Summary
Fokusert ultralyd med mikroboble agenter kan åpne blod hjernebarrieren fokalt og forbigående. Denne teknikken har blitt brukt til å levere et bredt spekter av midler over blod hjernebarrieren. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for lokalisert levering til gnagerhjernen med eller uten MR-veiledning.
Abstract
Stereotoksisk kirurgi er gullstandarden for lokalisert legemiddel- og genlevering til gnagerhjernen. Denne teknikken har mange fordeler ved systemisk levering, inkludert presis lokalisering til en målhjerneregion og reduksjon av off target bivirkninger. Stereotoksisk kirurgi er imidlertid svært invasiv som begrenser dens translasjonelle effekt, krever lange gjenopprettingstider, og gir utfordringer når man målretter mot flere hjerneregioner. Fokusert ultralyd (FUS) kan brukes i kombinasjon med sirkulerende mikrobobler for å midlertidig åpne blodhjernebarrieren (BBB) i millimeterstore områder. Dette gjør det mulig å spore lokalisering av systemisk leverte agenter som normalt ikke kan krysse BBB. Denne teknikken gir et ikke-invasivt alternativ til stereotoksisk kirurgi. Men til dags dato denne teknikken har ennå ikke blitt allment vedtatt i nevrovitenskap laboratorier på grunn av begrenset tilgang til utstyr og standardiserte metoder. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en benkeplate tilnærming til FUS BBB åpning (BBBO) som er rimelig og reproduserbar, og kan derfor enkelt vedtas av ethvert laboratorium.
Introduction
Til tross for de mange funnene i grunnleggende nevrovitenskap, forblir antall nye behandlinger for nevroutvikling og nevrodegenerative lidelser relativt begrenset1,2. En dypere forståelse av gener, molekyler og cellulære kretser involvert i nevrologiske lidelser har foreslått lovende behandlinger urealiserbare hos mennesker med dagens teknikker3. Effektive behandlinger er ofte begrenset av behovet for å være hjernen penetrerbare og stedsspesifikke4,5,6,7,8. Imidlertid er eksisterende metoder for lokalisert legemiddellevering til bestemte hjerneregioner (f.eks. levering via injeksjon eller kanyle) invasive og krever en åpning som skal gjøres i skallen9. Invasiviteten av denne operasjonen forhindrer rutinemessig bruk av lokalisert levering inn i den menneskelige hjernen. I tillegg er vevsskader og de resulterende inflammatoriske responsene allestedsnærværende forvirrende for grunnleggende og prekliniske studier som er avhengige av intracerebral injeksjon10. Evnen til ikke-invasivt levere midler over blod hjernebarrieren (BBB) og målrette dem til bestemte hjerneregioner kan ha en enorm innvirkning på behandlinger for nevrologiske lidelser, samtidig som det gir et kraftig undersøkelsesverktøy for preklinisk forskning.
En metode for målrettet transport over BBB med minimal vevsskade er transkraniell fokusert ultralyd (FUS) sammen med mikrobobler for å fokalt og forbigående åpne BBB11,12,13,14,15,16. FUS BBB åpningen har fått nylig oppmerksomhet for behandling av nevrodegenerative lidelser, hjerneslag og gliom ved å lokalisere terapeutiske midler for å målrette hjerneregioner som nevrotrofiskefaktorer 17,18,19,genterapi20,21,22, antistoffer23, nevrotransmittere24, og nanopartikler25,26,27,28,29. Med sitt brede spekter av applikasjoner og dens ikke-invasive natur30,31,er FUS BBB-åpning et ideelt alternativ til rutinemessige stereotoksiske intrakranielle injeksjoner. Videre, på grunn av sin nåværende bruk hos mennesker30,32, prekliniske undersøkelser ved hjelp av denne teknikken kan betraktes som svært translasjonelle. FUS BBB-åpningen har imidlertid ennå ikke vært en allment etablert teknikk innen grunnleggende vitenskap og preklinisk forskning på grunn av mangel på tilgjengelighet. Derfor gir vi en detaljert protokoll for en benkeplate tilnærming til FUS BBB åpning som utgangspunkt for laboratorier som er interessert i å etablere denne teknikken.
Disse studiene ble utført med enten en høyeffekts luftstøttet FUS-spesifikk ultralydtransduser eller en laveffekts dempet fokusert ultralydsenkingstransduser. Transduserne ble drevet av en RF-effektforsterker designet for reaktive belastninger og en standard benkeplatefunksjonsgenerator. Du finner mer informasjon for disse elementene i materialstet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble gjort i samsvar med UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer.
1. Fokusert ultralyd kjøreutstyr oppsett
- Bruk 50 Ohm koaksiale BNC-kabler til å koble (1) inngangen til ultralydtransduseren til utgangen av RF-forsterkeren og (2) inngangen til RF-forsterkeren til utgangen av funksjonsgeneratoren.
- Sett funksjonsgeneratormodus til en sinusoid burst en gang per sekund med en 1% driftssyklus.
- For den dempede 1 MHz laveffekts nedsenkingstransduseren med en 0,8 tommers brennvidde som brukes med en 50 dB RF-forsterker, setter du startinnstillingene til: 1 MHz sinusbølge, 1 V-topp til topp, 10k syklus, 1 s intervall (eller periode).
