Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Бенчтоп Подход к местоположению Конкретный барьер мозга крови Открытие с помощью целенаправленного ультразвука в крысиной модели

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61113
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

Целенаправленное УЗИ с микропузырьом может открыть геммоградный барьер фокусно и преходяще. Этот метод был использован для доставки широкого спектра агентов через гем blood brain barrier. В этой статье содержится подробный протокол для локализованной доставки в мозг грызунов с руководством или без МРТ.

Abstract

Стереотаксисная хирургия является золотым стандартом для локализованной доставки наркотиков и генов в мозг грызунов. Этот метод имеет много преимуществ по сравнению с системной доставки, включая точную локализацию в целевой области мозга и сокращение от целевых побочных эффектов. Тем не менее, стереотаксис является высокоинвазивным, что ограничивает его трансляционной эффективности, требует длительного времени восстановления, и обеспечивает проблемы при ориентации нескольких областей мозга. Фокусировка ультразвука (FUS) может быть использована в сочетании с циркулирующими микропузырями, чтобы временно открыть геммулефалический барьер (BBB) в миллиметровых областях. Это позволяет внутричерепной локализации системно доставленных агентов, которые обычно не могут пересечь BBB. Этот метод обеспечивает неинвазивную альтернативу стереотаксисной хирургии. Однако до настоящего времени этот метод до сих пор не получил широкого широкого введения в лабораториях неврологии из-за ограниченного доступа к оборудованию и стандартизированным методам. Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы обеспечить подход к открытию FUS BBB (BBBO), который является доступным и воспроизводимым и поэтому может быть легко принят любой лабораторией.

Introduction

Несмотря на многочисленные открытия в основной неврологии, количество новых методов лечения нейроразвития и нейродегенеративных расстройств остаетсяотносительно ограниченным 1,2. Более глубокое понимание генов, молекул и клеточных схем, участвующих в неврологических расстройств предложил перспективных методов лечения нереализуемых у людей с современными методами3. Эффективные методы лечения часто ограничиваются необходимостью быть мозгом penetrable исайт конкретных 4,5,6,7,8. Тем не менее, существующие методы локализованной доставки наркотиков в определенные области мозга (например, доставка через инъекцию или канюлу) являются инвазивными и требуют открытия, которые должны быть сделаны вчерепе 9. Инвазивность этой операции предотвращает регулярное использование локализованных родов в мозг человека. Кроме того, повреждение тканей и в результате воспалительные реакции повсеместно путают для основных и доклирикальных исследований, которые полагаются на внутримозговойинъекции 10. Способность неинвазивно доставлять агенты через геммоимперальный барьер (BBB) и ориентировать их на конкретные области мозга может иметь огромное влияние на лечение неврологических расстройств, одновременно обеспечивая мощный исследовательский инструмент для доклинических исследований.

Одним из методов целевого транспорта через BBB с минимальным повреждением тканей является транскраниальное сфокусированное УЗИ (FUS) вместе с микропузырями, чтобы фокусно и временно открыть BBB11,12,13,14,15,16. FUS BBB открытие приобрело недавнее внимание для лечения нейродегенеративных расстройств, инсульта и глиомы путем локализации терапии для целевых областей мозга, таких какнейротрофические факторы 17,18,19,генной терапии 20,21,22,антитела 23, нейротрансмиттеров24, инаночастицы 25,26,27,28,29. С его широким спектром применений и его неинвазивныйхарактер 30,31, FUS BBB открытие является идеальной альтернативой рутинной стереотаксис внутричерепных инъекций. Кроме того, в связи с его текущим использованиемв организме человека 30,32, доклинических исследований с использованием этой техники можно считать весьма перевод. Тем не менее, открытие FUS BBB до сих пор не является широко распространенной техникой в фундаментальных науках и доклинических исследованиях из-за отсутствия доступности. Таким образом, мы предоставляем подробный протокол для скамейки подход к FUS BBB открытия в качестве отправной точки для лабораторий, заинтересованных в создании этой техники.

Эти исследования были проведены либо с высокой мощности воздуха при поддержке FUS конкретных ультразвуковой предук или низкой мощности затухается сосредоточены ультразвукового погружения преминдацера. Предуцаторы были управляемы усилителем мощности RF, предназначенным для реактивных нагрузок, и стандартным генератором функции скамейки. Подробная информация по этим пунктам можно найти в таблице материалов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу за животными и использованию (МАКУК).

1. Фокусированная установка ультразвукового оборудования для вождения

  1. Используйте 50 кабелей Ohm coaxial BNC для подключения (1) ввода ультразвукового предуцера к выходу усилителя RF и (2) ввода усилителя RF к выходу генератора функции.
  2. Установите режим генератора функции до синуоидного всплеска один раз в секунду с 1% цикла службы.
    1. Для демпфированного 1 МГц малой мощности погружения преобразователя с 0,8 дюйма фокусное расстояние используется с усилителем 50 дБ РФ, установить стартовые настройки: 1 МГц синус-волны, 1 V пик к пику, 10k цикл, 1 с интервалом (или период).
    2. Для воздуха при поддержке, 1,1 МГц высокой мощности преобразовайца, установить первоначальные настройки: 1,1 МГц синус-волны, 50 мВ пик к пику, 11k циклов, 1 с интервалом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оперировать превью, если они не погружены в воду. Не помойте руку или другую часть тела на ультразвуковой фокус или коснитесь лица предуцера во время его работы.

