Summary
Gerichte echografie met microbubble-middelen kan de bloed-hersenbarrière focal en voorbijgaand openen. Deze techniek is gebruikt om een breed scala aan middelen over de bloed-hersenbarrière te leveren. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor de gelokaliseerde levering aan de knaagdierhersenen met of zonder MRI-begeleiding.
Abstract
Stereotaxische chirurgie is de gouden standaard voor gelokaliseerde medicijn- en genafgifte aan de knaagdierhersenen. Deze techniek heeft veel voordelen ten opzichte van systemische levering, waaronder nauwkeurige lokalisatie naar een doelbreingebied en vermindering van off-target bijwerkingen. Stereotaxische chirurgie is echter zeer invasief, wat de translationele werkzaamheid beperkt, lange hersteltijden vereist en uitdagingen biedt bij het richten op meerdere hersengebieden. Gerichte echografie (FUS) kan worden gebruikt in combinatie met circulerende microbubbles om de bloed-hersenbarrière (BBB) in millimetergrote gebieden tijdelijk te openen. Dit maakt intracraniale lokalisatie mogelijk van systeemgeleverde agenten die normaal gesproken de BBB niet kunnen overschrijden. Deze techniek biedt een niet-invasief alternatief voor stereotaxische chirurgie. Tot op heden moet deze techniek echter nog op grote schaal worden toegepast in neurowetenschappelijke laboratoria vanwege de beperkte toegang tot apparatuur en gestandaardiseerde methoden. Het algemene doel van dit protocol is om een benchtop-benadering van FUS BBB-opening (BBBO) te bieden die betaalbaar en reproduceerbaar is en daarom gemakkelijk door elk laboratorium kan worden aangenomen.
Introduction
Ondanks de vele ontdekkingen in de basisneurologie blijft het aantal opkomende behandelingen voor neuroontwikkelings - en neurodegeneratieve aandoeningen relatief beperkt1,2. Een dieper begrip van de genen, moleculen en cellulaire circuits die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen heeft veelbelovende behandelingen gesuggereerd die niet te verbeelden zijn bij mensen met de huidige technieken3. Effectieve behandelingen worden vaak beperkt door de noodzaak om hersendoordringbaar en plaatsspecifiek te zijn4,5,6,7,8. Bestaande methoden voor gelokaliseerde medicijnlevering aan specifieke hersengebieden (bijv. levering via injectie of canule) zijn echter invasief en vereisen een opening in de schedel9. De invasieve werking van deze operatie voorkomt het routinematige gebruik van gelokaliseerde levering in het menselijk brein. Bovendien zijn weefselschade en de resulterende ontstekingsreacties alomtegenwoordige confounds voor basis- en preklinische studies die afhankelijk zijn van intracerebrale injectie10. Het vermogen om niet-invasief middelen over de bloed-hersenbarrière (BBB) te leveren en deze te richten op specifieke hersengebieden kan een enorme impact hebben op behandelingen voor neurologische aandoeningen, terwijl tegelijkertijd een krachtig onderzoeksinstrument voor preklinisch onderzoek wordt geboden.
Een methode voor gericht transport over de BBB met minimale weefselschade is transcraniële gerichte echografie (FUS) samen met microbubbles om deBBB 11 ,12, 13,14,15,16brandpunts- en transiëntieel te openen . FUS BBB opening heeft recente aandacht gekregen voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen, beroerte en glioom door het lokaliseren van therapieën om hersengebieden zoals neurotrofefactoren 17,18,19, gentherapieën20,21,22,antilichamen23, neurotransmitters24, en nanodeeltjes25,26,27,28,29te targeten . Met zijn brede scala aan toepassingen en zijn niet-invasieve aard30,31, FUS BBB opening is een ideaal alternatief voor routine stereotaxic intracraniale injecties. Bovendien, vanwege het huidige gebruik bij mensen30,32,kunnen preklinische onderzoeken met behulp van deze techniek als zeer translationeel worden beschouwd. De opening van FUS BBB moet echter nog een wijdverbreide techniek zijn in de basiswetenschap en het preklinisch onderzoek vanwege een gebrek aan toegankelijkheid. Daarom bieden we een gedetailleerd protocol voor een benchtop-benadering van FUS BBB-opening als uitgangspunt voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het opzetten van deze techniek.
Deze studies werden uitgevoerd met ofwel een high-power air backed FUS specifieke ultrasone transducer of een low power gedempte geconcentreerde ultrasone immersie transducer. De transducers werden aangedreven door een RF-eindversterker ontworpen voor reactieve belastingen en een standaard benchtop-functiegenerator. Details voor deze items zijn te vinden in de tabel met materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Gerichte ultrasone rijapparatuur setup
- Gebruik 50 Ohm coaxiale BNC-kabels om (1) de ingang van de ultrasone transducer aan te sluiten op de uitgang van de RF-versterker en (2) de ingang van de RF-versterker op de uitgang van de functiegenerator.
- Stel de werkingsgeneratormodus in op een sinusoïde burst eenmaal per seconde met een duty cycle van 1%.
- Voor de gedempte 1 MHz low-power immersietransducer met een brandpuntsafstand van 0,8 inch die wordt gebruikt met een 50 dB RF-versterker, stelt u de startinstellingen in op: 1 MHz sinusgolf, 1 V piek tot piek, 10k cyclus, 1 s interval (of periode).
- Voor de lucht backed, 1,1 MHz high-power transducer, stel de eerste instellingen in op: 1,1 MHz sinus, 50 mV piek tot piek, 11k cycli, 1 s interval.
