए किया जाता है। सूचक को तब ट्रांसड्यूसर से बदल दिया जाता है और जिसे एकत्र किए गए निर्देशांक के आधार पर स्थानांतरित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: इवांस ब्लू डाई (ईबीडी) FUS BBB दोनों के साथ और बिना परफ्यूजन के खोलने की पुष्टि करता है । (क)10 माइक्रोन ब्रेन सेक्शन का माइक्रोग्राफ 2 घंटे बाद फ्यूज बीबीबी खुलने के बाद कम शक्ति वाले विसर्जन ट्रांसड्यूसर को मध्य बाएं गोलार्द्ध में लक्षित किया गया । यह एक जानवर की एक प्रतिनिधि छवि है जिसे ऊतक संग्रह से पहले 4% बफर फॉर्मेलिन के साथ किया गया था। बीबीबी उद्घाटन ईबीडी लाल ऑटोफ्लोरेसेंस (तीर) द्वारा स्पष्ट है। (ख)पूर्वकाल बाएं गोलार्द्ध के लिए लक्षित FUS BBB खोलने के 2 घंटे बाद 10 माइक्रोन ब्रेन सेक्शन का माइक्रोग्राफ । यह एक जानवर की एक प्रतिनिधि छवि है जो ऊतक संग्रह से पहले नहीं था, इसलिए, ईबीडी रक्त वाहिकाओं में रहता है। BBB खोलने स्पष्ट है, जहां EBD रक्त वाहिकाओं (तीर) से बाहर लीक हो गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: FUS BBB खोलने Gadobutrol एमआरआई विपरीत और EBD अभिव्यक्ति के साथ की पुष्टि की । एमआर छवियों से पहले(ए और डी)और बाद(बी और ई)BBB खोलने । गाडोबुट्रॉल कंट्रास्ट एन्हांसमेंट वीवो(बी और ई,तीर) में बीबीबी खोलने के स्थान की पुष्टि करता है। (ग)10 माइक्रोन ब्रेन सेक्शन जो हिप्पोकैम्पस (ब्लू डीएपीआई न्यूक्लियर दाग) में ईबीबीडी ऑटोफ्लोरेसेंस (लाल) के साथ बीबीबी खोलने की और पुष्टि दिखा रहा है । स्केल बार; ईबीडी लाल ऑटोफ्लोरेसेंस (तीर) द्वारा स्पष्ट पूर्वकाल सिंगुलेट कॉर्टेक्स में बीबीबी खोलने के बाद 10 माइक्रोन मस्तिष्क खंड का 500 माइक्रोन(एफ)माइक्रोग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: FUS BBB खोलने के माध्यम से हिप्पोकैम्पस के लिए AAV9-hsyn-GFP के स्थानीयकृत वितरण । एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट के साथ बीबीबी खोलने की एमआरआई पुष्टि, एमआरआई कंट्रास्ट (तीर) दोनों कोरोनल(ए)और अक्षीय(बी)T1-भारित छवियों में । (ग)फ्यूज में जीएफपी अभिव्यक्ति की हिस्टोलॉजिकल पुष्टि ने फ्यूज बीबीबी खोलने और AAV9-hsyn-GFP IV इंजेक्शन के 3 सप्ताह बाद हिप्पोकैम्पस (ग्रीन) को लक्षित किया । ब्लू समग्र सेलुलर आकृति विज्ञान के लिए DAPI परमाणु दाग इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हमने वैकल्पिक दृष्टिकोणों के साथ माइक्रोबबल असिस्टेड FUS BBB खोलने के लिए एक बेंचटॉप दृष्टिकोण का वर्णन किया, जिसमें एमआरआई मार्गदर्शन के साथ और बिना इंट्राक्रैनियल लक्ष्यीकरण के लिए दो अलग-अलग ट्रांसड्यूसर और तरीके शामिल हैं। वर्तमान में, प्रयोगशाला में एमआरआई-निर्देशित FUS BBB खोलने को स्थापित करने के लिए, उत्कृष्ट रेडी-टू उपयोग उपकरणों को खरीदने का विकल्प है जो उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस के साथ अत्यधिक मानकीकृत और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करते हैं। हालांकि ऐसे यंत्रों की लागत के लिए कई लैब तैयार नहीं हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करना है जो तकनीक में अपनी विशेषज्ञता बनाने के लिए कोई भी प्रयोगशाला स्थापित कर सकती है।