2. Фокусированная установка ультразвуковой скамейки

  1. 3D-печать стереотаксиатической рамы и стереотаксического держателя кадра.
  2. Подключите предук к позиционеру XY, используя зажим, держащий трубу из ПВХ(рисунок 1а). Болт зажим на X-оси слайд и замок с крылом гайки.
    1. При использовании высокой мощности ультразвукового предуцера, приложите его к трубе ПВХ с помощью сопертой пары магнитов. Убедитесь, что один магнит имеет отверстие, а другой имеет соответствующие выступы. Крышка нижней части трубы ПВХ и прикрепить один из магнитов к нему с помощью эпоксидной смолы (см. Рисунок 1b).
    2. Прикрепите второй магнит к верхнему центру высокой мощности ультразвукового премидери с помощью эпоксидной смолы. Убедитесь, что он находится в самом центре предуцера(рисунок 1c).
  3. При использовании высокой мощности ультразвукового предуцатора, сделать указатель для аннулирования позиционер XY. Кончик этого указателя указывает расположение в пространстве центра фокуса предуцера, когда ультразвуковой предук прикреплен к позиционеру XY. Сделать указатель из 18 G иглы вырезать, чтобы быть длина фокусного расстояния предуцера плюс толщина предуцера (Рисунок 1d).
    1. Нанесите эпоксидную смолу на третий магнит (этот магнит также спаривается с магнитом крышки ПВХ) и прикрепите его к верхней части указателя. Указатель будет затем иметь возможность прикрепить к магниту на трубе ПВХ для XY' аннулирования(рисунок 1d).
  4. При использовании малой мощности погружения предуцера, 3D-печать файла для указателя и монтаж клип.
    1. Прикрепите малой мощности погружения предук ПВХ трубы путем отсечения монтажа клип на трубу ПВХ и вставить предук в кольцо (Рисунок 1f).
  5. Сделайте водяную ванну, склеив кусочки, вырезанные из акрилового листа, который сможет отдохнуть на верхней части головы животного над стереотаксическойрамой (рисунок 1e).
    1. Вырезать отверстие в нижней части ванны, что составляет около размера головы животного. Обложка отверстие в водяной бане с полиимидной лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо позаботиться о том, чтобы вода не просачивалась вокруг полиимидной ленты, так как она может намокнуть мех крысы и вызвать переохлаждение.
  6. Сделайте МРТ фидуциальный путем заполнения 4 мм диаметром тонкой оболочки пластика или стеклянной сферы с МРТ видимой жидкости (например, витамин Е масло) и запечатать его. Поместите его в ФИдуциальный держатель МРТ на правой стороне стереотаксиальной рамы, напечатанной на 3D-принтере(рисунок 2a).
  7. Твердо закрестите держатель рамы, напечатанный на 3D-принтере, на позиционере XY в хорошем месте для позиционирования животных. Сдвиньте вкладку на ростральном конце держателя рамы в соответствующий канал на рельсах Y-оси и закрепив с помощью установленныхвинтов (рисунок 1h,красные стрелки).
  8. Для управления позиционером XY' установите USB на серийный преобразователь на компьютер, следуя указаниям производителя и подключите преобразователь. Установите на ПК среду выполнения и программное обеспечение контроллера двигателя.
    1. Убедитесь, что соответствующий серийный порт выбран в программном обеспечении, выбрав USB для серийного преобразователь в управлении высадкой выбора порта на передней панели программного обеспечения контроллера. Подключите USB к серийному преобразователь к коробке контроллера stepper motor controller с помощью 9-контактного серийного кроссоверного кабеля (например, кабеля RS232 null modem).
    2. Запустите программное обеспечение контроллера, чтобы проверить, что степпер двигатели могут управляться под контролем программного обеспечения. Этот шаг может потребовать помощи местной ИТ-поддержки.

3. Процедура внутричерепного таргетинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Мужчины Sprague Доули крыс весом 250-350 г были использованы для этих экспериментов. Звери имели свободный доступ к воде и крысиный чау, и поддерживались на 12:12 ч света: темный цикл.