OPMERKING: Gebruik de transducers alleen als ze onder water staan. Plaats geen hand of ander lichaamsdeel bij de ultrasone focus en raak het transducergezicht niet aan terwijl het in werking is.
2. Gerichte ultrasone benchtop setup
- 3D-print het stereotaxic frame en de stereotactische framehouder.
- Sluit de transducer aan op de XYZ-positioner met behulp van een klem die een PVC-buis vasthoudt(figuur 1a). Bout de klem op de X-asschuif en vergrendel met een vleugelmoer.
- Als u de krachtige ultrasone transducer gebruikt, bevestigt u deze aan de PVC-buis met behulp van een bijpassend paar magneten. Zorg ervoor dat de ene magneet een gat heeft en de andere een bijpassend uitsteeksel heeft. Bedek de onderkant van de PVC-buis en bevestig er een van de magneten aan met epoxy (zie figuur 1b).
- Bevestig de tweede magneet aan het bovenste midden van de krachtige ultrasone transducer met epoxy. Zorg ervoor dat het zich in het midden van de transducer bevindt(figuur 1c).
- Als u de krachtige ultrasone transducer gebruikt, maakt u een aanwijzer voor het tenietdoen van de XYZ-positioner. De punt van deze aanwijzer geeft de locatie in de ruimte van het midden van de transducerfocus aan wanneer de ultrasone transducer aan de XYZ-positioner is bevestigd. Maak een aanwijzer van een naaldsnede van 18 G om de lengte van de brandpuntsafstand van de transducer plus de dikte van de transducer te zijn (figuur 1d).
- Breng epoxy aan op een derde magneet (deze magneet combineert ook met de PVC-dopmagneet) en bevestig deze aan de bovenkant van de aanwijzer. De aanwijzer kan dan aan de magneet op de PVC-buis worden bevestigd voor XYZ-nulling(afbeelding 1d).
- Als u de low-power dompeltransducer gebruikt, drukt u het bestand voor de aanwijzer en de montageclip 3D-printen.
- Bevestig de low-power onderdompelingstransducer aan de PVC-buis door de montageklem op de PVC-buis te knippen en plaats de transducer in de ring(afbeelding 1f).
- Maak een waterbad door stukken aan elkaar te lijmen die zijn gesneden uit acrylplaat die boven het stereotactische frame op het hoofd van het dier kunnen rusten (figuur 1e).
- Snijd een opening in de bodem van het bad die ongeveer zo groot is als het hoofd van het dier. Bedek het gat in het waterbad met een polyimidetape.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen water rond de polyimidetape lekt, omdat het de vacht van de rat nat kan maken en onderkoeling kan veroorzaken.
- Snijd een opening in de bodem van het bad die ongeveer zo groot is als het hoofd van het dier. Bedek het gat in het waterbad met een polyimidetape.
- Maak een MRI-fiducieel door een dunne plastic of glazen bol met een diameter van 4 mm te vullen met een MRI-zichtbare vloeistof (bijv. vitamine E-olie) en sluit deze af. Plaats het in de MRI-fiduciale houder aan de rechterkant van het 3D-geprinte stereotaxicframe (figuur 2a).
- Bevestig de 3D-geprinte framehouder stevig aan de XYZ-positioner op een goede locatie voor het positioneren van dieren. Schuif het lipje op het rostrale uiteinde van de framehouder in het bijpassende kanaal op de Y-asrail en bevestig met ingestelde schroeven(afbeelding 1h,rode pijlen).
- Voor het aandrijven van de XYZ-positioner installeert u de USB-naar-seriële converter op een computer door de aanwijzingen van de fabrikant te volgen en de converter aan te sluiten. Installeer de runtime-omgeving en motorcontrollersoftware op de pc.
- Zorg ervoor dat de juiste seriële poort in de software is geselecteerd door de USB-naar-seriële converter te selecteren in de vervolgkeuzelijst poortselectie op het voorpaneel van de controllersoftware. Sluit de USB op de seriële converter aan op de steppermotorcontrollerbox met behulp van een 9-pins seriële crossover-kabel (bijv. RS232 null-modemkabel).
- Voer de controllersoftware uit om te testen of de stappenmotoren onder softwarebesturing kunnen worden aangedreven. Voor deze stap kan de hulp van lokale IT-ondersteuning nodig zijn.
3. Intracraniële targetingprocedure
OPMERKING: Mannelijke Sprague Dawley ratten met een gewicht van 250-350 g werden gebruikt voor deze experimenten. Dieren hadden gratis toegang tot water en ratten chow, en werden onderhouden op een 12:12 uur lichte: donkere cyclus.
- Plaats het dier onder narcose (3% isofluraan met zuurstof) en controleer op het gebrek aan respons op de teenknijper. Plaats vervolgens de katheter zoals hieronder beschreven.
- Verwarm de staart met een lamp om te maken is gemakkelijker om de ader te raken. Zorg ervoor dat u het dier niet oververhit of de staart verbrandt.
- Zodra het dier slaapt (reageert niet op een teenknijper), plaatst u de 24 G staartaderkatheter die zal worden gebruikt om microbubbles, Evans blue dye (EBD), gadobutrol MRI-contrast te leveren bij gebruik van MRI en het experimentele middel van belang. Zodra de ader is geraakt, zal bloed de schede vullen, langzaam de binnennaald verwijderen terwijl de schede verder in de ader wordt geduwd.
OPMERKING: Zie een gids zoals Stuart en Schroeder33 als u de rattenstaartaderinjecties voor de eerste keer doet. - Als er geen bloedstroom is, beweeg dan langzaam de kathetermant uit de ader om te testen of de naald mogelijk door de ader is geprikt. Als er bloed stroomt wanneer de katheter iets wordt teruggetrokken, gaat de eerste por door de ader en moet de plaatsing van de katheter opnieuw worden gestart op een andere locatie op de staart die rostral is ten opzichte van de vorige locatie.