FUS BBB खोलने अब एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक है और यह अक्सर मामला है कि विभिन्न समूहों एजेंटों और एनेस्थेटिक्स की एक किस्म का उपयोग, जिनमें से प्रत्येक BBB खोलने और extravasation की डिग्री को प्रभावित कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस्तेमाल किए गए विशेष संवेदनाहारी बीबीबी खोलने के परिमाण को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करते समय इस पर विचार करना महत्वपूर्ण है38. यहां, एनेस्थेटिक आइसोफलुरेन का उपयोग किया जाता है क्योंकि जानवरों को प्रोटोकॉल की लंबाई के लिए आइसोफ्लुनाणे के तहत बनाए रखा जा सकता है और आइसोफ्लुरेन गैस के स्तर को जानवर की श्वसन दर और हृदय गति के आधार पर आसानी से समायोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, हमने ऑक्सीजन के साथ आइसोफ्लुनाणे दिया क्योंकि यह चिकित्सा हवा की तुलना में अधिक सुलभ था; हालांकि, मेडिकल एयर अधिक व्यापक BBB ओपनिंग39की अनुमति दे सकते हैं . कुछ एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट दूसरों की तुलना में इस प्रोटोकॉल के लिए अधिक उपयुक्त हैं। उदाहरण के लिए, हमारे हाथों में, गाडोतेरिडोल ने ऊतक पोस्टमॉर्टम में ईबीडी रिसाव स्पष्ट रूप से मौजूद होने पर भी कोई विपरीत वृद्धि नहीं की। माइक्रोबबल फॉर्मूलेशन भी महत्वपूर्ण है। यहां हम परफ्लुट्रेन लिपिड माइक्रोस्फीयर का उपयोग करते हैं। अन्य माइक्रोबबल फॉर्मूलेशन जैसे कि परफ्लुट्रेन प्रोटीन-प्रकार एक माइक्रोबबल आसानी से उपलब्ध हैं, लेकिन उपयोग किए जाने वाले माइक्रोबबल का प्रकार परिणामों को प्रभावित करेगा15।

फ़ंक्शन जनरेटर का नियंत्रण काफी भिन्न हो सकता है, इसलिए चरण 1 में सूचीबद्ध सेटिंग्स में प्रवेश करने के तरीके के निर्देशों के लिए मैनुअल का उल्लेख करें। उपयुक्त कमांड वोल्टेज (वी पीक टू पीक टू द फंक्शन जेनरेटर) ट्रांसड्यूसर गुणों, आरएफ एम्पलीफायर लाभ, ट्रांसड्यूसर मिलान के लिए आरएफ एम्पलीफायर, जानवर की उम्र और आकार, माइक्रोबबल प्रकार और एकाग्रता, और वांछित उपचार प्रभाव पर दृढ़ता से निर्भर करता है। चोटी से पीक वी के लिए परीक्षण और त्रुटि से निर्धारित करने की आवश्यकता होगी। चरण 1 में सुझाए गए सेटिंग्स से शुरू करें और हिस्टोलॉजिकल रूप से प्रभाव निर्धारित करें। यदि ऊतक क्षति है, तो चोटी को 10% से पीक वी तक कम करें और फिर से प्रयास करें। इसी तरह, अगर कोई BBBO है तो 10% से पीक वी करने के लिए चोटी बढ़ाने के लिए और फिर से प्रयास करें । एक वी के बहुत अधिक सेटिंग कम शक्ति विसर्जन ट्रांसड्यूसर को नुकसान पहुंचा सकता है । यह ट्रांसड्यूसर चेहरे के क्रैकिंग या विरूपण के रूप में स्पष्ट होगा। ट्रांसड्यूसर पर विनिर्माण लीड समय लंबा हो सकता है, इसलिए शुरू करते समय, हम बैकअप के रूप में एक से अधिक ट्रांसड्यूसर खरीदने का सुझाव देते हैं। अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर भी एम्पलीफायरों को नुकसान पहुंचा सकते हैं यदि वे अनुचित तरीके से मेल खाते हैं। सादगी और विश्वसनीयता के लिए, हम एक बीहड़ पावर एम्पलीफायर का उपयोग करने का सुझाव देते हैं जो जटिल भार (जैसे सामग्री तालिका में आरएफ पावर एम्पलीफायर) चला सकता है। ध्यान रहे कि जहां हाई-पावर ट्रांसड्यूसर मैचिंग सर्किट के साथ आता है, वहीं लो पावर विसर्जन ट्रांसड्यूसर नहीं होता है । सुझाए गए आरएफ एम्पलीफायर खराब मिलान वाले ट्रांसड्यूसर से परावर्तित शक्ति को संभाल सकते हैं, लेकिन इस विन्यास में कुछ एम्पलीफायर क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। इसके अलावा, यदि चरण 2.7 ड्राइवर और सॉफ्टवेयर स्थापित करने के बाद समस्याग्रस्त साबित होता है, तो डबल चेक करें कि सॉफ्टवेयर में उचित सीरियल पोर्ट का चयन किया जाता है। अगले एक अलग धारावाहिक केबल की कोशिश करो । यदि वह विफल रहता है, तो स्थानीय आईटी समर्थन की तलाश है ।