  1. Поместите животное под наркоз (3% изофлюран с кислородом) и проверьте на отсутствие реакции на щепотку нося. Затем вставьте катетер, как описано ниже.
    1. Разогреть хвост лампой, чтобы сделать легче попасть в вену. Будьте осторожны, чтобы не перегреть животное или сжечь хвост.
    2. После того, как животное спит (не реагирует на щепотку ноги), вставьте 24 G хвост вены катетер, который будет использоваться для доставки microbubbles, Эванс синий краситель (EBD), gadobutrol МРТ контраст при использовании МРТ, и экспериментальный агент, представляющий интерес. После того, как вена попала, кровь будет заполнить оболочку, медленно удалить внутреннюю иглу при нажатии оболочки дальше в вену.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите руководство, как Стюарт и Шредер33, если делать инъекции вены хвост крысы в первый раз.
    3. Если нет кровотока, медленно двигаться катетер оболочки из вены, чтобы проверить, что игла, возможно, ткнул через вену. Если кровь течет, когда катетер слегка оттягивается, то сначала тыкать прошли через вену и катетер размещения должны быть перезапущены в другом месте на хвосте, который является ростральным в предыдущем месте.
  2. Заполните катетер штепсельную вилку солевым раствором и привинчивите катетерную вилку в конце катетерного порта, как только порт заполнится кровью. Аккуратно оберните лабораторную ленту вокруг катетера и хвоста, чтобы держать ее на месте. Начните с небольшой кусок в верхней части и работать в хвостовом направлении, в результате чего в самом конце катетера плагин подвергается.
  3. Подключите линию анестезии к разъему анестезии на стереотаксиснойраме (рисунок 2a)и зафиксните головку животных в раме, поместив рот на бар укуса и направляя ушные батончики в оба ушных канала, затем затяните установленные винты. Убедитесь, что голова животных является безопасным и уровне.
  4. Переместите животное в кровать МРТ и соедините линию анестезии с конусом носа. В этом протоколе было использовано МРТ малой скважины 9.4 T.
  5. Соберите корональные и топорные T2-взвешенные изображения, которые захватывают весь мозг, а также МРТ фидуциальный(рисунок 2b) для координации измерений. Предоставьте местному физику МРТ или технологии следующую информацию, чтобы они могли построить протокол МРТ.
    1. Для корональных изображений(рисунок 2b сверху) используйте следующие параметры: количество изображений: 27, ширина: 62,2 мм, высота: 62,2 мм, глубина: 37,97 мм, размер Voxel: 0,24 x 0,24 x 1,41мм 3.
    2. Для осяных изображений(рисунок 2b дно), используйте следующие параметры: количество изображений: 13, Ширина: 61,47 мм, Высота: 53,81 мм, Глубина: 16,7 мм, размер Voxel: 0,41 х 0,21 х 1,29мм 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно иметь эти точные параметры до тех пор, пока коронал в разрешении плоскости близок к 0,25 мм, а изображения покрывают весь мозг и фидуциальный.
  6. Соберите координатные измерения с вышеуказанных изображений, записав расстояние от МРТ-фидуциального до области мозга, которое будет направлено на FUS.
    1. На сканере, на корональных изображениях, собранных в шаге 3.5, найти изображение, в котором фидуциальный является крупнейшим, указывая на центр фидуциального. Запись расстояние от верхней части фидуциального мозга области интереса в мм (МРТ программное обеспечение будет иметь масштаб или точки измерения инструмента, проконсультируйтесь с местными МРТ технологий или физика о том, как это сделать) как в медиальной / боковой направлении и в спинной брюшной направлении (Рисунок 2b, сверху).
    2. На сканере, на осяных изображениях, собранных в шаге 3.5, найти изображение, которое показывает очень верхней части фидуциального и измерить расстояние от центра фидуциального к области целевого мозга как в спинной / брюшной направлении и в медиальной / боковой направлении (Рисунок 2b, дно).
    3. Сравните два медиальных/бокового измерения и если они отличаются, используйте среднее значение. Эти координатные измерения будут использоваться позднее в шаге 4.3 для руководства координационным центром FUS к области целевого мозга с позиционером XY.
  7. Сбор МРТ прескан изображения. Сравните эти изображения с изображениями, собранными после открытия FUS BBB(рисунок 4). T1-взвешенные изображения позже будут использоваться для визуализации открытия BBB, T2-взвешенные изображения будут позже использованы для обеспечения не повреждение тканей произошло после лечения FUS34.
    1. Для T1-взвешенных осяных изображений используйте следующие параметры: ширина: 30 мм, высота: 51,2 мм, глубина: 3,0 мм, размер воксела: 0,23 x 0,2 x 0,23мм 3, количество изображений: 13.
    2. Для T2-взвешенных осяных изображений используйте следующие параметры: ширина: 30 мм, высота: 51,2 мм, глубина: 2,6 мм, размер воксела: 0,2 х 0,2 х 0,2мм 3, количество изображений: 13.
    3. Для взвешенных корональных изображений T1 используют следующие параметры: ширина: 30 мм, высота: 30 мм, глубина: 27 мм, размер воксела: 0,16 x 0,16 x 1мм 3, количество изображений: 27.
    4. Для взвешенных корональных изображений T2 используйте следующие параметры: ширина: 30 мм, высота: 30 мм, глубина: 27 мм, размер воксела: 0,12 x 0,12 x 1мм 3, количество изображений: 27.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в шаге 3.5, эти параметры изображения не должны быть точно такими же, как у перечисленные. Эти изображения имеют меньший FOV и более высокое разрешение, чем те, собранные в шаге 3.5.
  8. Удерживая животное в стереотаксисной раме, быстро транспортируют животное с МРТ-кровати на скамейку FUS установки. Убедитесь, что животное остается спящим для передачи под действием анестезии.
  9. Для более длительного времени передачи используйте коробку для переноса, которая достаточно большая, чтобы соответствовать животному и раме. С анестезией штепсельная вилка по-прежнему прилагается, поместите животное и кадр внутри коробки и позволяют избыток изофлюран, чтобы заполнить коробку в течение нескольких минут. Отключите линию анестезии и быстро перенесите.