- Vul de katheterplug met zoutoplossing en schroef de katheterplug in het uiteinde van de katheterpoort zodra de poort met bloed is gevuld. Wikkel de labtape voorzichtig om de katheter en de staart om deze op zijn plaats te houden. Begin met een klein stukje aan de bovenkant en werk in de caudale richting, waardoor het uiteinde van de katheterplug bloot blijft.
- Sluit de anesthesielijn aan op de anesthesieconnector op het stereotaxicframe(afbeelding 2a)en bevestig de dierenkop in het frame door de mond op de bijtstang te plaatsen en door de oorbalken in beide gehoorgangen te leiden en vervolgens de ingestelde schroeven vast te draaien. Zorg ervoor dat het hoofd van de dieren stevig en vlak is.
- Verplaats het dier in het MRI-bed en sluit de anesthesielijn aan op de neuskegel. In dit protocol werd een 9,4 T mri van kleine boringen gebruikt.
- Verzamel coronale en axiale T2-gewogen beelden die zowel de hele hersenen als de MRI-fiduciale (figuur 2b) vastleggen voor coördinatenmetingen. Geef de lokale MRI-fysicus of tech de volgende informatie zodat ze het MRI-protocol kunnen bouwen.
- Gebruik voor coronale afbeeldingen (afbeelding 2b boven) de volgende parameters: aantal afbeeldingen: 27, breedte: 62,2 mm, hoogte: 62,2 mm, diepte: 37,97 mm, Voxel-formaat: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
- Gebruik voor axiale afbeeldingen (figuur 2b onder) de volgende parameters: aantal afbeeldingen: 13, Breedte: 61,47 mm, Hoogte: 53,81 mm, Diepte: 16,7 mm, Voxel-formaat: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
OPMERKING: Het is niet nodig om deze exacte parameters te hebben, zolang de coronale in vliegtuigresolutie bijna 0,25 mm is en de beelden de hele hersenen en fib induceel bedekken.
- Verzamel coördinatenmetingen van de bovenstaande beelden door de afstand van de MRI-fiduciale tot het hersengebied vast te leggen die met FUS zal worden gericht.
- Bij de scanner, op de coronale beelden verzameld in stap 3.5, vindt u het beeld waarin de fiducial de grootste is, wat het centrum van de fiducial aangeeft. Noteer de afstand van de bovenkant van de fiducial tot het hersengebied dat van belang is voor mm (de MRI-software heeft een schaal- of puntmeetinstrument, raadpleeg lokale MRI-technologie of fysicus over hoe dit te doen) in zowel de mediale / laterale richting als in de dorsale ventrale richting(figuur 2b,boven).
- Bij de scanner, op de axiale beelden verzameld in stap 3.5, vindt u de afbeelding die de bovenkant van de fiducial toont en meet u de afstand van het centrum van de fiducial tot het doelbreingebied in zowel de dorsale/ ventrale richting als in de mediale / laterale richting(figuur 2b, onder).
- Vergelijk de twee mediale/laterale metingen en als ze verschillend zijn, gebruik dan het gemiddelde. Deze coördinatenmetingen worden later in stap 4.3 gebruikt om het FUS-brandpunt met de XYZ-positioner naar het doelhersengebied te leiden.
- Verzamel MRI-prescanbeelden. Vergelijk deze afbeeldingen met de beelden die zijn verzameld na het openen van FUS BBB (figuur 4). T1-gewogen beelden zullen later worden gebruikt om BBB-opening te visualiseren, T2-gewogen beelden zullen later worden gebruikt om ervoor te zorgen dat er geen weefselschade is opgetreden na FUS-behandeling34.
- Gebruik voor T1-gewogen axiale afbeeldingen de volgende parameters: breedte: 30 mm, hoogte: 51,2 mm, diepte: 3,0 mm, voxelgrootte: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, aantal afbeeldingen: 13.
- Gebruik voor T2-gewogen axiale afbeeldingen de volgende parameters: breedte: 30 mm, hoogte: 51,2 mm, diepte: 2,6 mm, voxelgrootte: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, aantal afbeeldingen: 13.
- Gebruik voor T1-gewogen coronale afbeeldingen de volgende parameters: breedte: 30 mm, hoogte: 30 mm, diepte: 27 mm, voxelgrootte: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, aantal afbeeldingen: 27.
- Gebruik voor T2-gewogen coronale afbeeldingen de volgende parameters: breedte: 30 mm, hoogte: 30 mm, diepte: 27 mm, voxelgrootte: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, aantal afbeeldingen: 27.
OPMERKING: Net als in stap 3.5 hoeven deze beeldparameters niet exact hetzelfde te zijn als vermeld. Deze afbeeldingen hebben een kleinere FOV en een hogere resolutie dan die verzameld in stap 3.5.
- Houd het dier in het stereotaxicframe en transporteer het dier snel van het MRI-bed naar de FUS-opstelling op het bankje. Zorg ervoor dat het dier in slaap blijft voor de overdracht onder invloed van anesthesie.
- Gebruik voor langere overdrachtstijden een doos voor overdracht die groot genoeg is om het dier en het frame te passen. Als de anesthesieplug nog steeds is bevestigd, plaatst u het dier en het frame in de doos en laat u het overtollige isofluraan de doos een paar minuten vullen. Haal de stekker uit het stopcontact en breng snel over.