अनुभव से, यह मस्तिष्क क्षेत्र लक्ष्यीकरण में तंग सटीकता प्राप्त करने के लिए अभ्यास और कई समायोजन लेगा। यह शुरुआती प्रयोगों(चित्रा 3)और सबसे हालिया प्रयोगों(चित्र 5)के बीच लक्ष्यीकरण के मतभेदों में देखा जा सकता है। हमने क्लासिक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम का उपयोग करके प्रयोग शुरू किए और यदि 3डी प्रिंटर तक पहुंच नहीं है या कृंतक एमआरआई तक पहुंच नहीं है तो हम इसे यहां एक विकल्प के रूप में शामिल करते हैं। हालांकि, एमआरआई फिड्यूशियल्स के साथ एमआरआई-मार्गदर्शन और प्रदान किया गया 3 डी प्रिंट करने योग्य फ्रेम (या कस्टम डिजाइन का) आदर्श विधि है। सबसे पहले, यह जानवरों के बीच व्यक्तिगत मतभेदों के लिए खातों के बजाय एक औसत चूहा मस्तिष्क एटलस पर निर्भर जानवरों के भीतर निर्देशांक इकट्ठा । इसके अलावा, एमआरआई का उपयोग पोस्टमॉर्टम ईबीडी अभिव्यक्ति पर निर्भर होने के बजाय वीवो में फ्यूज स्थान लक्ष्यीकरण की पुष्टि की अनुमति देता है। यह महत्वपूर्ण है जब एजेंटों है कि इस तरह के AAVs(चित्रा 5)के रूप में प्रभाव लेने के लिए 24 घंटे से अधिक की आवश्यकता हो सकती है देने । अंत में, प्रदान किए गए फ्रेम धारक किसी भी लक्ष्यीकरण त्रुटियों को ठीक करने या निर्देशांक को फिर से करने के बिना अपर्याप्त बीबीबी खोलने के बाद FUS को दोहराने के लिए एमआरआई के बाद जानवर को वापस उसी स्थिति में लौटने की अनुमति देता है। पोर्टेबल 3 डी मुद्रित स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम 200 मिमी या व्यापक के एक स्पष्ट बोर के साथ किसी भी एमआरआई में इस्तेमाल किया जा सकता है।

लक्ष्य स्थान में रक्त वाहिका वितरण के आधार पर, खोपड़ीकी मोटाई 40,वेंट्रिकल्स की उपस्थिति, और अन्य कारक बीबीबी खोलने की डिग्री भिन्न हो सकती है। इस कारण से, हम फ्रेम और फ्रेम धारक के साथ बार-बार लक्षित करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं। लक्ष्यीकरण की सटीकता टार्गेटिंग पॉइंटर के संबंध में एक सुसंगत स्थान पर ट्रांसड्यूसर फोकस रखने पर गंभीर रूप से निर्भर करती है। इस सूचक की नोक ट्रांसड्यूसर फोकस के केंद्र के अंतरिक्ष में स्थान का संकेत देना चाहिए जब ट्रांसड्यूसर XYZ पोजिशनर से जुड़ा हो। मैग्नेट इस कोलोकैलाइजेशन को बनाए रखते हुए पॉइंटर और ट्रांसड्यूसर को आसानी से स्वैप करने की अनुमति देते हैं। चुंबक में छेद और फलाव के रूप में ठीक संभव के रूप में मैच चाहिए। इस संबंध में कोई भी परिवर्तनशीलता FUS फोकस लक्ष्यीकरण की पुनरावृत्ति को कम करती है। हालांकि, सूचक टिप और अल्ट्रासाउंड फोकस के बीच एक स्थानिक ऑफसेट होगा। एक बार जब यह पुष्टि हो जाती है कि ऑफसेट सुसंगत है, तो परिणामस्वरूप बीबीबी खोलने वाले स्थान (एमआरआई कंट्रास्ट का स्थान) और इच्छित लक्ष्य स्थान के मिमी में अंतर की गणना करने के लिए एमआर छवियों का उपयोग करके इसे