4. Сфокусированная ультразвуковая процедура

  1. Прибыв на скамейку FUS установки, немедленно подключить анестезии линии в нос конуса и продолжать работать 1,5-3% изофлорана с кислородом. Сделайте это как можно быстрее, чтобы животное не проснулось.
  2. Сдвиньте рамку в держатель кадра и прикрепьте ее на место твердо. Используйте клиперы, чтобы побрить голову животного. Отмахнуться от лишних волос и нанесите крем для удаления волос на кожу головы. Пусть сидят в течение 3 минут и протрите водой и марлей.
  3. Если МРТ не доступен для таргетинга, используйте стандартный (не напечатанный на 3D) стереотаксическую рамку, чтобы свести на нет положение указателя для брегмы, касаясь наконечника указателя на брегму (для этого потребуется разрез кожи головы) и аннулировать программное обеспечение или записывать координаты. Перемести карету XY на 50 мм, нажав на кнопку до 50 в программном обеспечении и поменяв указатель на предуцера. На основе атласа мозга крысы, как описаноранее 35, перейти к желаемым координатам мозга с помощью кнопок в программном обеспечении. При использовании этого метода вместо МРТ, перейти к разделу 4.6.
  4. При использовании МРТ руководство, приложите указатель и переместить указатель к расположению МРТ fiducial(рисунок 1d,g). Распоитите указатель в самом верху и в центре ФИдуциального МРТ (для указания предусмотрено небольшое отверстие в верхней части фидуциального держателя). Нажмите кнопку нулевого положения, которая является точкой, из которой были рассчитаны все расстояния на изображении МРТ.
  5. Удалите указатель и переместив позиционер к медиальной/боковой координатам и ростальным/каудальным координатам. Поднимите позиционер вверх, нажав на 50 кнопок, чтобы обеспечить размещение водяной бани и ультразвукового геля. Если верхняя часть путешествия по оси «З» будет достигнута, место аннулирования будет признано недействительным. Спинная/вентальная координата будет установлена после добавления предуцера.
  6. Нанесите ультразвуковой гель на кожу головы животного и поместите водяную баню на животное с полиимидной лентой окна нажата на гель. Убедитесь, что в ультразвуковом геле нет пузырьков воздуха.
  7. Заполните водяную баню дегазатной водой.
  8. При использовании высокой мощности предуцатора, опустите позиционер так, чтобы магнит чуть выше воды. Прикрепите предук к позиционеру, тщательно опустив предуцатора в воду под углом, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха под лицо и соединить магниты.
  9. При использовании малой мощности погружения предуцатор, опустите позиционер в воду чуть выше предуцатора клипа. Затем клип предуцера на месте, медленно опуская его в воду под углом, чтобы предотвратить пузырьки воздуха от получения в ловушке под лицом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачная ванна полезна при взгляде под лицо предуцера для пузырьков.
  10. Опустите позиционер до спинной/вентеральной координаты.
  11. Включите усилитель питания RF.
  12. Впрыснуть 1 мл/кг 3% Эванс синий краситель (EBD) путем прилипания кончик иглы в катетер штепсельную вилку и инъекций. Разрешить его циркулировать в течение 5 минут.
  13. Активировать microbubbles, встряхивая их яростно с пузырем шейкер.
    1. Подготовка 5x доза 30 йл /кг микропузырьки (пузырь Conc. 1.2 х 1010/mL) в 0,2 мл солевого раствора для учета 2 FUS лечения и трубки в 18 G крылатых инфузии набор. Например, если крыса весит 200 г, то заполните шприц, содержащий 18 G кончик иглы с 30 мл микропузырьки в 1 мл солевого раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы использовать 18 G иглы советы для принятия и инъекций с крылатым набором инфузии.
    2. Инвертировать шприц несколько раз, чтобы получить равномерное распределение microbubbles. Затем прикрепите и заполните крылатый набор настоя. Распоить шприц на инфузионный насос и установить инфузионный насос для доставки 0,2 мл со скоростью 6 мл/ч. Это обеспечит медленное вливание микропузырей над 2-минутной экспозицией FUS.
    3. Вставьте крылатую иглу в вилку катетера.
  14. Во-первых, запустить инфузионный насос, подождать 3 с и начать обработкуFUS, нажав кнопку выхода включить кнопку включения генератора функции (помечены " на " на генератор функции в таблице материалов). Повторите эти два раза в регионе с 5 мин между ними, чтобы микропузырьки, чтобы очистить.
    1. Нажмите на кнопку снова на генератор функции, чтобы остановить лечение FUS, когда инфузионный насос останавливается на 2 мин.
    2. Подождите 5 минут для микропузырей, чтобы очистить. Затем начните инфузию и второе лечение ФУС.
    3. Сразу после второго лечения ФУС вводят гадобутролный контраст (при использовании МРТ) и агент интереса, например, вирусные частицы. Общий объем поставок всех агентов не должен превышать 5 мл/кг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки поставки (например, до или после открытия FUS BBB) агента, представляющих интерес, могут отличаться в зависимости от используемого агента.
  15. Выключите усилитель питания RF и немедленно транспортировать животное обратно в МРТ.

5. МРТ подтверждение открытия BBB

  1. Если МРТ недоступна, перейти к разделу 6 и использовать выражение EBD для подтверждения открытия BBB.
  2. Поместите животное обратно на кровать МРТ в том же месте, как в шаге 3.7 и подключить линию анестезии.
  3. Соберите МРТ пост сканирует с теми же параметрами изображения, используемые в шаге 3.7 для визуализации gadobutrol МРТ повышение в области открытия BBB (Рисунок 3b,e).