4. Gerichte echografieprocedure
- Bij aankomst op de FUS benchtop setup, sluit onmiddellijk de anesthesie lijn in de neuskegel en blijven lopen 1,5-3% isofluraan met zuurstof. Doe dit zo snel mogelijk om te voorkomen dat het dier wakker wordt.
- Schuif het frame in de framehouder en klik het stevig vast. Gebruik tondeuses om het hoofd van het dier te scheren. Borstel overtollig haar weg en breng haarverwijderaarcrème aan op de hoofdhuid. Laat 3 minuten zitten en veeg weg met water en gaas.
- Als MRI niet beschikbaar is voor targeting, gebruik dan een standaard (niet 3D-geprint) stereotactisch frame om de aanwijzerpositie teniet te doen aan bregma door de aanwijzertip aan te raken op bregma (hiervoor is een hoofdhuidincisie nodig) en de software te vernietigen of de coördinaten vast te nemen. Beweeg de XYZ-slede 50 mm omhoog door op de 50-knop omhoog in de software te klikken en de aanwijzer voor de transducer te verwisselen. Op basis van een rattenhersenatlas zoals eerderbeschreven 35, ga naar de gewenste hersencoördinaten met behulp van de stapknoppen in de software. Als u deze methode gebruikt in plaats van MRI, gaat u naar rubriek 4.6.
- Als u MRI-geleiding gebruikt, bevestigt u de aanwijzer en verplaatst u de aanwijzer naar de locatie van de MRI-fiduciale (figuur 1d,g). Plaats de aanwijzer helemaal bovenaan en in het midden van de MRI-fiduciale (een klein gaatje in de bovenkant van de fiduciale houder is voorzien voor het wijzen). Klik op de null-positieknop, het punt van waaruit alle afstanden in het MRI-beeld zijn berekend.
- Verwijder de aanwijzer en verplaats de positioner naar de mediale/laterale coördinaten en de rostral/caudale coördinaten. Verhoog de positioner omhoog door op de 50-knop omhoog te drukken om de plaatsing van het waterbad en de ultrasone gel mogelijk te maken. Als de bovenkant van de Z-asreis wordt bereikt, wordt de nullinglocatie ongeldig gemaakt. De dorsale/ventrale coördinaat wordt ingesteld nadat de transducer is toegevoegd.
- Breng ultrasone gel aan op de hoofdhuid van het dier en plaats het waterbad over het dier met het polyimidetapevenster op de gel gedrukt. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de ultrasone gel zitten.
- Vul het waterbad met ontgast water.
- Als u de krachtige transducer gebruikt, laat u de positioner zakken zodat de magneet zich net boven het water bevindt. Bevestig de transducer aan de positioner door de transducer voorzichtig schuin in het water te laten zakken om te voorkomen dat luchtbellen onder het gezicht vast komen te zitten en de magneten aan te sluiten.
- Als u de laagvermogensonderdompelingstransducer gebruikt, laat u de positioner in het water net boven de transducerclip zakken. Clip vervolgens de transducer op zijn plaats door deze langzaam onder een hoek in het water te laten zakken om te voorkomen dat luchtbellen onder het gezicht vast komen te zitten.
OPMERKING: Een transparant bad is handig bij het kijken onder het transducergezicht naar bubbels. - Verlaag de positioner naar de dorsale/ventrale coördinaat.
- Schakel de RF-eindversterker in.
- Injecteer 1 ml/kg 3% Evans blauwe kleurstof (EBD) door de naaldpunt in de katheterplug te steken en te injecteren. Laat het 5 minuten circuleren.
- Activeer de microbubbles door ze hevig te schudden met de met de bubble shaker.
- Bereid 5x de dosis van 30 μL/kg microbubbles (bubble conc. 1,2 x 1010/ml) in 0,2 ml zoutoplossing om rekening te houden met de 2 FUS-behandelingen en de slang in de 18 G gevleugelde infusieset. Als de rat bijvoorbeeld 200 g weegt, vul dan de spuit met 18 G naaldpunt met 30 μL microbubbles in 1 ml zoutoplossing.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u 18 G naaldpunten gebruikt voor zowel het gebruik als het injecteren met de gevleugelde infusieset. - Keer de spuit meerdere keren om om een uniforme verdeling van microbubbels te krijgen. Bevestig en vul vervolgens de gevleugelde infusieset. Plaats de spuit op de infuuspomp en stel de infuuspomp in op 0,2 ml met een snelheid van 6 ml/h. Dit zorgt voor een langzame infusie van de microbubbles gedurende de 2-min FUS blootstelling.
- Steek de gevleugelde naald in de katheterplug.
- Bereid 5x de dosis van 30 μL/kg microbubbles (bubble conc. 1,2 x 1010/ml) in 0,2 ml zoutoplossing om rekening te houden met de 2 FUS-behandelingen en de slang in de 18 G gevleugelde infusieset. Als de rat bijvoorbeeld 200 g weegt, vul dan de spuit met 18 G naaldpunt met 30 μL microbubbles in 1 ml zoutoplossing.
- Voer eerst de infuuspomp uit, wacht 3 s en start de FUS-behandeling door op de uitgangsknop op de functiegenerator te drukken (gelabeld "op" op de functiegenerator in de materialentabel). Herhaal deze twee keer per regio met 5 minuten ertussen om de microbubbles te laten wissen.
- Druk nogmaals op de aan-knop op de functiegenerator om de FUS-behandeling te stoppen wanneer de infuuspomp na 2 minuten stopt.
- Wacht 5 minuten tot de microbubbles zijn gewist. Start vervolgens de infusie en de tweede FUS-behandeling.