ठीक किया जा सकता है। इस अंतर को तब शून्य स्थान में सकारात्मक असर किया जा सकता है। सटीकता और दोहराव भी एक ही अल्ट्रासाउंड आवृत्ति का उपयोग करने और प्रयोगों के एक दिए गए सेट में एक समान आकार और उम्र के चूहों का उपयोग करने से बहुत लाभ होता है। चूहे के मस्तिष्क और चूहे की खोपड़ी द्वारा अल्ट्रासाउंड क्षीणता आवृत्ति और खोपड़ी के आकार और खोपड़ी की मोटाई उम्र के साथ भिन्न होती है। खोपड़ी अल्ट्रासाउंड नाड़ी के संबंध में एक छोटी सी गुहा भी है और घटना अल्ट्रासाउंड खोपड़ी के अंदर प्रतिबिंब के साथ एक जटिल ध्वनि क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए बातचीत करती है जो ऊतक, खोपड़ी, आवृत्ति और ट्रांसड्यूसर40की स्थिति पर निर्भर है।

जैसा कि कहीं और कहा गया है, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य उत्कृष्ट एमआरआई संगत वाणिज्यिक समाधानों के लिए कम निवेश विकल्प प्रदान करना है जो पहले से ही खरीद के लिए उपलब्ध है। महत्वपूर्ण सीमाएं हैं जो लागत को कम रखने से परिणाम देती हैं। भौतिकी और कला की वर्तमान स्थिति को देखते हुए तकनीक के लिए निहित सीमाएं भी हैं। उल्लेखनीय है, इन सीमाओं के बावजूद, और जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, हम उपमिलीमीटर सटीकता के साथ चूहों के हिप्पोकैम्पस के लिए रंगों, कणों और वायरस की लगातार डिलीवरी प्राप्त कर सकते हैं। सबसे महत्वपूर्ण सीमाएं हैं कि (1) FUS फोकस का आकार बीच के ऊतकों और विशेष रूप से खोपड़ी के आकार और मोटाई पर निर्भर करता है {...}। FUS उपचार करने के लिए एमआरआई से जानवर को हटाने की आवश्यकता स्थानीयकरण और FUS फोकस की तीव्रता पर वास्तविक समय प्रतिक्रिया को रोकता है। इस वास्तविक समय की प्रतिक्रिया के बिना लक्ष्यीकरण स्थान के प्रत्येक संयोजन के लिए सेटिंग की पुष्टि करने के लिए कई प्रयोग किए जाने चाहिए। एक बार सेटिंग्स "में मिलाया" कर रहे हैं, हम अच्छी पुनरावृत्ति पाया है । (2) XYZ स्थिति और प्रत्ययी प्रणाली के रूप में निर्माण, जबकि सटीक, प्रयोग से प्रयोग करने के लिए स्थिति के समन्वय फ्रेम में सटीकता प्रदान नहीं करता है । XYZ घर के सापेक्ष स्थान, कृंतक की खोपड़ी, और फ्रेम प्रयोग से प्रयोग करने के लिए एक दूसरे के सापेक्ष स्थानांतरित कर सकते हैं । यह लक्ष्यीकरण के लिए एक एमआरआई छवि का उपयोग करके, FUS फोकस के सापेक्ष अंतरिक्ष में ज्ञात स्थान के साथ एक लक्ष्यीकरण सूचक और प्रत्ययी का उपयोग करके, एमआरआई समन्वय प्रणाली को सुनिश्चित करना XYZ पोजिशनर सिस्टम के समानांतर है, वास्तविक उपचार के सेट से पहले परीक्षण उपचार करके और एक सत्र के भीतर पूरी प्रक्रिया करके ताकि जानवर को फ्रेम में फिर से स्थापित करने की आवश्यकता न हो। ध्यान दें कि, क्योंकि केवल एक प्रत्ययी का उपयोग किया जाता है, फ्रेम घूर्णन सही नहीं हैं, इसलिए यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि एमआरआई बिस्तर और बोर के संबंध में फ्रेम स्तर है। संक्षेप में, सूचक स्थान सही FUS फोकस का संकेत नहीं देता है, लेकिन हमने पाया है कि ऑफसेट किसी दिए गए मस्तिष्क स्थान के अनुरूप है बशर्ते खोपड़ी अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के सापेक्ष नहीं घूमती हो। यह भी ध्यान दें कि बीबीबी खोलने और इमेजिंग के सापेक्ष गैडोबुट्रोल डिलीवरी का लगातार समय लगातार परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर यदि एमआरआई विपरीत परिवर्तन का उपयोग बीबीबी खोलने की राशि के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जाता है (36देखें)।