6. Сбор перфузии и тканей

  1. Perfuse животное с холодным 4% формалин до тех пор, пока кровь работает полностью ясно.
  2. Удалите мозг и поместите в 4% формалин или PFA при 4 градусов по Цельсию на ночь. Далее поместите мозг в 30% раствор сахарозы, пока мозг тонет (около 2-3 дней). Наконец, вспышки замерзают в жидком азоте или на сухом льду и хранят при -80 градусов до криозирования.
  3. Заморозить мозг в ОКТ и принимать cryosections.
  4. Исправить и крышки разделов для флуоресценции микроскопии. Пики возбуждения EBD на уровне 470 и 540 нм и пики выбросов на уровне 680 нм. Coverslip с DAPI монтаж среды для того, чтобы визуализировать общую клеточную морфологию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы демонстрируем, что сфокусированное УЗИ с помощью микропузырьков может вызвать локализованное открытие BBB, используя указанные выше параметры как с малоэйтовым предуктором погружения(рисунок 3),так и с предуктором FUS(рисунок 4). Во-первых, в ранних экспериментах, малой мощности погружения преобразователя была направлена на одно полушарие мозга либо передней (Рисунок 3b) или медиальной (Рисунок 3a). Затем животные были принесены в жертву 2 часа спустя с перфузией(рисунок 3a) или без перфузии(рисунок 3b)и 10 мкм замороженных секций мозга были собраны. Открытие FUS BBB было очевидно автофлюоресценцией EBD (возбуждение: 470 и 540 нм, эмиссия: 680 нм) в целевом полушарии (белые стрелки Рисунок 3a и 3b).

Мы нашли его лучшим, чтобы пронизать животных для четкой визуализации открытия BBB с EBD autofluorescence. Тем не менее, открытие BBB все еще можно визуализировать без очистки кровеносных сосудов(рисунок 3b). Сотовое поглощение и оформление EBD после открытия BBB начинается уже через 30 минут после открытия BBB и увеличивается в течение 24 часов37. Для оценки открытия BBB с автофлюоресценцией EBD лучше всего пожертвовать животным между 15 минутами и 3 часами открытия BBB. Хотя в конечном счете, время жертвы будет зависеть от агента, который был доставлен. Например, в исследовании AAV, 3 недели после открытия BBB и AAV доставки(рисунок 5c) может быть целесообразным.

В более поздних экспериментах, FUS преобразователь был направлен либона гиппокамп ( Рисунок 4a-c) или передней cingulate коры (ACC) (Рисунок 4 d-f) и в дополнение к EBD, МРТ контрастного агента gadobutrol (0,1 мл/кг) был IV вводили для проверки целевого открытия BBB in vivo. Рисунок 4b,e показать расширенный контраст МРТ, где контраст gadobutrol вошел в ткань через 1 час после открытия BBB и инъекции контрастного агента. Это изменение контраста очевидно по сравнению с ПРЕСКАН МРТ, принятых до процедуры FUS(рисунок 4a,d). Затем животные были принесены в жертву перфузией через 1,5 часа после открытия BBB и 10 мкм криозиций были собраны. Автофлюоресценция EBD очевидна в целевых регионах FUS, что еще больше указывает на расположение открытия BBB(рисунок 4c,f). Эта цифра подчеркивает, как МРТ контраст иногда может быть трудно увидеть (как и в разнице между рисунком 4b и рисунок 4e); поэтому полезно подтвердить открытие BBB с визуализацией автофлюоресценции EBD как в микрографе флуоресценции на рисунке 4f.

Для оценки того, может ли этот метод быть использован для целевой доставки гена AAV9-hsyn-GFP и гадобутрол контраст были введены IV (титр: 1,32 х10 14 GC/mL, 0,05 мл/кг) сразу после открытия BBB в гиппокампе. Затем животное было mr изображено через 30 минут после открытия BBB и принесено в жертву 3 недели спустя перфузией. Для флуоресцентной визуализации экспрессии GFP было собрано 10 криозекций. Открытие BBB было очевидно контрастом гадобутрола в целевом гиппокампе(рисунок 5a,b). Кроме того, доставка генов была подтверждена экспрессией GFP в целевом гиппокампе, очевидной зеленой флуоресценцией(рисунок 5c). Обратите внимание, что в это время EBD очистился и проявляется только в желудочках(рисунок 5c).