- Injecteer onmiddellijk na de tweede FUS-behandeling gadobutrolcontrast (bij gebruik van MRI) en het agent van belang, bijvoorbeeld virale deeltjes. Het totale geleverde volume van alle agentia mag niet meer dan 5 ml/kg bedragen.
OPMERKING: Het tijdstip van levering (bijv. voor of na de opening van FUS BBB) van de belangenbehartige kan verschillen, afhankelijk van de gebruikte agent.
- Schakel de RF-eindversterker uit en breng het dier onmiddellijk terug naar de MRI.
5. MRI-bevestiging van BBB-opening
- Als MRI niet beschikbaar is, gaat u naar rubriek 6 en gebruikt u ebd-expressie voor bevestiging van de opening van de BBB.
- Plaats het dier terug op het MRI-bed op exact dezelfde locatie als in stap 3.7 en sluit de anesthesielijn aan.
- Verzamel de MRI-postscans met dezelfde beeldvormingsparameters die in stap 3.7 worden gebruikt om de verbetering van de MRI van gadobutrol in het gebied van BBB-opening te visualiseren (figuur 3b,e).
6. Perfusie en weefselverzameling
- Perfuse het dier met koude 4% formaline totdat het bloed volledig helder is.
- Verwijder de hersenen en plaats in 4% formaline of PFA bij 4 °C 's nachts. Plaats vervolgens de hersenen in 30% sucrose-oplossing totdat de hersenen zinken (ongeveer 2-3 dagen). Tot slot, flash bevriezen in vloeibare stikstof of op droogijs en bewaren bij -80 °C tot cryosectioning.
- Bevries de hersenen in OCT en neem cryosections.
- Fix en coverslip secties voor fluorescentie microscopie. EBD-excitatiepieken bij 470 en 540 nm en emissiepieken bij 680 nm. Coverslip met DAPI-montagemedium om de algehele cellulaire morfologie te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier tonen we aan dat gerichte echografie met microbubbles gelokaliseerde BBB-opening kan induceren met behulp van de hierboven gespecificeerde parameters met zowel de low-power immersietransducer (figuur 3) als de FUS-transducer(figuur 4). Ten eerste werd in vroege experimenten de laagvermogensonderdompelingstransducer gericht op één hersenhelft , ofwel voorste (figuur 3b) of mediaal (figuur 3a). Dieren werden vervolgens 2 uur later geofferd met perfusie (figuur 3a) of zonder perfusie (figuur 3b) en 10 μm bevroren hersensecties werden verzameld. FUS BBB opening werd duidelijk door EBD autofluorescentie (excitatie: 470 en 540 nm, emissie: 680 nm) in de doelhelft (witte pijlen figuur 3a en 3b).
We hebben ontdekt dat het het beste is om de dieren te perfuseren voor een duidelijke visualisatie van BBB-opening met EBD-autofluorescentie. BBB-opening kan echter nog steeds worden gevisualiseerd zonder de bloedvaten te verwijderen (figuur 3b). Cellulaire opname en klaring van EBD na BBB opening begint zodra 30 minuten na BBB opening en neemt toe over 24 uur37. Voor de evaluatie van BBB-opening met EBD-autofluorescentie is het het beste om het dier op te offeren tussen 15 minuten en 3 uur BBB-opening. Maar uiteindelijk zal de tijd van opoffering afhangen van de agent die werd afgeleverd. In een AAV-onderzoek kan bijvoorbeeld 3 weken na de opening van de BBB en de levering van de AAV (figuur 5c) aangewezen zijn.
In latere experimenten werd de FUS-transducer gericht op de hippocampus (figuur 4a-c) of de anterieur cingulate cortex (ACC) (figuur 4 d-f) en naast EBD werd het MRI-contrastmiddel gadobutrol (0,1 ml/kg) iv geïnjecteerd om de gerichte opening van de BBB in vivo te verifiëren. Figuur 4b,e tonen verbeterd MRI-contrast waarbij het gadobutrolcontrast 1 uur na de opening van de BBB in het weefsel is gekomen en injectie met contrastmiddel. Deze contrastverandering is duidelijk in vergelijking met de MRI-prescans die vóór de FUS-procedure zijn gemaakt (figuur 4a,d). Dieren werden vervolgens geofferd door perfusie 1,5 uur na de opening van de BBB en 10 μm cryosections werden verzameld. Ebd autofluorescentie is duidelijk in FUS gerichte regio's verder wijzend op de locatie van BBB opening (Figuur 4c,f). Deze figuur laat zien hoe MRI-contrast soms moeilijk te zien is (zoals in het verschil tussen figuur 4b en figuur 4e); daarom is het nuttig om BBB-opening te bevestigen met visualisatie van EBD-autofluorescentie zoals in de fluorescentiemicrograaf in figuur 4f.
Om te beoordelen of deze techniek kon worden gebruikt voor de gerichte genafgifte werden AAV9-hsyn-GFP en gadobutrolcontrast geïnjecteerd IV (titer: 1,32 x 1014 GC/ml, 0,05 ml/kg) onmiddellijk na BBB-opening in de hippocampus. Het dier werd vervolgens 30 minuten na de opening van de BBB in beeld gebracht en 3 weken later geofferd door perfusie. 10 μm cryosections werden verzameld voor fluorescerende beeldvorming van GFP-expressie. BBB opening was duidelijk door gadobutrol contrast in de doel hippocampus (Figuur 5a,b). Bovendien werd de genafgifte bevestigd door de GFP-expressie in de doel hippocampus, duidelijk door groene fluorescentie (figuur 5c). Merk op dat ebd op dit moment is opgeklaard en alleen zichtbaar is in de ventrikels (figuur 5c).