हमने पहली बार ऊपर वर्णित कम शक्ति वाले विसर्जन ट्रांसड्यूसर के साथ लैब में FUS BBB खोलना शुरू किया। हमने पाया कि यह इस तकनीक के साथ शुरू होने के लिए एक किफायती विकल्प है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन इंट्राक्रैनियल स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के लिए एक गैर-विहीन विकल्प प्रदान कर सकता है और इस तकनीक के साथ किए गए प्रीक्लीनिकल शोध को मनुष्यों में ट्रांसक्रैनियल फ्यूस के वर्तमान उपयोग के कारण अत्यधिक ट्रांसलेशनल माना जा सकता है30,32,41। एक बार एक प्रयोगशाला में स्थापित होने के बाद, इस तकनीक को स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के लिए एक गैर-विन्यास विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, एक सख्ती से खोजी उपकरण को एक अत्यधिक अनुवाद उपकरण में बदलना। हमारी प्रयोगशाला एमआरआई निर्देशित, वायरस और नैनोकणों के स्थानीयकृत वितरण के लिए इस तकनीक का उपयोग करने के लिए उपंयास, गैर इनवेसिव न्यूरोमॉड्यूलेशन तकनीक है कि स्वतंत्र रूप से जाग कृंतक और गैर मानव वानरों व्यवहार में इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित करेगा । वर्तमान काम डिजाइनर दवाओं पर विशेष रूप से डिजाइनर रिसेप्टर्स (खूंखार) के लिए डिज़ाइन किया गया है और एक्स-रे जैसे उच्च ऊर्जा कणों की कम खुराक के लिए न्यूरॉन्स के संवेदीकरण पर केंद्रित है। प्रयोगशाला भी इस प्रोटोकॉल के एक नए संस्करण पर काम कर रहा है कि एक मानव 3 टी स्कैनर में प्रदर्शन किया जा सकता है उपचार के दौरान जानवर को स्थानांतरित करने की जरूरत को खत्म करने और वास्तविक समय लक्ष्यीकरण प्रतिक्रिया की अनुमति है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को एनएसएफ ईपीएसकोआर रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर ग्रांट द्वारा क्लेमसन विश्वविद्यालय (1632881) को समर्थन दिया गया था। इसके अलावा, इस शोध को सिविटन इंटरनेशनल रिसर्च सेंटर, बर्मिंघम, अल द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। लेखकों ने बर्मिंघम स्मॉल एनिमल इमेजिंग शेयर्ड फैसिलिटी ग्रांट [NIH P30 CA013148] में अलबामा विश्वविद्यालय की सेवाओं और सुविधाओं के उपयोग को कृतज्ञता से स्वीकार किया। लेखक राजीव चोपड़ा को उनके समर्थन और मार्गदर्शन के लिए स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble shaker Lantheus Medical Imaging VMIX VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles
Catheter plug/ Injection cap SAI infusion technologies Part Number: IC Catheter plug/ Injection cap
Evans blue dye Sigma E2129-10G Evans blue dye
Function generator Tektronix AFG3022B Dual channel, 250MS/s, 25MHz
FUS transducer, 1.1MHz FUS Instruments TX-110 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone
Heating pad for Mice and Rats Kent Scientific PS-03 Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats
Infusion pump KD Scientific 780100 KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump
Kapton tape Gizmo Dorks https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
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Low power immersion transducer, 1MHz Olympus V303-SU Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF
Magnet sets WINOMO https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
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RF amplifier E&I A075 75W
Tail vein catheter BD 382512/ Fisher Item: NC1228513 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)
Ultrasound contrast microbubbles Lantheus Medical Imaging DE4, DE16 DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
Ultrasound gel Aquasonic https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		 Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle
Winged infusion sets, 22ga. Fisher Healthcare 22-258087 Terumo Surflo Winged Infusion Sets
motor controller software N/A N/A custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller
runtime environment for the motor controller software National Instruments LabView runtime engine version 2017 or better https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) Velmex
bolts Velmex MB-1 BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3
motor controller Velmex VXM-3 Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2
usb to serial converter Velmex VXM-USB-RS232 USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1
x-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
x-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
y-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
y-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis damper Velmex D6CL-6.3F D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
z-axis stepper motor Velmex PK266-03B-P2 Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
3D printable files
Immersion transducer mount and pointer https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaxic frame https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaxic frame holder https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T small bore animal MRI Bruker Bruker BioSpec 94/20 ParaVision version 5.1
AAV9-hsyn-GFP Addgene
Cream hair remover Church & Dwight Nair cream
gadobutrol MRI contrast agent Bayer Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotactic frame Stoelting #51500 not MRI compatible
turnkey FUS delivery device FUS Instruments RK-300 ready to use MRI compatible FUS for rodents

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References

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Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F., Bolding, M. A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model. J. Vis. Exp. (160), e61113, doi:10.3791/61113 (2020).

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