Figure 1
Рисунок 1: FUS скамейке установки. () FUS установки, включая позиционер XY, 30 мм диаметром ПВХ трубы для крепления предуцера, 3D-печатной стереотаксии кадра, и инфузионный насос. b)конец трубы из ПВХ ограничен, и к ней прикрепляется магнит с эпоксидной смолой. c)Другой соответствующий магнит крепится к верхнему центру высокой мощности препровога с эпоксидной смолой. d)Кроме того, к указателю прикрепляется еще один соответствующий магнит для аннулирования позиционер в верхней и центральной части ФИдуциального МРТ. e)указатель в конечном итоге заменяется высокой мощности преобразоваваемого и водяная ванна в сочетании с головой животного с ультразвуковым гелем. f) предукпогружения малой мощности может быть прикреплен к трубе ПВХ с помощью 3D-печатного предуцера. g)Для позиционирования предуц заменяется указателем, напечатанным на 3D-принтере, а позиционер сведен на нет в верхней и центральной части фидуциального МРТ. h)стационарный держатель рамы, напечатанный на 3D-принтере, позволяет вернуть животное в такое же положение после МРТ, если требуется несколько процедур FUS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Стереотаксис кадр с МРТ fiducial для МРТ-управляемых координат. a)животные впервые расположены в стереотаксисной раме, напечатанной на 3D-принтере, оснащенной МРТ-фидуциальной. b)Рама затем помещается внутри кровати МРТ и расстояние от фидуциального (пунктирный круг) до области головного мозга цели измеряется с помощью обоих корональных изображений для спинных / вентеральных (D /V) измерений и осейных изображений для измерений рострал/каудаль (R/C), медиальные/латеральные (M/L) измерения могут быть собраны с обеих осей. Звери хранятся в кадре и передаются на станцию FUS, где указатель используется для аннулирования позиционер XY' в месте фидуциального. Затем указатель заменяется предуцом, который затем может быть перемещен на основе собранных координат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Эванс синий краситель (EBD) подтверждает FUS BBB открытия как с и без перфузии. a)Микрограф участка мозга на 10 мкм через 2 часа после открытия FUS BBB с малой мощности трансдуцером погружения, нацеленный на медиального левого полушария. Это репрезентативное изображение животного, которое было пронизано 4% буферного формалина до сбора тканей. Открытие BBB проявляется красным автофлуоресценцией EBD (стрелка). b)Микрограф участка мозга на 10 мкм через 2 часа после открытия FUS BBB нацелен на переднее левое полушарие. Это репрезентативное изображение животного, которое не было пронизано до сбора тканей поэтому, EBD остается в кровеносных сосудах. Открытие BBB очевидно, где EBD просочилась из кровеносных сосудов (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: FUS BBB открытие подтверждено с Gadobutrol МРТ контраста и EBD выражение. MR изображения до(a и d)и после (b и e) BBB открытия. повышение контрастности gadobutrol подтверждает расположение открытия BBB in vivo(b и e,стрелки). c) 10 мкм мозга, показывающий дальнейшее подтверждение открытия BBB с автофлюоресценцией EBD (красный) в гиппокампе (голубое ядерное пятно DAPI). Масштабная планка; 500 мкм. (f) Микрограф 10 мкм секции мозга после открытия BBB в передней cingulate коры очевидно EBD красный аутофторесценции (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Локализованная доставка AAV9-hsyn-GFP в гиппокамп через открытие FUS BBB. МРТ подтверждение открытия BBB с МРТ контрастного агента, МРТ контраст (стрелки) в обоих корональных(а)и аксиальных (b) T1 взвешенных изображений. c)гистологическое подтверждение экспрессии GFP в гиппокампе FUS (зеленый) через 3 недели после открытия FUS BBB и инъекции AAV9-hsyn-GFP IV. Синий цвет указывает на ядерное пятно DAPI для общей клеточной морфологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описали скамейке подход к microbubble помощь FUS BBB открытия с альтернативными подходами, включая, два различных трансдуцаторов и методы внутричерепного ориентации с и без МРТ руководства. В настоящее время для того, чтобы установить МРТ-руководство FUS BBB открытия в лаборатории, есть возможность приобрести отличные готовые к использованию устройства, которые обеспечивают высоко стандартизированные и воспроизводимые результаты с удобными интерфейсами. Однако многие лаборатории не готовы к стоимости таких инструментов. Таким образом, основная цель этого протокола заключается в том, чтобы обеспечить отправную точку, что любая лаборатория может установить для того, чтобы построить свой опыт в технике.

FUS BBB открытие в настоящее время широко используется метод, и это часто бывает, что различные группы используют различные агенты и анестетики, каждый из которых может повлиять на степень открытия BBB и экстравазии. Важно отметить, что конкретный анестетик используется может повлиять на величину открытия BBB поэтому важно учитывать это при выполнении этого протокола38. Здесь используется анестетический изофлюран, потому что животные могут поддерживаться под изофлюраном в течение всего протокола, а уровни изофлюранового газа можно легко регулировать в зависимости от скорости дыхания животного и сердечного ритма. Кроме того, мы доставили изофлюран кислородом, потому что он был более доступным, чем медицинский воздух; однако, медицинский воздух может позволить более обширные BBBоткрытия 39. Некоторые контрастные агенты МРТ более подходят для этого протокола, чем другие. Например, в наших руках, gadoteridol производится не контраст повышения даже тогда, когда утечка EBD явно присутствует в ткани посмертно. Microbubble формулировка также имеет важное значение. Здесь мы используем микросферы липидов перфлютренда. Другие микропузырьки формулировки, такие как perflutren белка типа микропузырьки легко доступны, но тип микропузырька используется повлияет нарезультаты 15.