Figuur 1: FUS benchtop setup. (a) FUS setup inclusief de XYZ positioner, een PVC buis met een diameter van 30 mm voor bevestiging van de transducer, het 3D-geprinte stereotaxic frame en de infuuspomp. (b) Het uiteinde van de PVC-buis is afgetopt en er is een magneet aan bevestigd met epoxy. (c) Een andere bijpassende magneet is bevestigd aan het bovenste midden van de high-power transducer met epoxy. (d) Daarnaast is er nog een bijpassende magneet aan de aanwijzer bevestigd voor het tenietdoen van de positioner aan de boven- en midden van de MRI-fiduciale. (e) De aanwijzer wordt uiteindelijk vervangen door de krachtige transducer en een waterbad wordt gekoppeld aan het hoofd van het dier met ultrasone gel. (f) De low-power onderdompelingstransducer kan met de 3D-geprinte transducerclip aan de PVC-buis worden bevestigd. (g) Voor de positionering wordt de transducer vervangen door de 3D-geprinte aanwijzer en wordt de positioner aan de boven- en midden van de MRI-fiducie tenietgedaan. (h) De stationaire 3D-geprinte framehouder zorgt ervoor dat het dier na MRI weer op dezelfde positie kan worden gebracht als er meerdere FUS-behandelingen nodig zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stereotaxic frame met MRI fiducial voor MRI-geleide coördinaten. (a) Dieren worden voor het eerst geplaatst in een 3D-geprint stereotaxicframe dat is uitgerust met een MRI-fiducie. (b) Het frame wordt vervolgens in het MRI-bed geplaatst en de afstand van de fiduciale (gestippelde cirkel) tot het doelbreingebied wordt gemeten met behulp van zowel coronale beelden voor de dorsale/ventrale (D/V) metingen als axiale beelden voor de rostral/caudale (R/C) metingen, mediale/laterale (M/L) meting kan worden verzameld uit beide assen. Dieren worden in het frame gehouden en overgebracht naar het FUS-station waar een aanwijzer wordt gebruikt om de XYZ-positioner op de locatie van de fiducial te nullen. De aanwijzer wordt vervolgens vervangen door de transducer en kan vervolgens worden verplaatst op basis van de verzamelde coördinaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Evans blue dye (EBD) bevestigt FUS BBB opening zowel met als zonder perfusie. (a) Micrograaf van een hersensectie van 10 μm 2 uur na opening van FUS BBB met de laagvermogensonderdompelingstransducer gericht op de mediale linkerhersenhelft. Dit is een representatief beeld van een dier dat voorafgaand aan weefselverzameling werd doordrenkt met 4% gebufferd formaline. BBB-opening wordt duidelijk door EBD rode autofluorescentie (pijl). (b) Micrograaf van een hersensectie van 10 μm 2 uur na de opening van FUS BBB gericht op de voorste linkerhersenhelft. Dit is een representatief beeld van een dier dat niet is doordrongd voorafgaand aan weefselverzameling, daarom blijft EBD in de bloedvaten. BBB opening is duidelijk waar EBD uit de bloedvaten is gelekt (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: FUS BBB opening bevestigd met Gadobutrol MRI contrast en EBD expressie. MR-beelden vóór (a en d) en na (b en e) BBB opening. gadobutrol contrastverbetering bevestigt locatie van BBB opening in vivo(b en e, pijlen). (c) 10 μm hersensectie met verdere bevestiging van BBB-opening met EBD-autofluorescentie (rood) in de hippocampus (blauwe DAPI-kernvlek). Schaalbalk; 500 μm. (f) Micrograaf van een hersensectie van 10 μm na BBB-opening in de voorste cingulate cortex, duidelijk door EBD rode autofluorescentie (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gelokaliseerde levering van AAV9-hsyn-GFP aan de hippocampus via FUS BBB opening. MRI-bevestiging van BBB-opening met MRI-contrastmiddel, MRI-contrast (pijlen) in zowel coronale (a) als axiale (b) T1-gewogen beelden. (c) histologische bevestiging van de GFP-expressie in de FUS-gerichte hippocampus (groen) 3 weken na de opening van FUS BBB en de AAV9-hsyn-GFP IV-injectie. Blauw geeft DAPI nucleaire vlek voor algehele cellulaire morfologie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven we een benchtop-benadering van microbubble-ondersteunde FUS BBB-opening met alternatieve benaderingen, waaronder twee verschillende transducers en methoden voor intracraniële targeting met en zonder MRI-begeleiding. Momenteel is er, om MRI-geleide FUS BBB-opening in het lab tot stand te brengen, de mogelijkheid om uitstekende kant-en-klare apparaten aan te schaffen die zeer gestandaardiseerde en reproduceerbare resultaten bieden met gebruiksvriendelijke interfaces. Veel laboratoria zijn echter niet voorbereid op de kosten van dergelijke instrumenten. Daarom is het belangrijkste doel van dit protocol om een startpunt te bieden dat elk lab zou kunnen vaststellen om hun expertise in de techniek op te bouwen.
FUS BBB-opening is nu een veel gebruikte techniek en het is vaak het geval dat verschillende groepen een verscheidenheid aan middelen en anesthetica gebruiken, die elk de mate van BBB-opening en extravasatie kunnen beïnvloeden. Belangrijk is dat de gebruikte specifieke verdoving van invloed kan zijn op de omvang van de BBB-opening, dus het is belangrijk om hier rekening mee te houden bij de uitvoering van dit protocol38. Hier wordt het verdovende isofluraan gebruikt omdat dieren gedurende de lengte van het protocol onder isofluraan kunnen worden gehouden en de niveaus van isofluraangas gemakkelijk kunnen worden aangepast op basis van de ademhalingsfrequentie en hartslag van het dier. Daarnaast leverden we isofluraan met zuurstof omdat het toegankelijker was dan medische lucht; medische lucht kan echter uitgebreidere BBB-opening39toestaan. Sommige MRI-contrastmiddelen zijn geschikter voor dit protocol dan andere. Bijvoorbeeld, in onze handen, gadoteridol produceerde geen contrastverbetering, zelfs wanneer EBD lekkage duidelijk aanwezig was in weefsel postmortem. Microbubble formulering is ook belangrijk. Hier gebruiken we perflutren lipide microsferen. Andere microbubbelformuleringen zoals perflutren eiwit-type A microbubbles zijn direct beschikbaar, maar het type microbubble dat wordt gebruikt, heeft invloed op de resultaten15.
De bedieningselementen van functiegeneratoren kunnen behoorlijk variëren, dus raadpleeg de handleiding voor instructies over het invoeren van de instellingen in stap 1. De juiste commandospanning (V-piek tot piek op de functiegenerator) hangt sterk af van de transducereigenschappen, RF-versterkerwinst, RF-versterker tot transducermatching, de leeftijd en grootte van het dier, het microbubbletype en de gewenste concentratie en het gewenste behandelingseffect. De piek naar piek V moet met vallen en opstaan worden bepaald. Begin met de instellingen die in stap 1 worden voorgesteld en bepaal het effect histologisch. Als er weefselschade is, verlaag dan de piek tot piek V met 10% en probeer het opnieuw. Evenzo, als er geen BBBO is, verhoog dan de piek naar piek V met 10% en probeer het opnieuw. Als u een te hoge V instelt, kan dit de laagvermogensonderdompelingstransducer beschadigen. Dit zal blijken als een scheuring of vervorming van het transducervlak. De doorlooptijden van de productie op transducers kunnen lang zijn, dus bij het starten raden we aan om meer dan één transducer als back-up te kopen. Ultrasone transducers kunnen ook versterkers beschadigen als ze onjuist zijn afgestemd. Voor eenvoud en betrouwbaarheid raden we aan om een robuuste eindversterker te gebruiken die complexe belastingen kan aandrijven (zoals de RF-eindversterker in de materialentabel). Houd er rekening mee dat hoewel de krachtige transducer wordt geleverd met een bijpassend circuit, de laagvermogensonderdompelingstransducer dat niet doet. De voorgestelde RF-versterker kan het gereflecteerde vermogen van de slecht afgestemde transducer aan, maar sommige versterkers kunnen in deze configuratie beschadigd raken. Als stap 2.7 problematisch blijkt na het installeren van het stuurprogramma en de software, controleert u ook of de juiste seriële poort in de software is geselecteerd. Probeer vervolgens een andere seriële kabel. Als dat niet lukt, zoek dan lokale IT-ondersteuning.
Uit ervaring zal het oefenen en meerdere aanpassingen vergen om een strakke nauwkeurigheid in de targeting van hersenregio's te bereiken. Dit blijkt uit de verschillen tussen de eerste experimenten (figuur 3) en de meest recente experimenten (figuur 5). We begonnen de experimenten met behulp van een klassiek stereotaxic-frame en we nemen het hier als optie op als er geen toegang is tot een 3D-printer of als er geen toegang is tot MRI van knaagdieren. MRI-begeleiding met MRI-fiducialen en het meegeleverde 3D-printbare frame (of van een aangepast ontwerp) is echter de ideale methode. Ten eerste verklaart het individuele verschillen tussen dieren door coördinaten binnen het dier te verzamelen in plaats van te vertrouwen op een gemiddelde rattenhersenatlas. Bovendien maakt het gebruik van MRI bevestiging mogelijk van FUS-locatietargeting in vivo in plaats van te vertrouwen op ebd-expressie na de dood. Dit is belangrijk bij het leveren van middelen die mogelijk meer dan 24 uur nodig hebben om van kracht te worden, zoals AAV's (figuur 5). Ten slotte maakt de meegeleverde framehouder het mogelijk om het dier na MRI terug te brengen naar dezelfde positie om eventuele targetingfouten op te lossen of om FUS te herhalen na onvoldoende BBB-opening zonder de coördinaten opnieuw te hoeven doen. Het draagbare 3D-geprinte stereotaxic frame kan worden gebruikt in elke MRI met een heldere boring van 200 mm of breder.
Afhankelijk van de bloedvatverdeling op de doellocatie, schedeldikte40, de aanwezigheid van ventrikels en andere factoren kan de mate van BBB-opening variëren. Om deze reden bieden we een methode voor herhaalde targeting met het frame en de framehouder. De nauwkeurigheid van de targeting hangt sterk af van het op een consistente locatie houden van de transducerfocus met betrekking tot de targetingaanwijzer. De punt van deze aanwijzer moet de locatie in de ruimte van het midden van de transducerfocus aangeven wanneer de transducer aan de XYZ-positioner is bevestigd. Met de magneten kunnen de aanwijzer en transducer gemakkelijk worden verwisseld met behoud van deze coscalering. Het gat en het uitsteeksel in de magneten moeten zo precies mogelijk overeenkomen. Elke variabiliteit in dit verband vermindert de herhaalbaarheid van de FUS-focustargeting. Er zal echter een ruimtelijke verschuiving zijn tussen de aanwijzerpunt en de ultrasone focus. Zodra is bevestigd dat de offset consistent is, kan deze worden gecorrigeerd met behulp van de MR-beelden om het verschil in mm van de resulterende BBB-openingslocatie (locatie van MRI-contrast) en de beoogde doellocatie te berekenen. Dit verschil kan vervolgens worden meegerekend in de null-locatie. Nauwkeurigheid en herhaalbaarheid hebben ook veel baat bij het gebruik van dezelfde ultrasone frequentie en het gebruik van ratten van een vergelijkbare grootte en leeftijd in een bepaalde reeks experimenten. Ultrasone demping door de rattenhersenen en rattenschedel varieert met frequentie en schedelgrootte en schedeldikte varieert met de leeftijd. De schedel is ook een kleine holte met betrekking tot de ultrasone puls en de incidentecho interageert met reflecties in de schedel om een complex geluidsveld te produceren dat afhankelijk is van het weefsel, de schedel, de frequentie en de positie van de transducer40.
Zoals elders vermeld, is dit protocol bedoeld om een laag investeringsalternatief te bieden voor uitstekende MRI-compatibele commerciële oplossingen die al te koop zijn. Er zijn belangrijke beperkingen die voortvloeien uit het laag houden van de kosten. Er zijn ook beperkingen inherent aan de techniek gegeven natuurkunde en de huidige stand van de techniek. Opmerkelijk genoeg, ondanks deze beperkingen, en zoals blijkt uit de representatieve resultaten, kunnen we consistente levering van kleurstoffen, deeltjes en virussen aan de hippocampus van ratten bereiken met submillimeternauwkeurigheid. De belangrijkste beperkingen zijn dat (1) de vorm van de FUS-focus afhangt van het tussenliggende weefsel en vooral de vorm en dikte van de schedel{...}. De noodzaak om het dier uit de MRI te verwijderen om de FUS-behandeling uit te voeren, voorkomt realtime feedback over de lokalisatie en intensiteit van de FUS-focus. Zonder deze real-time feedback moeten verschillende experimenten worden uitgevoerd om de instelling voor elke combinatie van targetinglocatie te bevestigen. Zodra de instellingen zijn "ingebeld", hebben we een goede herhaalbaarheid gevonden. (2) Het XYZ-positionerings- en fiduciale systeem zoals geconstrueerd, hoewel nauwkeurig, biedt geen nauwkeurigheid in het coördinatenkader van de positioner van experiment tot experiment. De relatieve locaties van het XYZ-huis, de schedel van het knaagdier en het frame kunnen relatief ten opzichte van elkaar bewegen van experiment naar experiment. Dit wordt verdoevierd door gebruik te maken van een MRI-beeld voor targeting, een targeting pointer en fiducial met een bekende locatie in de ruimte ten opzichte van de FUS focus, zodat het MRI-coördinatensysteem parallel loopt aan het XYZ positioner systeem, door testbehandelingen te doen voorafgaand aan de set van echte behandelingen en door de hele procedure binnen één sessie uit te voeren, zodat het dier niet in het frame hoeft te worden geplaatst. Merk op dat, omdat er slechts één fiducial wordt gebruikt, framerotaties niet corrigeerbaar zijn, dus het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het frame vlak is ten opzichte van het MRI-bed en de boring. Samengevat geeft de aanwijzerlocatie niet de werkelijke FUS-focus aan, maar we hebben ontdekt dat de offset consistent is voor een bepaalde hersenlocatie, op voorwaarde dat de schedel niet roteert ten opzichte van de ultrasone transducer. Merk ook op dat een consistente timing van de levering van gadobutrol ten opzichte van de BBB-opening en de beeldvorming cruciaal is voor consistente resultaten, vooral als MRI-contrastverandering wordt gebruikt als proxy voor de hoeveelheid BBB-opening (zie 36).
We begonnen voor het eerst met de opening van FUS BBB in het lab met de hierboven beschreven low-power onderdompelingstransducer. We ontdekten dat het een betaalbare optie is om met deze techniek aan de slag te gaan. Het belangrijkste is dat aanpassing van dit protocol een niet-invasief alternatief kan bieden voor intracraniële stereotaxische chirurgie en preklinisch onderzoek dat met deze techniek wordt uitgevoerd, kan als zeer translationeel worden beschouwd vanwege het huidige gebruik van transcraniële FUS bij mensen30,32,41. Eenmaal gevestigd in een laboratorium, kan deze techniek worden gebruikt als een niet-invasief alternatief voor stereotaxische chirurgie. Zo transformeert u een strikt onderzoeksinstrument in een zeer translationeel instrument. Ons lab zal deze techniek gebruiken voor de MRI-geleide, gelokaliseerde levering van virussen en nanodeeltjes om nieuwe, niet-invasieve neuromodulatietechnieken te ontwikkelen die kunnen worden gebruikt bij vrij gedragende wakkere knaagdieren en niet-menselijke primaten. Het huidige werk richt zich op Designer Drugs Exclusief Ontworpen voor Designer Receptoren (DREADDs) en de sensibilisatie van neuronen tot lage doses van hoge energie deeltjes zoals röntgenstralen. Het lab werkt ook aan een nieuwe versie van dit protocol die kan worden uitgevoerd in een menselijke 3 T-scanner om de noodzaak om het dier tijdens de behandeling te verplaatsen te elimineren en om realtime targetingfeedback mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door een NSF EPSCoR Research Infrastructure grant aan Clemson University (1632881). Daarnaast werd dit onderzoek mede ondersteund door het Civitan International Research Center, Birmingham, AL. De auteurs erkennen dankbaar het gebruik van de diensten en faciliteiten van de Universiteit van Alabama bij Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. De auteurs erkennen Rajiv Chopra voor zijn steun en begeleiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
- Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
- Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
- Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
- Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
- Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
- Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
- Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
- Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
- Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
- Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
- Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
- Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
- Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
- Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
- Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
- Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
- Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
- Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
- Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
- Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
- Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
