Summary
マイクロバブル剤を用いた集中超音波は、血液脳関門を局所的かつ一過性に開くことができる。この技術は、血液脳関門を越えて幅広い薬剤を送達するために使用されてきた。この記事では、MRI ガイダンスの有無にかかわらずげっ歯類の脳へのローカライズされた配信のための詳細なプロトコルを提供します。
Abstract
立体外科は、げっ歯類の脳への局在化した薬物および遺伝子送達のためのゴールドスタンダードである。この技術は、ターゲット脳領域への正確な局在化およびオフターゲットの副作用の減少を含む全身配信よりも多くの利点を有する。しかし、立体外科は非常に侵襲的であり、その翻訳効果を制限し、長い回復時間を必要とし、複数の脳領域を標的とする場合に課題を提供する。集中超音波(FUS)は、一過性のミリサイズ領域の血液脳関門(BBB)を開くために循環マイクロバブルと組み合わせて使用することができます。これにより、通常は BBB を横断できない全身配信エージェントの頭蓋内局在化が可能になります。この技術は、立体外科に対する非侵襲的な代替手段を提供する。しかし、これまで、この技術は、機器へのアクセスが限られているため、また標準化された方法により、神経科学の研究室ではまだ広く採用されていません。このプロトコルの全体的な目標は、手頃な価格で再現可能なFUS BBB開口部(BBBO)へのベンチトップアプローチを提供するため、任意のラボで簡単に採用することができます。
Introduction
基本的な神経科学の多くの発見にもかかわらず、神経発達および神経変性疾患の新たな治療法の数は比較的限られた1,2のままである。神経疾患に関与する遺伝子、分子および細胞回路のより深い理解は、現在の技術を有するヒトでは実現不可能な有望な治療法を示唆している3。効果的な治療は、多くの場合、脳浸透性と部位特異的な4、5、6、7、8である必要性によって制限されます。しかしながら、特定の脳領域への局所的な薬物送達の既存の方法(例えば、注射またはカニューレによる送達)は侵襲的であり、頭蓋骨9に作られる開口部を必要とする。この手術の侵襲性は、人間の脳への局所的な送達の日常的な使用を防ぎます.さらに、組織損傷および結果として生じる炎症反応は、脳内注射10に依存する基礎的および前臨床試験のためのユビキタスな交論である。血液脳関門(BBB)を越えて非侵襲的に薬剤を送達し、特定の脳領域に標的化する能力は、神経疾患の治療に大きな影響を与えると同時に、前臨床研究のための強力な治験ツールを提供する可能性がある。
最小限の組織損傷を伴うBBBを介して標的輸送の1つの方法は、経頭蓋集結超音波(FUS)をマイクロバブルと共にBBB11、12、12、13、14、15、16を局所的かつ一時的に開く。FUS BBBの開口は神経栄養因子17、18、19、遺伝子治療20、21、22、抗体23、神経伝達物質24、およびナノ粒子25、26、27、28、29などの脳領域を標的とする治療を局所化することによって、神経変性疾患、脳卒中および神経膠腫の治療に関する最近の注目を集めている。用途の広い範囲とその非侵襲的な性質30、31、FUS BBBの開口部は、日常的な立体的な頭蓋内注射に理想的な代替手段です。さらに、ヒト30,32における現在の使用により、この技術を用いた前臨床調査は高度に翻訳的であると考えることができる。しかし、FUS BBBの開設は、アクセシビリティの欠如のために基礎科学と前臨床研究において広く確立された技術ではありません。そのため、この技術の確立に関心のあるラボの出発点として、FUS BBBのオープンに対するベンチトップアプローチの詳細なプロトコルを提供します。
これらの研究は、高出力空気を支持するFUS特異的超音波トランスデューサーまたは低電力減衰集積超音波浸漬トランスデューサーのいずれかで行った。トランスデューサは、反応性負荷用に設計されたRFパワーアンプと標準のベンチトップファンクションジェネレータによって駆動されました。これらの項目の詳細については、 資料一覧を参照してください。
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Protocol
すべての実験的手順は、UAB制度動物のケアと使用委員会(IACUC)ガイドラインに従って行われました。
1.集中超音波駆動装置のセットアップ
- 50オーム同軸BNCケーブルを使用して(1)RF増幅器の出力に超音波トランスデューサの入力を接続し、(2)関数発生器の出力にRFアンプの入力を接続します。
- 1% デューティ サイクルで 1 秒に 1 回、関数生成モードを 1 秒に 1 回の sinusoid バーストに設定します。
- 50 dB RFアンプで使用される0.8インチの焦点距離を備えた減衰1 MHz低電力浸漬トランスデューサの場合、開始設定を1MHz正音波、1 Vピークからピーク、10kサイクル、1秒間隔(または周期)に設定します。
- 1.1 MHzの高出力トランスデューサの場合、初期設定を1.1 MHz正気波、ピーク時50mV、ピーク、11kサイクル、1秒間隔に設定します。
メモ:トランスデューサが水没していない限り、トランスデューサを操作しないでください。超音波フォーカスに手や他の身体部分を置いたり、操作中にトランスデューサの顔に触れないでください。
2.集中超音波ベンチトップセットアップ
- ステレオタックスフレームと定位フレームホルダーを3Dプリント。
- PVCパイプを保持するクランプを使用して、トランスデューサをXYZポジショナーに接続します(図1a)。クランプをX軸スライドに固定し、ウィングナットでロックします。
- 高出力超音波トランスデューサを使用する場合は、磁石の一致したペアを使用してPVCパイプに取り付けます。一方の磁石に穴があり、もう一方の磁石に一致する突出物があることを確認します。PVCパイプの底部をキャップし、エポキシを使用して磁石の1つを取り付けます( 図1bを参照)。
- エポキシを使用して、高出力超音波トランスデューサの上部中央に第2の磁石を取り付けます。トランスデューサの中心に位置していることを確認します(図1c)。
- 高出力超音波トランスデューサを使用する場合は、XYZポジショナーを無効にするためのポインタを作成します。このポインタの先端は、超音波トランスデューサがXYZポジショナーに取り付けられている場合のトランスデューサフォーカスの中心の空間における位置を示す。トランスデューサの焦点距離の長さとトランスデューサの厚さを加えた長さに18G針カットからポインタを作る(図1d)。
- エポキシを第3磁石(この磁石もPVCキャップ磁石とペア)に塗布し、ポインタの上部に取り付けます。その後、ポインタは、XYZ ヌルの PVC パイプ上のマグネットに接続できるようになります (図 1d)。
- 低電力浸漬トランスデューサを使用する場合は、ポインタと取り付けクリップのファイルを3Dプリントします。
- PVCパイプにマウントクリップをクリッピングして低電力浸漬トランスデューサをPVCパイプに取り付け、トランスデューサをリングに挿入します(図1f)。
- 立体フレームの上に動物の頭の上に置くことができるアクリルシートから切り取られた部分を一緒に接着することによって水浴を作る(図1e)。
- 動物の頭ほどの大きさのお風呂の底に開口部をカットします。ポリイミドテープで水浴の穴を覆います。
注:ポリイミドテープの周りに水が漏れないように注意してください。
- 動物の頭ほどの大きさのお風呂の底に開口部をカットします。ポリイミドテープで水浴の穴を覆います。
- 直径4mmの薄殻プラスチックまたはガラス球をMRI可視流体(例えばビタミンE油)で満たしてMRIの受託者を作り、密封します。3Dプリントされたステレオタキシックフレームの右側にあるMRI受託者ホルダーに置きます(図2a)。
- 3D プリントされたフレーム ホルダーを、動物の位置決めに適した位置にある XYZ ポジショナーにしっかりと固定します。フレームホルダーのロッドラル端のタブをY軸レールの一致するチャネルにスライドさせ、セットネジで固定します(図1h、赤矢印)。
- XYZ ポジショナを駆動するには、製造元の指示に従って USB をシリアル コンバータにコンピュータに取り付け、コンバータを接続します。ランタイム環境とモータコントローラソフトウェアをPCにインストールします。
- コントローラソフトウェアの前面パネルにあるポート選択ドロップダウンコントロールでUSBシリアルコンバータを選択して、ソフトウェアで適切なシリアルポートが選択されていることを確認します。9 ピンシリアルクロスケーブル(RS232 ヌル モデム ケーブルなど)を使用して、USB をシリアル コンバータをステッパー モーター コントローラ ボックスに接続します。
- コントローラソフトウェアを実行して、ステッパーモーターをソフトウェア制御で駆動できることをテストします。この手順では、ローカル IT サポートの支援が必要になる場合があります。
3. 頭蓋内ターゲティング手順
注:250〜350 gの体重の雄のスプレイグドーレーラットは、これらの実験のために使用されました。動物は水とラットチャウへの自由なアクセスを持ち、12:12の光:暗いサイクルで維持されました。
- 動物を麻酔下に置き(酸素を含む3%イオフルラン)、つま先ピンチへの応答の欠如を確認します。次に、以下に説明するカテーテルを挿入します。
- ランプで尾を温め、静脈に当たりやすい。動物を過熱したり、尾を焼いたりしないように注意してください。
- 動物が眠ったら(つま先のピンチに反応しない)、マイクロバブルを送達するために使用される24G尾静脈カテーテル、エバンスブルー染料(EBD)、MRIを使用する場合はガドブトロールMRI、および目的の実験剤を挿入する。静脈が打たれたら、血液は鞘を満たし、鞘をさらに静脈に押し込みながらゆっくりと内針を取り除きます。
注:初めてラットの尾静脈注射を行う場合は、スチュアートとシュレーダー33 のようなガイドを参照してください。 - 血流がない場合は、針が静脈を突き抜けた可能性があることをテストするために、静脈からカテーテルシースをゆっくりと動かします。カテーテルがわずかに引き戻されたときに血液が流れる場合、最初の突きは静脈を通過し、カテーテルの配置は前の位置にロストラルである尾の別の場所で再起動する必要があります。
- カテーテルプラグにサリンを充填し、ポートが血液で満たされるとすぐにカテーテルポートの端にカテーテルプラグをねじ込みます。慎重にカテーテルと尾部の周りにラボテープを包み込み、所定の位置に保ちます。上部に小さな部分から始め、カテーテルプラグの端を露出したまま、尾方向に作業します。
- ステレオタキシックフレームの麻酔コネクタ(図2a)に麻酔線を差し込み、口を噛み付くバーに入れ、耳棒を両方の外耳道に導いて、セットネジを締めます。動物の頭が安全でレベルであることを確認してください。
- 動物をMRIベッドに移動し、麻酔線を鼻コーンに接続します。このプロトコルでは、9.4 Tの小さいボア動物MRIが使用された。
- 座標測定のために、脳全体とMRIの受託者(図2b)を捉える冠状および軸方向のT2加重画像を収集します。MRI プロトコルを構築できるように、現地の MRI 物理学者または技術に次の情報を提供します。
- コロナ画像(図2b上)の場合は、次のパラメータを使用します:27、幅:62.2mm、高さ:62.2mm、深さ:37.97mm、ボクセルサイズ:0.24 x 0.41 mm3。
- 軸画像(図2b底)の場合、次のパラメータを使用します:13、幅:61.47ミリメートル、高さ:53.81 mm、深さ:16.7ミリメートル、ボクセルサイズ:0.41 x 0.21 x 1.29 mm3。
注:平面解像度のコロナが0.25 mmに近く、画像が脳全体と受託者をカバーしている限り、これらの正確なパラメータを持つ必要はありません。
- FUSを対象とする脳領域へのMRI受託者からの距離を記録することにより、上記画像から座標測定値を収集します。
- スキャナーでは、ステップ3.5で収集されたコロナ画像上で、受託者の中心を示す、受託者が最大である画像を見つける。mmで関心のある脳領域に受託者の上部からの距離を記録します (MRI ソフトウェアはスケールまたはポイント測定ツールを持っています, これを行う方法については、地元のMRI技術や物理学者に相談します) 内側/側方向と側腹側方向の両方で (図 2b,上).
- スキャナーでは、ステップ3.5で収集された軸方向画像上で、受託者の一番上を示す画像を見つけ、受託者の中心からターゲット脳領域までの距離を、側/腹側方向と内側/側方向の両方で測定します(図2b、下)。
- 2つの内側/横の測定値を比較し、それらが異なる場合は平均を使用します。これらの座標測定は、後のステップ4.3で、FUS焦点をXYZポジショナーでターゲットの脳領域に導くために使用される。
- MRIプレスキャン画像を収集します。FUS BBBが開いた後に収集された画像とこれらの画像を比較してください(図4)。T1加重画像は後にBBBの開口を視覚化するために使用され、T2加重画像は後でFUS処置34の後に組織損傷が起こらないように使用される。
- T1加重軸画像の場合、幅:30mm、高さ:51.2mm、深さ:3.0 mm、ボクセルサイズ:0.23 x 0.2 x 0.23 mm3、画像数:13。
- T2 加重軸イメージの場合は、幅 30 mm、高さ 51.2 mm、深さ:2.6 mm、ボクセル サイズ: 0.2 x 0.2 x 0.2 mm3、画像数: 13。
- T1加重コロナ画像の場合、幅:30mm、高さ:30mm、深さ:27mm、ボクセルサイズ:0.16 x 0.16 x 1mm3、画像数:27。
- T2重み付けされたコロナ画像の場合、幅:30mm、高さ:30mm、深さ:27mm、ボクセルサイズ:0.12 x 0.12 x 1mm3、画像数:27。
注: 手順 3.5 のように、これらのイメージング パラメータは、リストとまったく同じである必要はありません。これらの画像は、ステップ 3.5 で収集されたものより小さい FOV と高い解像度を持ちます。
- 動物を立体フレームに保ち、MRIベッドからベンチトップFUSセットアップに動物を素早く輸送します。動物が麻酔の影響下で移動のために眠り続けることを確認してください。
- 転送時間が長い場合は、動物とフレームに合う大きさのボックスを使用してください。麻酔プラグを取り付けたまま、箱の中に動物とフレームを置き、余分なイオブルランが数分間箱を満たします。麻酔ラインを抜き、すぐに移ります。
4. 集中超音波手順
- FUSベンチトップセットアップに到着したら、すぐに鼻コーンに麻酔ラインを差し込み、酸素で1.5〜3%のイオブルランを実行し続けます。動物が目を覚ますのを避けるために、できるだけ早くこれを行います。
- フレームをフレームホルダーにスライドさせ、しっかりと所定の位置にスナップします。動物の頭を剃るためにバリカンを使用してください。余分な髪を磨き、頭皮に脱毛クリームを塗ります。3分間座って、水とガーゼで拭き取ります。
- MRI がターゲティングに使用できない場合は、標準の (3D プリントではない) 立体的フレームを使用して、ポインターの先端を bregma にタッチしてポインターの位置を無効にし (頭皮切開が必要です)、ソフトウェアを無効にするか、座標を記録します。ソフトウェアの上の50ボタンをクリックし、トランスデューサのポインタを交換して、XYZキャリッジを 50mm 上に移動します。前述のラット脳アトラスに基づいて35,ソフトウェアのステッピングボタンを使用して所望の脳座標に移動します。MRI の代わりにこの方法を使用する場合は、セクション 4.6 にスキップします。
- MRI ガイダンスを使用する場合は、ポインタを取り付け、MRI 受託者の位置にポインタを移動します (図 1d、g)。MRIの受託者の一番上と中央にポインタを置きます(受託者ホルダーの上部に小さな穴が付いています)。MRI イメージ内のすべての距離が計算されたポイントである NULL 位置ボタンをクリックします。
- ポインタを取り外し、ポジショナーを内側/横座標と、ロストラル/尾角座標に移動します。水浴と超音波ゲルの配置を可能にするために 上50 ボタンを押してポジショナーを上げます。Z 軸の移動の上部に到達すると、NULL 位置が無効になります。ドーサル/腹側の座標は、トランスデューサを追加した後に設定されます。
- 動物の頭皮に超音波ゲルを塗布し、ポリイミドテープウィンドウをゲルに押し付けて動物の上に水浴を置きます。超音波ゲルに気泡がないことを確認してください。
- 水浴に脱気水を入れます。
- 高出力トランスデューサを使用する場合は、ポジショナーを下げて、マグネットが水のすぐ上になるようにします。トランスデューサを慎重に水に下げてポジショナーに取り付け、気泡が顔の下に閉じ込められるのを防ぎ、磁石を接続します。
- 低電力浸漬トランスデューサを使用する場合は、ポジショナーをトランスデューサクリップのすぐ上の水に下げます。次に、振動子をゆっくりと水の中に下げて、気泡が顔の下に閉じ込められるのを防ぎます。
注:透明なバスは、泡のトランスデューサ面の下を見るときに便利です。 - ポジショナーを下側の側側/腹側座標にします。
- RFパワーアンプをオンにします。
- 針先をカテーテルプラグに貼り付けて注入して、3%エバンスブルー染料(EBD)の1 mL/kgを注入します。5分間循環させて下します。
- バブルシェーカーで激しく振ってマイクロバブルを作動させる。
- 2 FUS治療と18 G翼注入セットのチューブを考慮して、0.2 mLの生理食前に30μL/kgのマイクロバブル(バブルコンC.1.2 x10 10 10/mL)の5倍の用量を準備します。例えば、ラットの重さが200gの場合、18G針の先端を含むシリンジを生理食音の1mLに30μLのマイクロバブルで満たします。
注:羽ばたき注入セットを取り込み、注入する両方に18 G針のヒントを使用してください。 - マイクロバブルの均一な分布を得るために、シリンジを数回反転させます。次に、翼を持つ注入セットを取り付けて充填します。注入ポンプにシリンジを置き、6 mL/hの速度で0.2 mLを送達するように注入ポンプを設定します。これにより、2分FUS曝露に対するマイクロバブルの注入が遅くなります。
- 翼を持つ針をカテーテルプラグに差し込みます。
- 2 FUS治療と18 G翼注入セットのチューブを考慮して、0.2 mLの生理食前に30μL/kgのマイクロバブル(バブルコンC.1.2 x10 10 10/mL)の5倍の用量を準備します。例えば、ラットの重さが200gの場合、18G針の先端を含むシリンジを生理食音の1mLに30μLのマイクロバブルで満たします。
- まず、注入ポンプを実行し、3 sを待って、関数ジェネレータの出力イネーブルボタン(材料表の関数ジェネレータで"on"と表示)を押してFUS処理を開始します。マイクロバブルをクリアできるように、これらの2回を5分の間に繰り返します。
- 関数発生器の オン ボタンをもう一度押して、注入ポンプが2分で停止したときにFUS処理を停止します。
- マイクロバブルがクリアされるまで5分待ちます。次に注入を開始し、2回目のFUS治療を開始する。
- 第2のFUS処置の直後に、ガドブトロールコントラスト(MRIを使用する場合)および目的の薬剤、例えばウイルス粒子を注入する。すべてのエージェントの総納入量は5 mL/kgを超えないようにしてください。
注意:目的のエージェントの配達時期(例えば、FUS BBBの開封前または開封後)は、使用するエージェントによって異なる場合があります。
- RFパワーアンプをオフにして、すぐにMRIに戻って動物を輸送します。
5. BBB開封のMRI確認
- MRI が使用できない場合は、セクション 6 にスキップし、BBB の開始を確認するために EBD 式を使用します。
- ステップ3.7とまったく同じ場所で動物をMRIベッドに戻し、麻酔ラインを差し込みます。
- BBB開口部の領域におけるガドブトロールMRIの増強を可視化するためにステップ3.7で使用したのと同じイメージングパラメータを使用してMRIポストスキャンを収集する(図3b、e)。
6. 灌流と組織の収集
- 血液が完全に明確になるまで、冷たい4%ホルマリンで動物を浸透させます。
- 脳を取り除き、4%ホルマリンまたはPFAを一晩4°Cで配置します。次に、脳が沈むまで30%スクロース溶液に脳を入れる(約2〜3日)。最後に、液体窒素またはドライアイスでフラッシュフリーズし、凍結切断するまで-80°Cで保存します。
- OCTで脳を凍結し、凍結分を取る。
- 蛍光顕微鏡用の固定セクションとカバースリップセクション。EBD励起ピークは470および540 nmで、放出ピークは680 nmでピークに達する。全体的な細胞形態を可視化するためにDAPI取付媒体とカバースリップ。
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Representative Results
ここでは、マイクロバブルを用いた集結超音波が、低電力浸漬トランスデューサー(図3)とFUSトランスデューサ(図4)の両方で上記で指定されたパラメータを使用して局所的なBBB開口部を誘導できることを示す。まず、初期の実験において、低電力浸漬変換器を、前部(図3b)または内側(図3a)のいずれか1つの脳半球を対象とした。その後、動物を2時間後に灌流(図3a)または灌流なしで屠殺し(図3b)、10μm凍結脳切片を採取した。FUS BBBの開口は、EBD自己蛍光(励起:470および540nm、発光:680nm)の標的半球(白矢印図3aおよび3b)によって明らかであった。
私たちは、EBD自己蛍光を伴うBBB開口部の明確な視覚化のために動物を浸透させるのが最善であることを発見しました。しかし、BBBの開口部は血管をクリアすることなく視覚化することができます(図3b)。BBB開封後のEBDの細胞の取り込みとクリアランスは、BBBが開封されてから30分経過するとすぐに始まり、24時間37時間にわたって増加する。EBD自己蛍光を伴うBBB開口部の評価のためには、BBB開口部の15分から3時間の間に動物を犠牲にするのが最善である。最終的には、犠牲の時間は配信されたエージェントに依存します。例えば、AAV研究では、BBB開封後3週間およびAAV送達(図5c)が適切であり得る。
後の実験では、FUSトランスデューサーは海馬(図4a-c)または前帯状皮質(ACC)(図4 d-f)のいずれかを標的とし、EBDに加えて、MRI造影剤ガドブトロール(0.1mL/kg)を注射してBBB invivoの標的開放を確認するためにIVを注入した。図4bは、BBB開封および造影剤注射後1時間にガドブトロルコントラストが組織に入ったところの強化されたMRIコントラストを示す。FUS 手順 (図 4a,d)の前に取られた MRI プリスキャンと比較すると、このコントラストの変化が明らかになります。その後、動物はBBBの開封後1.5時間後に灌流によって屠殺され、10μmの凍結分が採取された。EBD自己蛍光は、FuS標的領域においてBBB開口部の位置をさらに示す明らかである(図4c,f)。この図は、MRI のコントラストが見えにくくなることがある(図 4bと図 4eの違い) を示しています。したがって、図4fの蛍光顕微鏡写真のようにEBD自己蛍光の可視化を用いてBBB開口部を確認すると有用である。
この技術が標的遺伝子送達AAV9-hsyn-GFPおよびガドブトロールコントラストに使用できるかどうかを評価するために、海馬でBBBが開いた直後にIV(滴下:1.32 x 1010 14 GC/mL、0.05 mL/kg)を注入した。次いで、動物をBBB開封30分後にMR画像化し、3週間後に灌流によって屠殺した。GFP発現の蛍光イメージングのために10μmのクライオセクションを採取した。BBBの開口部は、標的海馬におけるガドブトロールコントラストによって明らかであった(図5a,b)。また、緑色蛍光によって明らかな標的海馬におけるGFP発現により遺伝子送達が確認された(図5c)。この時点で、EBD はクリアされており、心室でのみ明らかです (図 5c)。
図1:FUSベンチトップのセットアップ(a)は、XYZポジショナー、トランスデューサの取り付けのための直径30mmのPVCパイプ、3Dプリントステレオタックスフレーム、および注入ポンプを含むFUSセットアップ。(b)PVCパイプの端部をキャップし、エポキシで磁石を取り付けます。(c)別の一致する磁石は、エポキシと高出力トランスデューサの上部中心に取り付けられています。(d)また、MRI受託者の上部と中央のポジショナーを無効にするためのポインタに、一致する磁石がもう1枚取り付けられています。(e)ポインタは最終的に高出力トランスデューサーに置き換えられ、水浴は超音波ゲルで動物の頭部に結合される。(f)低電力浸漬トランスデューサは、3DプリントされたトランスデューサクリップでPVCパイプに取り付けることができます。(g)位置決めの場合、トランスデューサは3Dプリントポインタに置き換えられ、ポジショナーはMRI受託者の上部と中央にnullされます。(h)静止した3Dプリントフレームホルダーは、複数のFUS処理が必要な場合に、動物をMRI後に同じ位置に戻すことができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MRI誘導座標のMRI受託者を有する立体的フレーム。(a)動物は、まずMRI受託者を備えた3Dプリントステレオタックスフレームに配置される。(b)フレームはMRIベッド内に配置され、受託者(点線円)からターゲット脳領域までの距離は、側側/側腹孔(D/V)測定の両方のコロナ画像と、ロストラル/コーダル(R/C)測定の軸像を用いて測定され、内側/横(M/L)測定は両方の軸から収集することができる。動物はフレームに保管され、FUSステーションに移され、そこでポインタを使用して受託者の位置にあるXYZポジショナーを無効にします。その後、ポインターはトランスデューサに置き換えられ、収集された座標に基づいて移動できます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:エバンスブルー染料(EBD)は、フュージョンの有無にかかわらずFUS BBBの開口を確認する。(a)10μm脳部の顕微鏡写真は、FUS BBBが開いた2時間後に、内側左半球を標的とした低電力浸漬トランスデューサーで開いた。これは、組織採取前に4%緩衝ホルマリンを浸透させた動物の代表的な画像である。BBBの開口は、EBD赤色自蛍光(矢印)によって明らかである。(b)FUS BBB開封後2時間前左半球を対象とした10μm脳部の顕微鏡写真。これは、組織採取前に浸透しなかった動物の代表的な画像であり、したがって、EBDは血管に残る。BBBの開口部は、EBDが血管(矢印)から漏れた場所で明らかである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:FUS BBB開口をガドブトロールMRIコントラストおよびEBD発現で確認した。 MR 画像の前 (a および d) と後 (b および e) BBB の開始後。ガドブトロールコントラスト強化は、生体内でBBB開口部の位置を確認します(b と e,矢印).(c)海馬におけるEBD自己蛍光(赤色)を用いたBBB開口のさらなる確認を示す10μm脳部(青DAPI核染色)。スケールバー;500 μm(f) 前帯状帯状皮質のBBB開口後の10μm脳部の顕微鏡写真(矢印)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:FUS BBB開口部を介して海馬へのAAV9-hsyn-GFPの局在的な送達。 MRI造影剤によるBBB開口のMRI確認は、コロナ(a)および軸方向(b)の両方でのMRIコントラスト(矢印)のT1重み画像である。(c)FUS標的海馬におけるGFP発現の組織学的確認(緑色)FUS BBB開封後3週間及びAAV9-hsyn-GFP IV注射。青は、全体的な細胞形態のDAPI核染色を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、MRIガイダンスの有無にかかわらず頭蓋内ターゲティングのための2つの異なるトランスデューサーおよび方法を含む代替アプローチで、マイクロバブル支援FUS BBB開口部へのベンチトップアプローチについて説明した。現在、MRIガイド付きFUS BBBのオープンをラボに設置するために、ユーザーフレンドリーなインターフェイスで高度に標準化された再現性の高い結果を提供する優れたすぐに使用できるデバイスを購入するオプションがあります。しかし、多くのラボはそのような機器のコストのために準備されていません。したがって、このプロトコルの主な目標は、技術に関する専門知識を構築するために、任意のラボが確立できる開始点を提供することです。
FUS BBBの開口は現在広く使用されている技術であり、異なるグループが様々な薬剤および麻酔薬を利用する場合が多く、それぞれがBBBの開封および外挿の程度に影響を与える可能性があります。重要なことに、使用される特定の麻酔薬はBBB開口部の大きさに影響を及ぼす可能性があるため、このプロトコル38を実行する際にこれを考慮することが重要である。ここでは、麻酔薬イソフルランは、動物がプロトコルの長さのためにイソフルランの下で維持され、イソフルランガスのレベルが動物の呼吸速度および心拍数に基づいて容易に調節することができるので使用される。さらに、酸素を含むイオブルランは医療用空気よりもアクセスしやすいため、酸素を供給しました。しかし、医療用空気はより広範なBBB開口部39を可能にするかもしれない。MRI 造影剤の中には、このプロトコルに適しているものもあります。例えば、私たちの手の中では、EBD漏れが組織死後に明らかに存在していた場合でも、ガドテリドールはコントラスト強化を生み出さなかった。マイクロバブル製剤も重要である。ここでは、過フルトレン脂質微小球を使用します。パーフルトレンタンパク質A型マイクロバブルなどの他のマイクロバブル製剤は容易に入手可能であるが、使用されるマイクロバブルのタイプは結果15に影響を与える。
関数ジェネレーターのコントロールは、かなり異なる場合がありますので、手順 1 で示した設定を入力する方法については、マニュアルを参照してください。適切なコマンド電圧(関数発生器のピークまでのVピーク)は、トランスデューサの特性、RF増幅器ゲイン、トランスデューサへのRFアンプマッチング、動物の年齢とサイズ、マイクロバブルの種類と濃度、および所望の処理効果に強く依存します。ピークからピーク V までは試行錯誤で決まる必要があります。手順 1 で提案された設定から開始し、組織学的に効果を決定します。組織の損傷がある場合は、ピークVを10%下げてからもう一度試してください。同様に、BBBOがない場合はピークVを10%上げて、もう一度試してください。Vを高く設定しすぎると、低電力浸出器に損傷を与える可能性があります。これは、トランスデューサ面のひび割れまたは歪みとして明らかになります。トランスデューサの製造リードタイムは長くなる可能性があるため、起動時には複数のトランスデューサをバックアップとして購入することをお勧めします。超音波トランスデューサは、それらが不適切に一致している場合、アンプを損傷することができます。シンプルさと信頼性を確保するため、複雑な負荷を駆動できる堅牢なパワーアンプ(材料テーブルのRFパワーアンプなど)を使用することをお勧めします。高出力トランスデューサには一致回路が付属していますが、低電力浸漬トランスデューサは付属していません。推奨されるRFアンプは、不十分に一致したトランスデューサからの反射電力を処理できますが、この構成では一部のアンプが破損する可能性があります。また、ドライバとソフトウェアのインストール後に手順2.7で問題が発生した場合は、ソフトウェアで適切なシリアルポートが選択されていることを再確認してください。次に、別のシリアルケーブルを試してください。失敗した場合は、ローカルの IT サポートを求めます。
経験から、それは練習と脳領域ターゲティングのタイトな精度を達成するために複数の調整を必要とします。これは、初期の実験(図3)と最新の実験との間のターゲティングの違い(図5)で見ることができます。私たちは古典的な立体フレームを使用して実験を開始し、3Dプリンタへのアクセスがない場合、またはげっ歯類MRIへのアクセスがない場合は、ここにオプションとして含めます。しかし、MRI受託者と3D印刷可能フレーム(またはカスタムデザイン)を備えたMRI誘導が理想的な方法です。第一に、平均ラット脳アトラスに頼るのではなく、動物内の座標を収集することによって、動物間の個人差を説明する。さらに、MRIを使用すると、死後のEBD発現に頼るのではなく、生体内を標的とするFUSの位置を確認することができます。これは、AAV などの効果を 24 時間以上必要とするエージェントを配信する場合に重要です (図 5)。最後に、提供されたフレームホルダーは、任意のターゲット設定エラーを修正したり、座標をやり直すことなく、不十分なBBB開口部の後にFUSを繰り返すために、MRI後に同じ位置に動物を戻すことができます。ポータブル3Dプリントステレオタックスフレームは、200mm以上の明確なボアを持つ任意のMRIで使用することができます。
標的位置における血管分布に応じて、頭蓋骨の厚さ40、心室の存在、および他の要因はBBB開口部の程度が異なる場合がある。このため、フレームとフレームホルダーでターゲティングを繰り返す方法を提供しています。ターゲティングの精度は、ターゲットポインターに関してトランスデューサの焦点を一貫した位置に保つことに大きく依存します。このポインタの先端は、トランスデューサがXYZポジショナーに取り付けられているときに、トランスデューサの焦点の中心の空間内の位置を示す必要があります。磁石は、この共局在化を維持しながら、ポインタとトランスデューサを簡単に交換することができます。磁石の穴と突起は、できるだけ正確に一致する必要があります。この接続での変動は FUS フォーカスターゲティングの再現性を低下させます。しかし、ポインタ先端と超音波フォーカスの間には空間的なオフセットがあります。オフセットが一貫していることを確認したら、MR画像を用いて、得られたBBB開口位置(MRIコントラストの位置)と目的の位置のmmの差を算出することにより補正することができる。この違いは、NULL 位置に因数を入れることができます。正確さと再現性は、同じ超音波周波数を使用し、特定の実験のセットで同じようなサイズと年齢のラットを使用することからも大きな利益を得る。ラットの脳とラットの頭蓋骨による超音波減衰は、頻度によって変化し、頭蓋骨の大きさと頭蓋骨の厚さは年齢によって変化する。頭蓋骨はまた、超音波パルスに関して小さな空洞であり、事件超音波は、組織、頭蓋骨、周波数およびトランスデューサ40の位置に依存する複雑な音場を生成するために、頭蓋骨内の反射と相互作用する。
他の場所で述べたように、このプロトコルは、すでに購入可能な優れたMRI互換の商用ソリューションに代わる低投資を提供することを目的としています。コストを低く抑えることには、重要な制限があります。物理学と現在の最先端の技術に固有の制限もあります。驚くべきことに、これらの制限にもかかわらず、そして代表的な結果に示すように、我々はサブミリ波精度でラットの海馬に染料、粒子、およびウイルスの一貫した配信を達成することができる。最も重要な制限は、(1)FUS焦点の形状が介在組織、特に頭蓋骨の形状と厚さに依存することです。.}FUS処理を行うためにMRIから動物を除去する必要性はFUS焦点の局在および強度に関するリアルタイムのフィードバックを防ぐ。このリアルタイムのフィードバックがなければ、ターゲットの場所の各組み合わせの設定を確認するためにいくつかの実験を行う必要があります。設定が「ダイヤルイン」されると、我々は良好な繰り返し性を発見しました。(2)構築されたXYZの位置決めと受託者システムは、正確ながら、実験から実験までのポジショナの座標フレームに正確さを提供しない。XYZホームの相対的な位置、げっ歯類の頭蓋骨、フレームは実験から実験まで互いに相対的に移動できます。これは、ターゲット設定用のMRI画像、FUSフォーカスに対する空間内の既知の位置を持つターゲットポインタおよび受託者を使用して、MRI座標系がXYZポジショナーシステムと平行であることを保証し、実際の治療の前にテスト処理を行い、動物がフレームに再配置される必要がないように1つのセッション内で手順全体を行うことによって、回避されます。1つの受託者しか使用されないため、フレームの回転は修正できないため、フレームがMRIベッドとボアに対してレベルであることを確認することが重要です。要約すると、ポインタの位置は真のFUS焦点を示すものではないが、頭蓋骨が超音波トランスデューサーに対して回転しない場合、特定の脳位置に対してオフセットが一貫していることが判明した。また、BBB開口部とイメージングに対するガドブトロールの配信の一貫したタイミングは、特にMRIコントラスト変化がBBB開口部の量の代理として使用される場合、一貫した結果のために重要であることに注意してください (36を参照)。
まず、上記の低電力浸漬トランスデューサーを使用して、ラボでFUS BBBのオープンを開始しました。この手法を使い始めるには、手頃な価格の選択肢であることがわかりました。最も重要なことは、このプロトコルの適応は、ヒト30、32、41における経頭蓋FUSの現在の使用に起因して、この技術で行われる頭蓋内立体立体手術および前臨床研究に対する非侵襲的代替手段を提供し得る。ラボで確立されると、この技術は、立体外科の非侵襲的な代替として使用することができます。したがって、厳密に調査ツールを高度に翻訳されたツールに変換します。私たちの研究室では、この技術を使用して、ウイルスとナノ粒子のMRI誘導、局所的な送達を行い、目覚めのげっ歯類や非ヒト霊長類を自由に振る舞う際に使用できる新しい非侵襲的神経変調技術を開発します。現在の研究では、デザイナー受容体専用に設計されたデザイナードラッグ(DREADD)とX線などの高エネルギー粒子の低用量へのニューロンの感作に焦点を当てています。ラボはまた、治療中に動物を移動する必要性を排除し、リアルタイムのターゲティングフィードバックを可能にするために、人間の3 Tスキャナで実行することができるこのプロトコルの新しいバージョンに取り組んでいます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、クレムソン大学(1632881)に対するNSF EPSCoR研究インフラ補助金によって部分的に支援されました。さらに、この研究の一部は、Civitan国際研究センター、バーミンガム、ALによってサポートされました。著者らは、アラバマ大学バーミンガム小動物イメージング共有施設グラント[NIH P30 CA013148]のサービスと施設の使用を感謝して認めている。著者らは、ラジーヴ・チョプラの支援と指導を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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