Управление генераторами функций может варьироваться совсем немного, поэтому обратитесь к руководству для получения инструкций о том, как ввести настройки, перечисленные в шаге 1. Соответствующее командное напряжение (V пик к пику на генераторе функции) сильно зависит от свойств преобразователя, усиления усилителя RF, усилителя РФ до соответствия преобразователя, возраста и размера животного, типа и концентрации микропузыря, а также желаемого эффекта лечения. Пик пика V должен быть определен путем проб и ошибок. Начните с параметров, предложенных в шаге 1 и определить эффект гистограммо. Если есть повреждения тканей, снизить пик пика V на 10% и попробуйте еще раз. Аналогичным образом, если нет BBBO затем поднять пик пика V на 10% и попробуйте еще раз. Установка слишком высокой части V может привести к повреждению превлодщика погружения низкой мощности. Это будет очевидно, как растрескивание или искажение лица предуцера. Время производства свинца на предуцаторах может быть долгим, поэтому при запуске мы предлагаем приобрести более одного предуцера в качестве резервного копирования. Ультразвуковые превью могут также повредить усилители, если они неправильно совпадают. Для простоты и надежности мы предлагаем использовать прочный усилитель мощности, который может управлять сложными нагрузками (например, усилитель мощности RF в таблице материалов). Обратите внимание, что в то время как высокой мощности препрвестира поставляется с соответствующей цепи, низкая мощность погружения предуцера нет. Предлагаемый усилитель RF может обрабатывать отраженную мощность от плохо совего предуцера, но некоторые усилители могут быть повреждены в этой конфигурации. Кроме того, если шаг 2.7 оказывается проблематичным после установки драйвера и программного обеспечения, дважды проверьте, что соответствующий серийный порт выбран в программном обеспечении. Следующая попытка другой серийный кабель. Если это не удается, обратитесь за локальной ИТ-поддержкой.

Из опыта, это займет практике и несколько корректировок для достижения жесткой точности в области мозга ориентации. Это можно увидеть в различиях таргетинга между ранними экспериментами(рисунок 3)и самыми последними экспериментами(рисунок 5). Мы начали эксперименты с использованием классической стереотаксисной рамы и включаем ее в качестве опции, если нет доступа к 3D-принтеру или если нет доступа к МРТ грызунов. Тем не менее, МРТ-руководство с МРТ fiducials и 3D печати кадра при условии (или пользовательского дизайна) является идеальным методом. Во-первых, он объясняет индивидуальные различия между животными, собирая координаты внутри животного, а не полагаясь на средний атлас мозга крысы. Кроме того, использование МРТ позволяет подтвердить местоположение FUS, ориентированное на vivo, а не полагаться на посмертное выражение EBD. Это важно при доставке агентов, которые могут потребовать более 24 часов, чтобы вступить в силу, такие как AAVs(рисунок 5). Наконец, держатель рамы при условии позволяет вернуть животное обратно в то же положение после МРТ, чтобы исправить любые ошибки ориентации или повторить FUS после недостаточного открытия BBB без необходимости передедать координаты. Переносной стереотаксис 3D-печати можно использовать в любой МРТ с четким отверстием 200 мм или шире.

В зависимости от распределения кровеносных сосудов в целевомместе, толщина черепа 40, наличие желудочков, и другие факторы степень открытия BBB может варьироваться. По этой причине мы предоставляем метод повторного таргетинга с рамкой и держателем кадра. Точность таргетинга критически зависит от сохранения внимания предуцера в согласованном месте по отношению к указателю таргетинга. Кончик этого указателя должен указывать расположение в пространстве центра фокуса предуцатора, когда предук прикреплен к позиционеру XY. Магниты позволяют легко поменять указатель и предуцера при сохранении этой колокализации. Отверстие и выступ в магнитах должны соответствовать как можно точнее. Любая изменчивость в этом соединении снижает повторяемость таргетинга FUS. Тем не менее, будет пространственное смещение между наконечником указателя и ультразвуковой фокус. После того, как подтвердится, что смещение является последовательным, он может быть исправлен с помощью изображений MR для расчета разницы в мм в результате ОТКРЫТИЯ BBB место (местоположение контраста МРТ) и предполагаемого целевого местоположения. Эта разница может быть учтена в нулевом месте. Точность и повторяемость также извлекают большую пользу из использования той же частоты ультразвука и использования крыс аналогичного размера и возраста в данном наборе экспериментов. Ультразвуковое затухание мозгом крысы и черепа крысы варьируется в зависимости от частоты и размера черепа, а толщина черепа меняется с возрастом. Череп также небольшая полость по отношению к ультразвуковому импульсу и инцидент ультразвук взаимодействует с отражениями внутри черепа, чтобы произвести сложное звуковое поле, которое зависит от ткани, черепа, частоты и положения предуцера40.

Как указано в другом месте, этот протокол предназначен для обеспечения низкой инвестиционной альтернативой отличным МРТ совместимых коммерческих решений, которые уже доступны для покупки. Существуют важные ограничения, которые являются результатом сохранения низкой стоимости. Существуют также ограничения, присущие технике, учитывая физику и современное состояние искусства. Примечательно, что, несмотря на эти ограничения, и, как показано в репрезентативных результатах, мы можем добиться последовательной доставки красителей, частиц и вирусов в гиппокамп крыс с субмиллиметровой точностью. Наиболее важными ограничениями являются то, что (1) форма фокуса FUS зависит от промежуточной ткани и особенно формы и толщины черепа. Необходимость удаления животного из МРТ для выполнения лечения FUS предотвращает обратную связь в режиме реального времени о локализации и интенсивности фокусировки FUS. Без этой обратной связи в режиме реального времени необходимо провести несколько экспериментов, чтобы подтвердить настройки для каждой комбинации местоположения таргетинга. После того, как настройки "набрали в", мы нашли хорошую повторяемость. (2) Позиционирование XY и фидуциальная система, как построено, в то время как точный, не обеспечивает точность в рамке координат позиционер от эксперимента к эксперименту. Относительные местоположения дома XY, черепа грызуна и рамы могут перемещаться относительно друг друга от эксперимента к эксперименту. Это исключается с помощью МРТ-изображения для таргетинга, указателя таргетинга и фидуциального с известным расположением в пространстве по отношению к фокусу FUS, обеспечивая, чтобы система координат МРТ была параллельно системе позиционирования XY, путем проведения тестовых процедур до набора реальных процедур и выполнения всей процедуры в течение одного сеанса, так что животное не нужно было переместить в кадр. Обратите внимание, что, поскольку используется только один фидуциальный, вращения кадров не корректируемы, поэтому крайне важно обеспечить уровень рамы по отношению к кровати МРТ и родила. Таким образом, расположение указателя не указывает на истинную фокус FUS, но мы обнаружили, что смещение соответствует данному расположению мозга при условии, что череп не вращается относительно ультразвукового преведать. Также обратите внимание, что последовательное время доставки gadobutrol по отношению к открытию BBB и изображения имеет решающее значение для последовательных результатов, особенно если МРТ контрастное изменение используется в качестве прокси для суммы открытия BBB (см. 36).