- For den luftstøttede, 1,1 MHz høyeffekts transduseren, setter du de første innstillingene til: 1,1 MHz sinusbølge, 50 mV topp til topp, 11k sykluser, 1 s intervall.
MERK: Ikke bruk transduserne med mindre de er nedsenket. Ikke plasser en hånd eller annen kroppsdel på ultralydfokuset eller berør transduseransikten mens den er i drift.
2. Fokusert ultralyd benkeplate oppsett
- 3D-print stereotaktisk ramme og stereotaktisk rammeholder.
- Koble svingeren til XYZ-positioneren ved hjelp av en klemme som holder et PVC-rør (figur 1a). Skru klemmen fast på X-aksens glidebryter og lås med en vingemutter.
- Hvis du bruker ultralydtransduseren med høy effekt, fester du den til PVC-røret ved hjelp av et matchet par magneter. Sørg for at den ene magneten har et hull og den andre har et matchende fremspring. Cap bunnen av PVC-røret og fest en av magnetene til den ved hjelp av epoxy (se figur 1b).
- Fest den andre magneten til det øverste midten av ultralydtransduseren med høy effekt ved hjelp av epoksy. Kontroller at den er i midten av svingeren (figur 1c).
- Hvis du bruker ultralydtransduseren med høy effekt, må du lage en peker for å nullstille XYZ-positioneren. Spissen på denne pekeren indikerer plasseringen i rommet til midten av svingerfokuset når ultralydtransduseren er festet til XYZ-positioneren. Lag en peker ut av en 18 G nål kuttet for å være lengden på brennvidden av svingeren pluss tykkelsen på svingeren (Figur 1d).
- Påfør epoxy til en tredje magnet (denne magneten pares også med PVC cap magnet) og fest den til toppen av pekeren. Pekeren vil da kunne festes til magneten på PVC-røret for XYZ-nulling (figur 1d).
- Hvis du bruker svingeren for nedsenking med lavt strøm, skriver du ut filen for pekeren og monteringsklemmen 3D-utskrift.
- Fest svingeren med lav effekt nedsenking til PVC-røret ved å feste monteringsklemmen på PVC-røret og sett svingeren inn i ringen (figur 1f).
- Lag et vannbad ved å lime sammen stykker kuttet fra akrylark som vil kunne hvile på toppen av dyrets hode over den stereotaktiske rammen (figur 1e).
- Klipp en åpning i bunnen av badet som er omtrent på størrelse med dyrets hode. Dekk hullet i vannbadet med et polyimidebånd.
MERK: Det må tas hensyn til at vann ikke lekker rundt polyimidebåndet, da det kan våte rottens pels og forårsake hypotermi.
- Klipp en åpning i bunnen av badet som er omtrent på størrelse med dyrets hode. Dekk hullet i vannbadet med et polyimidebånd.
- Lag en MR-fiducial ved å fylle en 4 mm diameter tynnskallet plast eller glasssfære med en MR synlig væske (f.eks vitamin E olje) og forsegle den. Plasser den i MR-forføreren på høyre side av den 3D-trykte stereotaktiske rammen (figur 2a).
- Fest den 3D-trykte rammeholderen godt fast til XYZ-positioneren på et godt sted for dyrsposisjonering. Skyv tappen på rostralenden av rammeholderen inn i den matchende kanalen på Y-akseskinnen og fest med settskruer (figur 1t,røde piler).
- For kjøring av XYZ-positioneren, installer USB til seriell omformer på en datamaskin ved å følge produsentens anvisninger og koble til omformeren. Installer kjøretidsmiljøet og motorkontrollerprogramvaren på PC-en.
- Kontroller at riktig seriell port er valgt i programvaren ved å velge USB til seriell omformer i rullegardinkontrollen for portvalg på frontpanelet på kontrollerprogramvaren. Koble USB til seriell omformer til stepper motor controller boksen ved hjelp av en 9-pinners seriell crossover kabel (f.eks RS232 null modemkabel).
- Kjør kontrollerprogramvaren for å teste at steppermotorene kan drives under programvarekontroll. Dette trinnet kan kreve hjelp fra lokal IT-støtte.
3. Intrakraniell målrettingsprosedyre
MERK: HannSprague Dawley rotter som veier 250-350 g ble brukt til disse eksperimentene. Dyr hadde fri tilgang til vann og rotte chow, og ble opprettholdt på en 12:12 h lys: mørk syklus.
- Sett dyret under anestesi (3% isofluran med oksygen) og se etter mangel på respons på tåklemmen. Sett deretter inn kateteret som beskrevet nedenfor.
- Varm halen med en lampe for å gjøre er lettere å treffe venen. Vær forsiktig så du ikke overoppheter dyret eller for å brenne halen.
- Når dyret sover (reagerer ikke på en tåklem), sett inn 24 G halevenekateteret som skal brukes til å levere mikrobobler, Evans blå fargestoff (EBD), gadobutrol MR-kontrast hvis du bruker MR, og eksperimentell agent av interesse. Når venen er truffet, vil blodet fylle hylsen, fjern langsomt den indre nålen mens du skyver hylsen videre inn i venen.
MERK: Se en guide som Stuart og Schroeder33 hvis du gjør rottehaleveneinjeksjonene for første gang. - Hvis det ikke er blodstrøm, må kateterhylsen sakte flyttes ut av venen for å teste at nålen kan ha stukket gjennom venen. Hvis blodet strømmer når kateteret trekkes litt tilbake, gikk først poke gjennom venen og kateterplasseringen må startes på et annet sted på halen som er rostral til forrige plassering.
- Fyll kateterpluggen med saltvann og skru kateterpluggen inn i enden av kateterporten så snart porten er fylt med blod. Pakk labtapen forsiktig rundt kateteret og halen for å holde det på plass. Start med et lite stykke øverst og arbeid i caudal retning, slik at selve enden av kateterpluggen eksponeres.
- Plugg anestesilinjen til anestesikontakten på stereotaksisk ramme (figur 2a) og fest dyrene hodet inn i rammen ved å plassere munnen på bitebaren og ved å lede ørelinjene inn i begge ørekanaler, og stram deretter settskruene. Pass på at dyrene hodet er sikkert og nivå.
- Flytt dyret inn i MR-sengen og koble anestesilinjen til nesekjeglen. I denne protokollen ble det brukt en 9,4 T små fødte dyr MR.
- Samle koronar og aksial T2-vektede bilder som fanger hele hjernen samt MR-fiducial (Figur 2b) for koordinatmålinger. Gi den lokale MR-fysikeren eller teknologien følgende informasjon slik at de kan bygge MR-protokollen.
- For koronale bilder (Figur 2b topp), bruk følgende parametere: antall bilder: 27, bredde: 62,2 mm, høyde: 62,2 mm, dybde: 37,97 mm, Voxel størrelse: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
- For aksiale bilder (Figur 2b bunn), bruk følgende parametere: antall bilder: 13, Bredde: 61,47 mm, Høyde: 53,81 mm, Dybde: 16,7 mm, Voxel størrelse: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
MERK: Det er ikke nødvendig å ha disse eksakte parametrene så lenge koronen i planoppløsningen er nær 0, 25 mm og bildene dekker hele hjernen og fiducial.
- Samle koordinatmålinger fra bildene ovenfor ved å registrere avstanden fra MR-fiducial til hjerneområdet som vil bli målrettet med FUS.
- På skanneren, på de koronale bildene samlet i trinn 3.5, finner du bildet der fiducial er den største, noe som indikerer midten av fiducial. Registrer avstanden fra toppen av fiducial til hjernen regionen av interesse for mm (MR-programvaren vil ha en skala eller punkt måling verktøy, konsultere lokal MR tech eller fysiker om hvordan du gjør dette) i både mediale / lateral retning og i dorsal ventral retning (Figur 2b, topp).
- På skanneren, på aksiale bilder samlet i trinn 3.5, finne bildet som viser toppen av fiducial og måle avstanden fra midten av fiducial til målet hjernen regionen i både dorsal / ventral retning og i mediale / lateral retning (Figur 2b, bunn).
- Sammenlign de to mediale/ sidemålingene, og hvis de er forskjellige, bruker du gjennomsnittet. Disse koordinatmålingene vil bli brukt senere i trinn 4.3 for å lede FUS-fokuspunktet til målhjerneområdet med XYZ-positioneren.
- Samle MR prescan bilder. Sammenlign disse bildene med bildene som er samlet inn etter FUS BBB-åpning (figur 4). T1-vektede bilder vil senere bli brukt til å visualisere BBB-åpning, T2-vektede bilder vil senere bli brukt til å sikre at det ikke har oppstått vevsskader etter FUS-behandling34.
- For T1-vektede aksiale bilder bruker du følgende parametere: bredde: 30 mm, høyde: 51,2 mm, dybde: 3,0 mm, voxelstørrelse: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, antall bilder: 13.
- For T2-vektede aksiale bilder bruker du følgende parametere: bredde: 30 mm, høyde: 51,2 mm, dybde: 2,6 mm, voxelstørrelse: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, antall bilder: 13.
- For T1-vektede koronarbilder bruker du følgende parametere: bredde: 30 mm, høyde: 30 mm, dybde: 27 mm, voxelstørrelse: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, antall bilder: 27.
- For T2-vektede koronarbilder, bruk følgende parametere: bredde: 30 mm, høyde: 30 mm, dybde: 27 mm, voxel størrelse: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, antall bilder: 27.
MERK: Som i trinn 3.5 trenger ikke disse bildeparametrene være nøyaktig de samme som oppført. Disse bildene har en mindre FOV og høyere oppløsning enn de som samles inn i trinn 3.5.
- Hold dyret i stereotoksisk ramme, raskt transportere dyret fra MR-sengen til benkeplaten FUS oppsett. Sørg for at dyret forblir sovende for overføring under effekten av anestesi.
- For lengre overføringstider, bruk en boks for overføring som er stor nok til å passe dyret og rammen. Med anestesipluggen fortsatt festet, legg dyret og rammen inne i boksen og la overflødig isofluran fylle boksen i noen minutter. Koble fra anestesilinjen og raskt overføre.
4. Fokusert ultralyd prosedyre
- Ved ankomst til FUS benkeplate oppsett, umiddelbart koble anestesi linjen inn i nesen kjegle og fortsette å kjøre 1,5-3% isofluran med oksygen. Gjør dette så raskt som mulig for å unngå at dyret våkner.
- Skyv rammen inn i rammeholderen og fest den godt på plass. Bruk klippere til å barbere dyrets hode. Børste bort overflødig hår og bruke hårfjernerkrem på hodebunnen. La sitte i 3 min og tørk av med vann og gasbind.
- Hvis MR ikke er tilgjengelig for målretting, bruker du en standard (ikke 3D-trykt) stereotaktisk ramme for å nullstille pekerposisjonen til bregma ved å berøre pekerspissen til bregma (et hodebunnssnitt vil være nødvendig for dette) og oppheve programvaren eller registrere koordinatene. Flytt XYZ-vognen opp med 50 mm ved å klikke på opp 50-knappen i programvaren og bytte pekeren for svingeren. Basert på en rotte hjerneatlas som beskrevet tidligere35, flytte til ønsket hjernekoordinater ved hjelp av stepping knappene i programvaren. Hvis du bruker denne metoden i stedet for MR, går du ned til del 4.6.
- Hvis du bruker MR-veiledning, fester du pekeren og flytter pekeren til plasseringen av MR-fiducialen (figur 1d,g). Plasser pekeren helt øverst og midt på MR-fiducialen (et lite hull i toppen av fiducial holderen er gitt for å peke). Klikk nullposisjonsknappen som er punktet som alle avstander i MR-bildet ble beregnet fra.
- Fjern pekeren og flytt positioneren til de mediale/laterale koordinatene og rostral/caudal koordinatene. Hev positioneren opp ved å trykke på opp 50-knappen for å tillate plassering av vannbadet og ultralydgelen. Hvis toppen av Z-aksereisen er nådd, blir nullingsplasseringen ugyldiggjort. Dorsal/ventral koordinaten vil bli angitt etter at svingeren er lagt til.
- Påfør ultralydgel på dyrets hodebunn og legg vannbadet over dyret med polyimidetapevinduet presset på gelen. Pass på at det ikke er luftbobler i ultralydgelen.
- Fyll vannbadet med avgasset vann.
- Hvis du bruker høyeffektstransduseren, senker du positioneren slik at magneten er like over vannet. Fest svingeren til positioneren ved å forsiktig senke svingeren i vannet i en vinkel for å hindre at luftbobler blir fanget under ansiktet og koble magnetene.
- Hvis du bruker svingeren for nedsenking med lavt strøm, senker du positioneren i vannet like over transduserklemmen. Fest deretter svingeren på plass ved å senke den langsomt ned i vannet i en vinkel for å hindre at luftbobler blir fanget under ansiktet.
MERK: Et gjennomsiktig bad er nyttig når du ser under svingeransikten for bobler. - Senk positioneren til dorsal/ventral koordinaten.
- Slå på RF-strøm-forstersen.
- Injiser 1 ml/kg 3 % blått fargestoff fra Evans (EBD) ved å stikke kanylespissen inn i kateterpluggen og injeksjonen. La den sirkulere i 5 min.
- Aktiver mikroboblene ved å riste dem voldsomt med bobleshakeren.
- Forbered 5x dosen på 30 μL/kg mikroboble (boblekonk. 1,2 x 1010/ml) i 0,2 ml saltvann for å ta høyde for 2 FUS-behandlinger og slangen i det 18 G bevingede infusjonssettet. Hvis for eksempel rotten veier 200 g, fyller du sprøyten som inneholder 18 G nålespiss med 30 μL mikrobobler i 1 ml saltvann.
MERK: Pass på at du bruker 18 G nålespisser for både å ta og injisere med det bevingede infusjonssettet. - Inverter sprøyten flere ganger for å få en jevn fordeling av mikrobobler. Fest deretter og fyll det bevingede infusjonssettet. Plasser sprøyten på infusjonspumpen og sett infusjonspumpen til å levere 0,2 ml med en hastighet på 6 ml/t. Dette vil gi langsom infusjon av mikroboblene over 2-min FUS-eksponeringen.
- Sett den bevingede nålen inn i kateterpluggen.
- Forbered 5x dosen på 30 μL/kg mikroboble (boblekonk. 1,2 x 1010/ml) i 0,2 ml saltvann for å ta høyde for 2 FUS-behandlinger og slangen i det 18 G bevingede infusjonssettet. Hvis for eksempel rotten veier 200 g, fyller du sprøyten som inneholder 18 G nålespiss med 30 μL mikrobobler i 1 ml saltvann.
- Kjør først infusjonspumpen, vent 3 s og start FUS-behandlingen ved å trykke på utløserknappen på funksjonsgeneratoren (merket "på" på funksjonsgeneratoren i materialstabellen). Gjenta disse to ganger per region med 5 min i mellom for å la mikroboblene fjerne.
- Trykk på på-knappen igjen på funksjonsgeneratoren for å stoppe FUS-behandlingen når infusjonspumpen stopper ved 2 min.
- Vent i 5 min til mikroboblene skal rydde. Start deretter infusjonen og den andre FUS-behandlingen.
- Umiddelbart etter den andre FUS-behandlingen injiserer gadobutrolkontrast (hvis du bruker MR) og interessemiddelet, for eksempel viruspartikler. Totalt levert volum av alle agenter bør ikke overstige 5 ml/kg.
MERK: Leveringstidspunktet (f.eks. før eller etter FUS BBB-åpning) av interesseagenten kan variere avhengig av agenten som brukes.
- Slå av RF-strøm-ampen og transporter dyret umiddelbart tilbake til MR.
5. MR-bekreftelse på BBB-åpning
- Hvis MR ikke er tilgjengelig, går du til del 6 og bruker EBD-uttrykk for bekreftelse av BBB-åpning.
- Plasser dyret tilbake på MR-sengen på nøyaktig samme sted som i trinn 3.7 og koble til anestesilinjen.
- Samle MR-innleggsskanninger med de samme bildeparametrene som ble brukt i trinn 3.7 for å visualisere gadobutrol MR-forbedring i regionen BBB-åpning (figur 3b,e).
6. Innsamling av perfusjon og vev
- Perfuse dyret med kaldt 4% formalin til blodet går helt klart.
- Fjern hjernen og legg i 4% formalin eller PFA ved 4 ° C over natten. Deretter plasserer du hjernen i 30% sukroseløsning til hjernen synker (ca. 2-3 dager). Til slutt, blits fryse i flytende nitrogen eller på tørris og lagre ved -80 ° C til kryoseksjon.
- Frys hjernen i OCT og ta kryoseksjoner.
- Fest og dekkslipseksjoner for fluorescensmikroskopi. EBD eksitasjon topper på 470 og 540 nm og utslipp topper på 680 nm. Dekkglass med DAPI monteringsmedium for å visualisere total cellulær morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi at fokusert ultralyd med mikrobobler kan indusere lokalisert BBB-åpning ved hjelp av parametrene som er angitt ovenfor med både laveffekts nedsenkingstransduseren (figur 3) og FUS-svingeren (figur 4). Først, i tidlige eksperimenter, lav effekt nedsenking transduseren var rettet mot en hjerne halvkule enten fremre (Figur 3b) eller mediale (Figur 3a). Dyr ble deretter ofret 2 timer senere med perfusjon (figur 3a) eller uten perfusjon (figur 3b) og 10 μm frosne hjerneseksjoner ble samlet inn. FUS BBB åpningen var tydelig av EBD autofluorescence (eksitasjon: 470 og 540 nm, utslipp: 680 nm) i mål halvkule (hvite piler Figur 3a og 3b).
Vi har funnet det best å perfuse dyrene for klar visualisering av BBB åpning med EBD autofluorescence. BBB-åpning kan imidlertid fortsatt visualiseres uten å fjerne blodårene (figur 3b). Cellulær opptak og klaring av EBD etter BBB-åpning begynner så snart som 30 minutter etter BBB-åpning og øker over 24 timer37. For evaluering av BBB åpning med EBD autofluorescence, er det best å ofre dyret mellom 15 minutter og 3 timer med BBB åpning. Selv om til slutt vil offertiden avhenge av agenten som ble levert. I en AAV-studie kan for eksempel 3 uker etter BBB-åpning og AAV-levering (figur 5c) være hensiktsmessig.
I senere eksperimenter ble FUS-transduseren rettet mot enten hippocampus (figur 4a-c ) eller den fremre cingulate cortex (ACC) (figur 4 d-f) og i tillegg til EBD bleMR-kontrastmiddeletgadobutrol (0,1 ml/kg) injisert for å verifisere målrettet åpning av BBB in vivo. Figur 4b,e viser forbedret MR-kontrast der gadobutrolkontrasten har kommet inn i vevet 1 time etter BBB åpning og kontrastmiddel injeksjon. Denne kontrastendringen er tydelig når man sammenligner med MR-prescans tatt før FUS-prosedyren (figur 4a, d). Dyr ble deretter ofret ved perfusjon 1,5 timer etter BBB åpning og 10 μm kryoseksjoner ble samlet inn. EBD autofluorescence er tydelig i FUS målrettede regioner som ytterligere indikerer plasseringen av BBB-åpning (figur 4c, f). Dette tallet fremhever hvordan MR-kontrast noen ganger kan være vanskelig å se (som i forskjellen mellom figur 4b og figur 4e); Derfor er det nyttig å bekrefte BBB åpning med visualisering av EBD autofluorescence som i fluorescens mikrograf i figur 4f.
For å vurdere om denne teknikken kunne brukes til målrettet genlevering AAV9-hsyn-GFP og gadobutrol kontrast ble injisert IV (titer: 1.32 x 1014 GC/ml, 0.05 ml/kg) umiddelbart etter BBB åpning i hippocampus. Dyret ble deretter MR avbildet 30 minutter etter BBB åpning og ofret 3 uker senere av perfusjon. 10 μm kryoseksjoner ble samlet inn for fluorescerende avbildning av GFP-uttrykk. BBB åpningen var tydelig av gadobutrol kontrast i målet hippocampus (Figur 5a,b). I tillegg ble genlevering bekreftet av GFP-uttrykk i målet hippocampus tydelig av grønn fluorescens (figur 5c). Merk at på dette tidspunktet har EBD ryddet ut og er bare tydelig i ventriklene (figur 5c).
Figur 1: FUS benkeplateoppsett. (a) FUS-oppsett, inkludert XYZ-positioneren, et PVC-rør med 30 mm diameter for feste av svingeren, den 3D-trykte stereotoksiske rammen og infusjonspumpen. (b) Enden av PVC-røret er avkortet, og en magnet er festet til den med epoksy. (c) En annen matchende magnet er festet til det øverste midten av høyeffektstransduseren med epoksy. (d) I tillegg er en annen matchende magnet festet til pekeren for å nullstille positioneren øverst og i midten av MR-fidukialen. Pekerenerstattes til slutt med høyeffektstransduseren, og et vannbad er sammenlignet med dyrets hode med ultralydgel. (f)Den laveffekts nedsenkingstransduseren kan festes til PVC-røret med 3D-trykt transduserklips. (g) For posisjonering erstattes svingeren med den 3D-trykte pekeren, og positioneren er nullet øverst og midt i MR-fidukialen. (h)Den stasjonære 3D-trykte rammeholderen gjør det mulig for dyret å bli returnert til samme posisjon etter MR hvis flere FUS-behandlinger er nødvendig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Stereotoksisk ramme med MR-fiducial for MR-styrede koordinater. (a) Dyr plasseres først i en 3D-trykt stereotoksisk ramme utstyrt med en MR-fiducial. (b) Rammen plasseres deretter inne i MR-sengen og avstanden fra den fiducial (stiplede sirkelen) til målhjerneområdet måles ved hjelp av både koronarbilder for dorsal /ventrale (D/V) målinger og aksiale bilder for rostral/caudal (R/C) målinger, medial /lateral (M/L) måling kan samles fra begge akser. Dyr holdes i rammen og overføres til FUS-stasjonen der en peker brukes til å nullstille XYZ-positioneren på stedet av fiducial. Pekeren erstattes deretter med svingeren og som deretter kan flyttes basert på koordinatene som samles inn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Evans blå fargestoff (EBD) bekrefter FUS BBB åpning både med og uten perfusjon. (a)Mikrograf av en 10 μm hjerneseksjon 2 timer etter FUS BBB-åpning med laveffekts nedsenkingstransduser rettet mot den mediale venstre halvkule. Dette er et representativt bilde av et dyr som ble perfundert med 4% bufret formalin før vevsamling. BBB åpningen er tydelig av EBD rød autofluorescence (pil). (b)Mikrograf av en 10 μm hjerneseksjon 2 timer etter FUS BBB åpning rettet mot fremre venstre halvkule. Dette er et representativt bilde av et dyr som ikke var perfundert før vevssamling, derfor forblir EBD i blodårene. BBB åpningen er tydelig der EBD har lekket ut av blodårene (pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: FUS BBB åpning bekreftet med Gadobutrol MR kontrast og EBD uttrykk. MR-bilder før (a og d) og etter (b og e) BBB åpning. gadobutrol kontrast ekstrautstyr bekrefter plasseringen av BBB åpning in vivo (b og e, piler). (c) 10 μm hjerneseksjon som viser ytterligere bekreftelse på BBB-åpning med EBD autofluorescence (rød) i hippocampus (blå DAPI kjernefysisk flekk). Skala bar; 500 μm. (f) Mikrograf av en 10 μm hjerneseksjon etter BBB-åpning i den fremre cingulate cortex tydelig av EBD rød autofluorescence (pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Lokalisert levering av AAV9-hsyn-GFP til hippocampus via FUS BBB-åpning. MR-bekreftelse av BBB-åpning med MR-kontrastmiddel, MR-kontrast (piler) i både koronar ( a ) ogaksial(b) T1-vektede bilder. (c)histologisk bekreftelse av GFP-uttrykk i FUS målrettet hippocampus (grønn) 3 uker etter FUS BBB åpning og AAV9-hsyn-GFP IV injeksjon. Blå indikerer DAPI kjernefysisk flekk for generell cellulær morfologi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en benkeplate tilnærming til mikroboble assistert FUS BBB åpning med alternative tilnærminger inkludert, to forskjellige transdusere og metoder for intrakraniell målretting med og uten MR-veiledning. For øyeblikket, for å etablere MR-guidet FUS BBB-åpning i laboratoriet, er det mulighet til å kjøpe gode enheter som er klare til bruk som gir svært standardiserte og reproduserbare resultater med brukervennlige grensesnitt. Imidlertid er mange laboratorier ikke forberedt på kostnaden av slike instrumenter. Derfor er hovedmålet med denne protokollen å gi et utgangspunkt som enhver lab kan etablere for å bygge sin kompetanse i teknikken.
FUS BBB åpningen er nå en mye brukt teknikk, og det er ofte slik at ulike grupper benytter en rekke agenter og anestetika, som hver kan påvirke graden av BBB åpning og ekstravasasjon. Viktigere, den spesielle bedøvelse som brukes kan påvirke omfanget av BBB åpning så det er viktig å vurdere dette når du utfører denne protokollen38. Her brukes bedøvelsesisofluran fordi dyr kan opprettholdes under isofluran for lengden av protokollen og nivåer av isoflurangass lett kan justeres basert på dyrets respirasjonshastighet og hjertefrekvens. I tillegg leverte vi isofluran med oksygen fordi det var mer tilgjengelig enn medisinsk luft; Medisinsk luft kan imidlertid tillate mer omfattende BBB-åpning39. Noen MR-kontrastagenter er mer passende for denne protokollen enn andre. For eksempel, i våre hender, gadoteridol produsert ingen kontrast ekstrautstyr selv når EBD lekkasje var tydelig til stede i vev postmortem. Mikroboble formulering er også viktig. Her bruker vi perflutren lipid mikrosfærer. Andre mikroboble formuleringer som perflutren protein-type A mikrobobler er lett tilgjengelig, men typen mikroboble som brukes vil påvirke resultatene15.
Kontroller av funksjonsgeneratorer kan variere ganske mye, så se manualen for instruksjoner om hvordan du angir innstillingene som er oppført i trinn 1. Riktig kommandospenning (V-topp til topp på funksjonsgeneratoren) avhenger sterkt av transduserens egenskaper, RF-forsterkerforsterkning, RF-forsterker til transdusermatching, dyrets alder og størrelse, mikrobobletypen og konsentrasjonen og ønsket behandlingseffekt. Toppen til topp V må bestemmes av prøving og feiling. Start med innstillingene foreslått i trinn 1 og bestem effekten histologisk. Hvis det er vevsskade, senk toppen til topp V med 10% og prøv igjen. Likeledes, hvis det ikke er BBBO deretter heve toppen til topp V med 10% og prøve igjen. Hvis du setter for høyt på en V, kan det skade svingeren for nedsenking av lav effekt. Dette vil være tydelig som en sprekker eller forvrengning av transduseransikten. Produksjonsledende tider på transdusere kan være lange, så når du starter, foreslår vi at du kjøper mer enn én svinger som en sikkerhetskopi. Ultralydtransdusere kan også skade forsterkere hvis de er feil matchet. For enkelhets skyld og pålitelighet foreslår vi at du bruker en robust effektforsterker som kan drive komplekse belastninger (for eksempel RF-effektforsterkeren i materialtabellen). Vær oppmerksom på at selv om svingeren med høy effekt leveres med en matchende krets, gjør ikke svingeren for lav effektsenking. Den foreslåtte RF-forsterkeren kan håndtere den reflekterte kraften fra den dårlig tilpassede svingeren, men noen forsterkere kan bli skadet i denne konfigurasjonen. Også, hvis trinn 2.7 viser seg problematisk etter installasjon av driveren og programvaren, dobbeltsjekk at riktig seriell port er valgt i programvaren. Prøv deretter en annen seriell kabel. Hvis det mislykkes, kan du søke lokal IT-støtte.
Av erfaring vil det ta praksis og flere justeringer for å oppnå tett nøyaktighet i hjernens region målretting. Dette kan sees i forskjellene mellom målretting mellom de tidlige forsøkene (figur 3) og de nyeste eksperimentene (figur 5). Vi begynte eksperimentene ved hjelp av en klassisk stereotoksisk ramme, og vi inkluderer det som et alternativ her hvis det ikke er tilgang til en 3D-skriver eller hvis det ikke er tilgang til gnager MR. MR-veiledning med MR-fidusialer og den 3D utskrivbare rammen som følger med (eller av en tilpasset design) er imidlertid den ideelle metoden. For det første står det for individuelle forskjeller mellom dyr ved å samle koordinater i dyret i stedet for å stole på et gjennomsnittlig rottehjerneatlas. I tillegg tillater bruk av MR bekreftelse av FUS plassering målretting in vivo i stedet for å stole på postmortem EBD uttrykk. Dette er viktig når du leverer agenter som kan kreve mer enn 24 timer for å tre i kraft, for eksempel AAVs (figur 5). Til slutt gjør rammeholderen det gir mulig å returnere dyret tilbake til samme posisjon etter MR for å fikse eventuelle målrettingsfeil eller å gjenta FUS etter utilstrekkelig BBB-åpning uten å måtte gjøre om koordinatene. Den bærbare 3D-trykte stereotoksiske rammen kan brukes i en hvilken som helst MR med en klar boring på 200 mm eller bredere.
Avhengig av blodkarfordelingen på målstedet, skallentykkelse 40, tilstedeværelsen av ventrikler, og andre faktorer graden av BBB åpningen kan variere. Av denne grunn gir vi en metode for gjentatt målretting med rammen og rammeholderen. Nøyaktigheten av målrettingen avhenger kritisk av å holde svingerfokuset på et konsistent sted med hensyn til målrettingspekeren. Spissen på denne pekeren skal indikere plasseringen i midten av svingerfokuset når svingeren er festet til XYZ-positioneren. Magnetene gjør at pekeren og svingeren enkelt kan byttes samtidig som denne kolokaliseringen opprettholdes. Hullet og fremspringet i magnetene skal samsvare så nøyaktig som mulig. Eventuell variasjon i denne tilkoblingen reduserer repeterbarheten til FUS-fokusmålrettingen. Det vil imidlertid være en romlig forskyvning mellom pekerspissen og ultralydfokuset. Når det er bekreftet at forskyvningen er konsekvent, kan den korrigeres ved hjelp av MR-bildene til å beregne forskjellen i mm av den resulterende BBB-åpningsplasseringen (plassering av MR-kontrast) og den tiltenkte målplasseringen. Denne forskjellen kan deretter tas med i nullplasseringen. Nøyaktighet og repeterbarhet drar også stor nytte av å bruke samme ultralydfrekvens og bruke rotter av lignende størrelse og alder i et gitt sett med eksperimenter. Ultralyd demping av rotte hjerne og rotte skallen varierer med frekvens og skallen størrelse og skallen tykkelse varierer med alderen. Skallen er også et lite hulrom med hensyn til ultralydpulsen, og hendelsen ultralyd samhandler med refleksjoner inne i skallen for å produsere et komplekst lydfelt som er avhengig av vev, hodeskalle, frekvens og posisjonen tilsvingeren 40.
Som nevnt andre steder, er denne protokollen ment å gi et lavt investeringsalternativ til gode MR-kompatible kommersielle løsninger som allerede er tilgjengelige for kjøp. Det er viktige begrensninger som følge av å holde kostnadene lave. Det er også begrensninger iboende til teknikken gitt fysikk og dagens tilstand av kunst. Bemerkelsesverdig, til tross for disse begrensningene, og som vist i de representative resultatene, kan vi oppnå konsekvent levering av fargestoffer, partikler og virus til hippocampus av rotter med submillimeter nøyaktighet. De viktigste begrensningene er at (1) formen på FUS-fokuset avhenger av det intervenerende vevet og spesielt formen og tykkelsen på skallen{...}. Behovet for å fjerne dyret fra MR for å utføre FUS-behandlingen forhindrer tilbakemeldinger i sanntid om lokalisering og intensitet av FUS-fokuset. Uten denne tilbakemeldingen i sanntid må flere eksperimenter gjøres for å bekrefte innstillingen for hver kombinasjon av målrettingssted. Når innstillingene er "oppringt", har vi funnet god repeterbarhet. (2) XYZ posisjonerings- og fiducialsystemet som konstruert, mens det er presist, gir ikke nøyaktighet i kominatrammen til positioneren fra eksperiment til eksperiment. De relative plasseringene til XYZ-hjemmet, gnagerens hodeskalle og rammen kan bevege seg i forhold til hverandre fra eksperiment til eksperiment. Dette er obviated ved hjelp av et MR-bilde for målretting, en målretting peker og fiducial med kjent plassering i rommet i forhold til FUS fokus, sikre MR-koordinatsystemet er parallelt med XYZ positioner system, ved å gjøre testbehandlinger før settet av reelle behandlinger og ved å gjøre hele prosedyren i en økt slik at dyret ikke trenger å flyttes inn i rammen. Vær oppmerksom på at fordi bare én fiducial brukes, er rammerotasjoner ikke korrigeres, så det er viktig å sikre at rammen er i nivå med hensyn til MR-sengen og boringen. Oppsummert indikerer pekerplasseringen ikke det sanne FUS-fokuset, men vi har funnet at forskyvningen er konsistent for en gitt hjerneplassering forutsatt at skallen ikke roterer i forhold til ultralydtransduseren. Vær også oppmerksom på at konsekvent tidspunkt for gadobutrol levering i forhold til BBB åpningen og bildebehandling er avgjørende for konsistente resultater, spesielt hvis MR kontrast endring brukes som en proxy for mengden av BBB åpning (se 36).
Vi begynte først FUS BBB åpning i laboratoriet med lav effekt nedsenking transduseren beskrevet ovenfor. Vi fant ut at det er et rimelig alternativ for å komme i gang med denne teknikken. Viktigst, tilpasning av denne protokollen kan gi et ikke-invasivt alternativ til intrakraniell stereotoksisk kirurgi og preklinisk forskning utført med denne teknikken kan betraktes som svært translasjonell på grunn av dagens bruk av transkraniell FUS hos mennesker30,32,41. Når etablert i et laboratorium, denne teknikken kan brukes som et ikke-invasivt alternativ til stereotoksisk kirurgi. Dermed forvandle et strengt undersøkende verktøy til et svært translasjonelt verktøy. Vårt laboratorium vil bruke denne teknikken for MR-veiledet, lokalisert levering av virus og nanopartikler for å utvikle nye, ikke-invasive neuromodulasjonsteknikker som kan brukes i fritt oppfører seg våkengnagere og ikke-menneskelige primater. Det nåværende arbeidet fokuserer på Designer Drugs Utelukkende designet for Designer Receptors (DREADDs) og sensibilisering av nevroner til lave doser av høyenergipartikler som røntgenstråler. Laboratoriet arbeider også med en ny versjon av denne protokollen som kan utføres i en menneskelig 3 T-skanner for å eliminere behovet for å flytte dyret under behandlingen og for å tillate sanntidsmålretting tilbakemeldinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble delvis støttet av et NSF EPSCoR Research Infrastructure-stipend til Clemson University (1632881). I tillegg ble denne forskningen delvis støttet av Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Forfatterne anerkjenner takknemlig bruken av tjenestene og fasilitetene til University of Alabama ved Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Forfatterne anerkjenner Rajiv Chopra for hans støtte og veiledning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
- Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
- Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
- Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
- Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
- Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
- Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
- Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
- Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
- Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
- Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
- Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
- Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
- Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
- Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
- Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
- Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
- Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
- Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
- Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
- Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
- Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