Мы впервые начали FUS BBB открытия в лаборатории с малой мощности погружения предуцатор описано выше. Мы обнаружили, что это доступный вариант для начала работы с этой техникой. Самое главное, адаптация этого протокола может обеспечить неинвазивную альтернативу внутричерепной стереотаксиальной хирургии и доклиниковыхисследований,проведенных с помощью этой техники можно считать весьма трансляционной в связи с текущим использованием транскраниальных FUS улюдей 30,32,41. После создания в лаборатории, этот метод может быть использован в качестве неинвазивной альтернативы стереотаксисной хирургии. Таким образом, преобразование строго следственного инструмента в высоко переводный инструмент. Наша лаборатория будет использовать этот метод для МРТ руководствоваться, локализованные доставки вирусов и наночастиц для разработки новых, неинвазивных методов нейромодуляции, которые могут быть использованы в свободно ведет себя проснулся грызунов и не-человеческих приматов. Текущая работа сосредоточена на дизайнер наркотиков исключительно предназначен для дизайнеров рецепторов (DREADDs) и сенсибилизации нейронов к низким дозам высокой энергии частиц, таких как рентгеновские лучи. Лаборатория также работает над новой версией этого протокола, которая может быть выполнена в человеческом 3 T сканер, чтобы устранить необходимость перемещения животного во время лечения и позволить в режиме реального времени ориентации обратной связи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было частично поддержано грантом NSF EPSCoR Research Infrastructure Университету Клемсона (1632881). Кроме того, это исследование было частично поддержано Civitan Международный исследовательский центр, Бирмингем, AL. Авторы с благодарностью признают использование услуг и средств Университета Алабамы в Бирмингеме малых животных Imaging Общий фонд Грант "NIH P30 CA013148". Авторы признают Раджив Чопра за его поддержку и руководство.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bubble shaker Lantheus Medical Imaging VMIX VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles
Catheter plug/ Injection cap SAI infusion technologies Part Number: IC Catheter plug/ Injection cap
Evans blue dye Sigma E2129-10G Evans blue dye
Function generator Tektronix AFG3022B Dual channel, 250MS/s, 25MHz
FUS transducer, 1.1MHz FUS Instruments TX-110 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone
Heating pad for Mice and Rats Kent Scientific PS-03 Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats
Infusion pump KD Scientific 780100 KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump
Kapton tape Gizmo Dorks https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		 Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack
Low power immersion transducer, 1MHz Olympus V303-SU Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF
Magnet sets WINOMO https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		 WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets
RF amplifier E&I A075 75W
Tail vein catheter BD 382512/ Fisher Item: NC1228513 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)
Ultrasound contrast microbubbles Lantheus Medical Imaging DE4, DE16 DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
Ultrasound gel Aquasonic https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		 Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle
Winged infusion sets, 22ga. Fisher Healthcare 22-258087 Terumo Surflo Winged Infusion Sets
motor controller software N/A N/A custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller
runtime environment for the motor controller software National Instruments LabView runtime engine version 2017 or better https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) Velmex
bolts Velmex MB-1 BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3
motor controller Velmex VXM-3 Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2
usb to serial converter Velmex VXM-USB-RS232 USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1
x-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
x-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
y-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
y-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis damper Velmex D6CL-6.3F D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
z-axis stepper motor Velmex PK266-03B-P2 Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
3D printable files
Immersion transducer mount and pointer https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaxic frame https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaxic frame holder https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T small bore animal MRI Bruker Bruker BioSpec 94/20 ParaVision version 5.1
AAV9-hsyn-GFP Addgene
Cream hair remover Church & Dwight Nair cream
gadobutrol MRI contrast agent Bayer Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotactic frame Stoelting #51500 not MRI compatible
turnkey FUS delivery device FUS Instruments RK-300 ready to use MRI compatible FUS for rodents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).

Tags

Неврология выпуск 160 Сфокусированное УЗИ Гемброво-мозговой барьер неинвазивная нейромодуляция доставка лекарств неинвазивная доставка лекарств стереотаксис
Бенчтоп Подход к местоположению Конкретный барьер мозга крови Открытие с помощью целенаправленного ультразвука в крысиной модели
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F.,… More

Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F., Bolding, M. A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model. J. Vis. Exp. (160), e61113, doi:10.3791/61113 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter