Summary
Fokussierter Ultraschall mit Mikroblasenmitteln kann die Blut-Hirn-Schranke fokal und vorübergehend öffnen. Diese Technik wurde verwendet, um eine breite Palette von Agenten über die Blut-Hirn-Schranke zu liefern. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die lokalisierte Lieferung an das Nagetierhirn mit oder ohne MRT-Führung.
Abstract
Stereotaxic Chirurgie ist der Goldstandard für lokalisierte Medikamente und Gen-Lieferung an das Nagetier Gehirn. Diese Technik hat viele Vorteile gegenüber der systemischen Lieferung einschließlich präziser Lokalisierung auf eine Zielhirnregion und Reduzierung von Nebenwirkungen. Die stereotaxic-Chirurgie ist jedoch hochinvasiv, was ihre translationale Wirksamkeit einschränkt, lange Erholungszeiten erfordert und Herausforderungen bietet, wenn sie mehrere Hirnregionen ins Visier nimmt. Fokussierter Ultraschall (FUS) kann in Kombination mit zirkulierenden Mikroblasen verwendet werden, um die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in millimetergroßen Regionen vorübergehend zu öffnen. Dies ermöglicht die intrakranielle Lokalisierung systemisch gelieferter Agenten, die normalerweise nicht über die BBB verfügen können. Diese Technik bietet eine nichtinvasive Alternative zur stereotaxic-Chirurgie. Bislang ist diese Technik jedoch in neurowissenschaftlichen Laboratorien aufgrund des begrenzten Zugangs zu Geräten und standardisierten Methoden noch nicht weit verbreitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen Benchtop-Ansatz für die FUS BBB-Öffnung (BBBO) zu bieten, der erschwinglich und reproduzierbar ist und daher von jedem Labor problemlos übernommen werden kann.
Introduction
Trotz der vielen Entdeckungen in der grundlegenden Neurowissenschaft, die Anzahl der neu auftretenden Behandlungen für neuroentwicklungs- und neurodegenerative Erkrankungen bleibt relativ begrenzt1,2. Ein tieferes Verständnis der Gene, Moleküle und zellulären Schaltkreise, die an neurologischen Störungen beteiligt sind, hat vielversprechende Behandlungen vorgeschlagen, die beim Menschen mit aktuellen Techniken nicht realisierbar sind3. Effektive Behandlungen sind oft durch die Notwendigkeit begrenzt, gehirndurchdringlich und standortspezifisch4,5,6,7,8. Die bestehenden Methoden der lokalisierten Medikamentenabgabe in bestimmte Hirnregionen (z. B. Die Abgabe per Injektion oder Kanüle) sind jedoch invasiv und erfordern eine Öffnung im Schädel9. Die Invasivität dieser Operation verhindert die routinemäßige Verwendung der lokalisierten Lieferung in das menschliche Gehirn. Darüber hinaus sind Gewebeschäden und die daraus resultierenden Entzündungsreaktionen allgegenwärtige Konfounds für grundlegende und präklinische Studien, die auf intracerebrale Injektion10angewiesen sind. Die Fähigkeit, nicht-invasiv Agenten über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu liefern und sie auf bestimmte Hirnregionen zu zielen, könnte einen enormen Einfluss auf die Behandlung von neurologischen Störungen haben und gleichzeitig ein leistungsfähiges Prüfwerkzeug für die präklinische Forschung bieten.
Eine Methode des gezielten Transports über die BBB mit minimalen Gewebeschäden ist transkraniell fokussierter Ultraschall (FUS) zusammen mit Mikroblasen, um die BBB11,12,13,14,15,16fokal und vorübergehend zu öffnen. FUS BBB Eröffnung hat in jüngster Zeit Aufmerksamkeit für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, Schlaganfall und Gliom durch die Lokalisierung von Therapeutika auf Hirnregionen wie neurotrophe Faktoren17,18,19, Gentherapien20,21,22, Antikörper23, Neurotransmitter24, und Nanopartikel25,26,27,28,29. Mit seinem breiten Anwendungsspektrum und seiner nichtinvasiven Natur30,31ist die FUS BBB Öffnung eine ideale Alternative zu routinemäßigen stereotaxic intrakraniellen Injektionen. Darüber hinaus können aufgrund seiner aktuellen Anwendung beim Menschen30,32, präklinische Untersuchungen mit dieser Technik als hochgradig translational angesehen werden. Die Eröffnung der FUS BBB ist jedoch aufgrund mangelnder Zugänglichkeit noch keine weit verbreitete Technik in der Grundlagenforschung und präklinischen Forschung. Daher bieten wir ein detailliertes Protokoll für einen Benchtop-Ansatz zur Eröffnung von FUS BBB als Ausgangspunkt für Labore, die an der Etablierung dieser Technik interessiert sind.
Diese Studien wurden entweder mit einem hochleistungsluftgestützten FUS-spezifischen Ultraschallwandler oder einem mit geringer Leistung gedämpften fokussierten Ultraschall-Immerauchwandler durchgeführt. Die Messumformer wurden von einem HF-Leistungsverstärker für reaktive Lasten und einem Standard-Tischfunktionsgenerator angetrieben. Details zu diesen Artikeln finden Sie in der Tabelle der Materialien.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.
1. Fokussierte Ultraschall-Fahrgeräte-Setup
- Verwenden Sie 50 Ohm koaxiale BNC-Kabel, um (1) den Eingang des Ultraschallwandlers an den Ausgang des HF-Verstärkers und (2) den Eingang des HF-Verstärkers an den Ausgang des Funktionsgenerators anzuschließen.
- Stellen Sie den Funktionsgeneratormodus einmal pro Sekunde mit einem 1%-Betriebszyklus auf einen sinusförmigen Burst ein.
- Für den gedämpften 1 MHz Low-Power-Tauchwandler mit einem 0,8-Zoll-Brennweitenabstand, der mit einem 50 dB HF-Verstärker verwendet wird, stellen Sie die Starteinstellungen auf: 1 MHz Sinuswelle, 1 V Peak to Peak, 10k-Zyklus, 1 s Intervall (oder Periode).
- Für den luftgestützten 1,1 MHz Hochleistungswandler stellen Sie die Anfangseinstellungen auf: 1,1 MHz Sinuswelle, 50 mV Peak to Peak, 11k Zyklen, 1 s Intervall.
HINWEIS: Betreiben Sie die Messumformer nur dann, wenn sie unterGetaucht sind. Legen Sie keine Hand oder ein anderes Körperteil am Ultraschallfokus oder berühren Sie das Wandlergesicht während der Bedienung.
2. Fokussierte Ultraschall-Tisch-Setup
- 3D-Druck den stereotaxic Rahmen und den stereotaktischen Rahmenhalter.
- Schließen Sie den Messumformer mit einer Klemme an, die ein PVC-Rohr hält (Abbildung 1a). Schrauben Sie die Klemme auf den X-Achsenschlitten und verriegeln Sie sie mit einer Flügelmutter.
- Wenn Sie den Hochleistungs-Ultraschallwandler verwenden, befestigen Sie ihn mit einem abgestimmten Magnetpaar am PVC-Rohr. Stellen Sie sicher, dass ein Magnet ein Loch und der andere einen passenden Vorsprung hat. Schließen Sie den Boden des PVC-Rohrs und befestigen Sie einen der Magnete mit Epoxid daran (siehe Abbildung 1b).
- Befestigen Sie den zweiten Magneten mit Epoxid an der oberen Mitte des Hochleistungs-Ultraschallwandlers. Stellen Sie sicher, dass es sich in der Mitte des Messumformers befindet (Abbildung 1c).
- Wenn Sie den Hochleistungs-Ultraschallwandler verwenden, machen Sie einen Zeiger, um den XYZ-Positionierer zu nichtig zu machen. Die Spitze dieses Zeigers zeigt die Position im Raum des Mittelpunkts des Messumformers an, wenn der Ultraschallwandler am XYZ-Positionierer befestigt ist. Machen Sie einen Zeiger aus einem 18 G Nadelschnitt, der die Länge des Brennweiten des Messumformers plus die Dicke des Messumformers ist (Abbildung 1d).
- Tragen Sie Epoxid auf einen dritten Magneten auf (dieser Magnet paart sich auch mit dem PVC-Kappenmagneten) und befestigen Sie es an der Spitze des Zeigers. Der Zeiger kann dann an dem Magneten am PVC-Rohr für XYZ nulling befestigt werden (Abbildung 1d).
- Wenn Sie den Low-Power-Tauchaufnehmer verwenden, drucken Sie die Datei für den Zeiger und den Montageclip in 3D.
- Befestigen Sie den Stromabnehmer mit geringem Stromverbrauch am PVC-Rohr, indem Sie den Montageclip auf das PVC-Rohr schneiden und den Messumformer in den Ring einlegen (Abbildung 1f).
- Machen Sie ein Wasserbad, indem Sie Stücke aus Acrylfolie zusammenkleben, die in der Lage sein werden, auf dem Kopf des Tieres über dem stereotaktischen Rahmen zu ruhen (Abbildung 1e).
- Schneiden Sie eine Öffnung in den Boden des Bades, die etwa die Größe des Kopfes des Tieres ist. Bedecken Sie das Loch im Wasserbad mit einem Polyimidband.
HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass Wasser nicht um das Polyimidband ausläuft, da es das Fell der Ratte benetzen und Unterkühlung verursachen kann.
- Schneiden Sie eine Öffnung in den Boden des Bades, die etwa die Größe des Kopfes des Tieres ist. Bedecken Sie das Loch im Wasserbad mit einem Polyimidband.
- Machen Sie eine MRT-Fiducial, indem Sie eine dünnschalige Kunststoff- oder Glaskugel mit einem 4 mm Durchmesser dünnen Kunststoff oder Glaskugel mit einer MRT-sichtbaren Flüssigkeit (z. B. Vitamin E Öl) füllen und versiegeln. Legen Sie es in den MRT-Fiducial-Halter auf der rechten Seite des 3D-gedruckten stereotaxic-Rahmens (Abbildung 2a).
- Sichern Sie den 3D-gedruckten Rahmenhalter an einem guten Ort für die Tierpositionierung am XYZ-Positionierer fest. Schieben Sie die Lasche am rostralen Ende des Rahmenhalters in den passenden Kanal auf der Y-Achsenschiene und sichern Sie sie mit stellaturen Schrauben(Abbildung 1h,rote Pfeile).
- Um den XYZ-Positionierer zu fahren, installieren Sie den USB-zu-Seriell-Konverter auf einem Computer, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen und den Konverter anschließen. Installieren Sie die Laufzeitumgebung und die Motorcontroller-Software auf dem PC.
- Stellen Sie sicher, dass der richtige serielle Anschluss in der Software ausgewählt ist, indem Sie den USB-zu-Seriell-Konverter in der Dropdown-Steuerung für die Portauswahl auf dem Frontpanel der Controller-Software auswählen. Schließen Sie den USB-zu-Seriell-Konverter über ein 9-poliges serielles Crossover-Kabel (z. B. RS232-Nullmodemkabel) an die Schrittmotor-Controller-Box an.
- Führen Sie die Controller-Software aus, um zu testen, ob die Schrittmotoren unter Softwaresteuerung angetrieben werden können. Dieser Schritt kann die Unterstützung des lokalen IT-Supports erfordern.
3. Intrakranielles Targeting-Verfahren
HINWEIS: Männliche Sprague Dawley Ratten mit einem Gewicht von 250-350 g wurden für diese Experimente verwendet. Die Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und Ratten-Chow und wurden auf einem 12:12 h-Licht:Dunkel-Zyklus gepflegt.
- Setzen Sie das Tier unter Anästhesie (3% Isofluran mit Sauerstoff) und überprüfen Sie auf die fehlende Reaktion auf die Zehenprise. Legen Sie dann den Katheter wie unten beschrieben ein.
- Erwärmen Sie den Schwanz mit einer Lampe zu machen ist einfacher, die Vene zu treffen. Achten Sie darauf, das Tier nicht zu überhitzen oder den Schwanz zu verbrennen.
- Sobald das Tier schläft (reagiert nicht auf eine Zehenklemme), legen Sie den 24 G Schwanz Venenkatheter, der verwendet wird, um Mikroblasen, Evans blauer Farbstoff (EBD), Gadobutrol MRT Kontrast, wenn mit MRT, und das experimentelle Mittel von Interesse liefern. Sobald die Vene getroffen ist, wird Blut die Hülle füllen, langsam die innere Nadel entfernen, während die Hülle weiter in die Vene geschoben wird.
HINWEIS: Sehen Sie sich eine Anleitung wie Stuart und Schroeder33 an, wenn Sie zum ersten Mal die Rattenschwanzvene-Injektionen vornehmen. - Wenn es keinen Blutfluss gibt, bewegen Sie langsam die Katheterscheide aus der Vene, um zu testen, ob die Nadel durch die Vene gestochen haben könnte. Wenn Blut fließt, wenn der Katheter leicht zurückgezogen wird, dann ging zuerst Poke durch die Vene und die Katheterplatzierung muss an einer anderen Stelle am Schwanz neu gestartet werden, die rostral zum vorherigen Standort ist.
- Füllen Sie den Katheterstecker mit Einer Linie und schrauben Sie den Katheterstecker in das Ende des Katheteranschlusses, sobald sich der Port mit Blut gefüllt hat. Wickeln Sie das Laborband vorsichtig um den Katheter und den Schwanz, um es an Ort und Stelle zu halten. Beginnen Sie mit einem kleinen Stück an der Spitze und arbeiten Sie in kaudaler Richtung, so dass das Ende des Kathetersteckers freigelegt wird.
- Stecken Sie die Anästhesielinie an den Anästhesieanschluss am stereotaxic-Rahmen (Abbildung 2a) und fixieren Sie den Kopf des Tieres in den Rahmen, indem Sie den Mund auf die Bissstange legen und die Ohrstangen in beide Gehörgänge führen, und ziehen Sie dann die Stellschrauben fest. Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Tiere sicher und eben ist.
- Bewegen Sie das Tier in das MRT-Bett und verbinden Sie die Anästhesielinie mit dem Nasenkegel. In diesem Protokoll wurde eine 9,4 T Kleinbohrtier-MRT verwendet.
- Sammeln Sie koronale und axiale T2-gewichtete Bilder, die das gesamte Gehirn sowie die MRT-Fiducial (Abbildung 2b) für Koordinatenmessungen erfassen. Geben Sie dem lokalen MRT-Physiker oder Der Technologie die folgenden Informationen an, damit er das MRT-Protokoll erstellen kann.
- Für koronale Bilder(Abbildung 2b oben) verwenden Sie die folgenden Parameter: Anzahl der Bilder: 27, Breite: 62,2 mm, Höhe: 62,2 mm, Tiefe: 37,97 mm, Voxel-Größe: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
- Für axiale Bilder(Abbildung 2b unten) verwenden Sie die folgenden Parameter: Anzahl der Bilder: 13, Breite: 61,47 mm, Höhe: 53,81 mm, Tiefe: 16,7 mm, Voxel-Größe: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, diese genauen Parameter zu haben, solange die koronale in der Ebene Auflösung ist nahe 0,25 mm und die Bilder decken das gesamte Gehirn und Treuhand.
- Sammeln Sie Koordinatenmessungen aus den obigen Bildern, indem Sie den Abstand vom MRT-Fiducial zur Hirnregion aufzeichnen, die mit FUS anvisiert wird.
- Auf dem Scanner, auf den koronalen Bildern, die in Schritt 3.5 gesammelt wurden, finden Sie das Bild, in dem der Treuhandstand das größte ist, was auf die Mitte des Treuhandhandels hinweist. Zeichnen Sie den Abstand von der Spitze des Treuhandlandes zur Hirnregion von Interesse in mm auf (die MRT-Software wird über ein Skalen- oder Punktmesswerkzeug verfügen, die lokale MRT-Technologie oder den Physiker konsultieren, wie dies zu tun ist) sowohl in medialer/lateraler Richtung als auch in dorsaler ventraler Richtung(Abbildung 2b, oben).
- Auf den in Schritt 3.5 gesammelten axialen Bildern finden Sie auf den axialen Bildern, die in Schritt 3.5 gesammelt wurden, das Bild, das die Spitze des Treuhandwesens zeigt, und messen den Abstand vom Zentrum des Treuhandbereichs zum Zielhirnbereich sowohl in dorsaler/ventraler Richtung als auch in medialer/lateraler Richtung(Abbildung 2b, unten).
- Vergleichen Sie die beiden medialen/lateralen Messungen und verwenden Sie, wenn sie unterschiedlich sind, den Durchschnitt. Diese Koordinatenmessungen werden später in Schritt 4.3 verwendet, um den FUS-Brennpunkt mit dem XYZ-Positionierer zum Zielhirnbereich zu führen.
- Sammeln Sie MRT-Prescan-Bilder. Vergleichen Sie diese Bilder mit den Bildern, die nach der Eröffnung von FUS BBB gesammelt wurden (Abbildung 4). T1-gewichtete Bilder werden später verwendet, um BBB-Öffnung zu visualisieren, T2-gewichtete Bilder werden später verwendet, um sicherzustellen, dass nach der FUS-Behandlung keine Gewebeschäden aufgetreten sind34.
- Verwenden Sie für T1-gewichtete Axialbilder folgende Parameter: Breite: 30 mm, Höhe: 51,2 mm, Tiefe: 3,0 mm, Voxelgröße: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, Anzahl der Bilder: 13.
- Verwenden Sie für T2-gewichtete Axialbilder folgende Parameter: Breite: 30 mm, Höhe: 51,2 mm, Tiefe: 2,6 mm, Voxelgröße: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, Anzahl der Bilder: 13.
- Für T1-gewichtete koronale Bilder die folgenden Parameter verwenden: Breite: 30 mm, Höhe: 30 mm, Tiefe: 27 mm, Voxelgröße: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, Anzahl der Bilder: 27.
- Für T2-gewichtete koronale Bilder die folgenden Parameter verwenden: Breite: 30 mm, Höhe: 30 mm, Tiefe: 27 mm, Voxelgröße: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, Anzahl der Bilder: 27.
HINWEIS: Wie in Schritt 3.5 müssen diese Bildparameter nicht genau die gleichen sein wie aufgelistet. Diese Bilder haben eine kleinere FOV und eine höhere Auflösung als die in Schritt 3.5 gesammelten.
- Halten Sie das Tier im stereotaxic Rahmen, schnell transportieren Sie das Tier vom MRT-Bett auf die Banktop FUS-Setup. Stellen Sie sicher, dass das Tier für den Transfer unter der Wirkung der Anästhesie schläft.
- Für längere Transferzeiten verwenden Sie eine Box für die Übertragung, die groß genug ist, um das Tier und den Rahmen zu passen. Mit dem anästhesien Stecker noch befestigt, legen Sie das Tier und Rahmen in der Box und lassen Sie die überschüssige Isoflurane, um die Box für ein paar Minuten zu füllen. Ziehen Sie die Anästhesielinie ab und übertragen Sie sie schnell.
4. Fokussiertes Ultraschallverfahren
- Bei der Ankunft in der FUS-Tischeinrichtung, stecken Sie sofort die Anästhesielinie in den Nasenkegel und weiter laufen 1,5-3% Isofluran mit Sauerstoff. Tun Sie dies so schnell wie möglich, um das Aufwachen des Tieres zu vermeiden.
- Schieben Sie den Rahmen in den Rahmenhalter und schnappen Sie ihn fest ein. Verwenden Sie Clippers, um den Kopf des Tieres zu rasieren. Bürsten Sie überschüssiges Haar weg und tragen Sie Haarentferner Creme auf die Kopfhaut. 3 min sitzen lassen und mit Wasser und Gaze abwischen.
- Wenn MRT nicht für targeting verfügbar ist, verwenden Sie einen standardmäßigen (nicht 3D-gedruckten) stereotaktischen Rahmen, um die Zeigerposition zu bregma zu nicht zu nullen, indem Sie die Zeigerspitze zu Bregma berühren (dafür wird ein Kopfhautschnitt benötigt) und die Software für ungültig erklären oder die Koordinaten aufzeichnen. Bewegen Sie den XYZ-Wagen um 50 mm nach oben, indem Sie auf die Schaltfläche bis 50 in der Software klicken und den Zeiger gegen den Messumformer tauschen. Basierend auf einem Ratten-Gehirnatlas, wie zuvorbeschrieben 35, bewegen Sie sich zu den gewünschten Gehirnkoordinaten mit den Schritttasten in der Software. Wenn Sie diese Methode anstelle der MRT verwenden, fahren Sie mit Abschnitt 4.6 fort.
- Wenn Sie die MRT-Anleitung verwenden, fügen Sie den Zeiger an, und bewegen Sie den Zeiger an die Position des MRT-Fiducials (Abbildung 1d,g). Positionieren Sie den Zeiger ganz oben und in der Mitte des MRT-Fiducials (ein kleines Loch in der Oberseite des Treuhandhalters ist für das Zeigen vorgesehen). Klicken Sie auf die Nullposition-Schaltfläche, die der Punkt ist, von dem aus alle Entfernungen im MRT-Bild berechnet wurden.
- Entfernen Sie den Zeiger, und bewegen Sie den Positioner zu den medialen/lateralen Koordinaten und den rostralen/kaudalen Koordinaten. Heben Sie den Positionierer nach oben, indem Sie die Taste bis 50 drücken, um die Platzierung des Wasserbades und des Ultraschallgels zu ermöglichen. Wenn der obere Teil des Z-Achsen-Verfahrwegs erreicht ist, wird die Nullposition ungültig. Die dorsale/ventrale Koordinate wird nach dem Einschließen des Messumformers eingestellt.
- Tragen Sie Ultraschallgel auf die Kopfhaut des Tieres auf und legen Sie das Wasserbad über das Tier mit dem Polyimidbandfenster auf das Gel gedrückt. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Ultraschallgel befinden.
- Füllen Sie das Wasserbad mit entgastem Wasser.
- Wenn Sie den Hochleistungswandler verwenden, senken Sie den Positionierer, so dass sich der Magnet direkt über dem Wasser befindet. Befestigen Sie den Messumformer am Positionierer, indem Sie den Messumformer vorsichtig in einen Winkel ins Wasser senken, um zu verhindern, dass Luftblasen unter dem Gesicht gefangen werden und die Magnete anschließen.
- Wenn Sie den Low-Power-Tauchaufnehmer verwenden, senken Sie den Positionierer direkt über dem Messumformerclip ins Wasser. Schneiden Sie dann den Messumformer an Ort und Stelle, indem Sie ihn langsam in einem Winkel ins Wasser senken, um zu verhindern, dass Luftblasen unter dem Gesicht gefangen werden.
HINWEIS: Ein transparentes Bad ist hilfreich, wenn man unter dem Wandlergesicht nach Blasen sucht. - Senken Sie den Positionierer auf die dorsale/ventrale Koordinate.
- Schalten Sie den HF-Leistungsverstärker ein.
- Injizieren Sie 1 ml/kg 3% Evans Blaufarbstoff (EBD), indem Sie die Nadelspitze in den Katheterstecker stecken und injizieren. Lassen Sie es für 5 min zirkulieren.
- Aktivieren Sie die Mikroblasen, indem Sie sie heftig mit dem Blasenschüttler schütteln.
- Bereiten Sie 5x die Dosis von 30 l/kg Mikroblasen (Blase conc. 1,2 x 1010/ml) in 0,2 ml Saline vor, um die 2 FUS-Behandlungen und die Schläuche im 18 G geflügelten Infusionsset zu berücksichtigen. Wenn die Ratte beispielsweise 200 g wiegt, dann füllen Sie die Spritze mit 18 G Nadelspitze mit 30 l Mikroblasen in 1 ml Saline.
HINWEIS: Achten Sie darauf, 18 G Nadelspitzen für die Aufnahme und Injektion mit dem geflügelten Infusionsset zu verwenden. - Invertieren Sie die Spritze mehrmals, um eine gleichmäßige Verteilung von Mikroblasen zu erhalten. Dann befestigen und füllen Sie den geflügelten Infusionssatz. Positionieren Sie die Spritze auf der Infusionspumpe und stellen Sie die Infusionspumpe auf 0,2 ml bei einer Rate von 6 ml/h ein. Dies wird eine langsame Infusion der Mikroblasen über die 2-min FUS-Exposition ermöglichen.
- Setzen Sie die geflügelte Nadel in den Katheterstecker ein.
- Bereiten Sie 5x die Dosis von 30 l/kg Mikroblasen (Blase conc. 1,2 x 1010/ml) in 0,2 ml Saline vor, um die 2 FUS-Behandlungen und die Schläuche im 18 G geflügelten Infusionsset zu berücksichtigen. Wenn die Ratte beispielsweise 200 g wiegt, dann füllen Sie die Spritze mit 18 G Nadelspitze mit 30 l Mikroblasen in 1 ml Saline.
- Führen Sie zunächst die Infusionspumpe aus, warten Sie 3 s und starten Sie die FUS-Behandlung, indem Sie die Ausgangsaktivierungstaste am Funktionsgenerator drücken (mit der Bezeichnung "auf" auf dem Funktionsgenerator in der Tabelle der Materialien). Wiederholen Sie diese zwei Mal pro Region mit 5 min dazwischen, damit die Mikroblasen entfernt werden können.
- Drücken Sie die Ein-Taste erneut am Funktionsgenerator, um die FUS-Behandlung zu stoppen, wenn die Infusionspumpe nach 2 min stoppt.
- Warten Sie 5 min, bis die Mikroblasen zu löschen sind. Dann beginnen Sie die Infusion und die zweite FUS-Behandlung.
- Unmittelbar nach der zweiten FUS-Behandlung, injizieren Gadbutrol Kontrast (bei Verwendung von MRT) und das Erreger von Interesse, zum Beispiel, virale Partikel. Das Gesamtvolumen aller Mittel sollte 5 ml/kg nicht überschreiten.
HINWEIS: Der Zeitpunkt der Lieferung (z. B. vor oder nach der Eröffnung von FUS BBB) des Interessenvertreters kann je nach verwendetem Agenten variieren.
- Schalten Sie den HF-Leistungsverstärker aus und transportieren Sie das Tier sofort zurück zum MRT.
5. MRT-Bestätigung der BBB-Eröffnung
- Wenn keine MRT verfügbar ist, fahren Sie mit Abschnitt 6 fort, und verwenden Sie den EBD-Ausdruck, um die BBB-Öffnung zu bestätigen.
- Legen Sie das Tier wieder auf das MRT-Bett an der exakt gleichen Stelle wie in Schritt 3.7 und stecken Sie die Anästhesielinie ein.
- Sammeln Sie die MRT-Post-Scans mit den gleichen Bildgebungsparametern, die in Schritt 3.7 verwendet werden, um die Verbesserung der Gadobutrol-MRT im Bereich der BBB-Öffnung zu visualisieren (Abbildung 3b,e).
6. Perfusion und Gewebesammlung
- Durchdringen Sie das Tier mit kaltem 4% Formalin, bis das Blut völlig klar läuft.
- Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie in 4% Formalin oder PFA bei 4 °C über Nacht. Als nächstes legen Sie das Gehirn in 30% Saccharoselösung, bis das Gehirn sinkt (ca. 2-3 Tage). Schließlich in flüssigem Stickstoff oder auf Trockeneis einfrieren und bei -80°C bis zum Kryosektionen lagern.
- Einfrieren Sie das Gehirn in OCT und nehmen Sie Kryosektionen.
- Fix- und Coverslip-Abschnitte für die Fluoreszenzmikroskopie. EBD-Erregungsspitzen bei 470 und 540 nm und Emissionsspitzen bei 680 nm. Coverslip mit DAPI-Montagemedium, um die gesamte zelluläre Morphologie zu visualisieren.
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Representative Results
Hier zeigen wir, dass fokussierter Ultraschall mit Mikroblasen eine lokalisierte BBB-Öffnung mit den oben angegebenen Parametern sowohl mit dem Low-Power-Tauchwandler (Abbildung 3) als auch mit dem FUS-Wandler (Abbildung 4) induzieren kann. Zunächst wurde in frühen Experimenten der Low-Power-Tauchwandler auf eine Gehirnhälfte entweder anterior (Abbildung 3b) oder medial (Abbildung 3a) ausgerichtet. Die Tiere wurden dann 2 Stunden später mit Perfusion geopfert (Abbildung 3a) oder ohne Perfusion (Abbildung 3b) und 10 m gefrorene Hirnabschnitte wurden gesammelt. Die FUS BBB-Öffnung zeigte sich an der EBD-Autofluoreszenz (Erregung: 470 und 540 nm, Emission: 680 nm) in der Zielhalbkugel (weiße Pfeile Abbildung 3a und 3b).
Wir haben es am besten gefunden, die Tiere für eine klare Visualisierung der BBB-Öffnung mit EBD-Autofluoreszenz zu durchdringen. Die BBB-Öffnung kann jedoch noch visualisiert werden, ohne die Blutgefäße zu säubern (Abbildung 3b). Die zelluläre Aufnahme und Freigabe der EBD nach BBB-Öffnung beginnt bereits 30 Minuten nach BBB-Öffnung und erhöht sich über 24 Stunden37. Für die Bewertung der BBB-Öffnung mit EBD-Autofluoreszenz ist es am besten, das Tier zwischen 15 Minuten und 3 Stunden BBB-Öffnung zu opfern. Letztlich hängt die Zeit des Opfers jedoch vom Agenten ab, der geliefert wurde. In einer AAV-Studie können z. B. 3 Wochen nach der Eröffnung von BBB und die AAV-Lieferung (Abbildung 5c) angemessen sein.
In späteren Experimenten wurde der FUS-Wandler entweder auf den Hippocampus (Abbildung 4a-c) oder den vorderen cingulate cortex (ACC) (Abbildung 4 d-f) ausgerichtet und zusätzlich zu EBD wurde das MRT-Kontrastmittel Gadobutrol (0,1 ml/kg) IV injiziert, um die gezielte Öffnung des BBB in vivo zu überprüfen. Abbildung 4b,e zeigen verbesserten MRT-Kontrast, wo der Gadobutrol-Kontrast 1 Stunde nach BBB-Öffnung und Kontrastmittelinjektion in das Gewebe eingedrungen ist. Diese Kontraständerung zeigt sich im Vergleich zu den MRT-Vorscans, die vor dem FUS-Verfahren durchgeführt wurden (Abbildung 4a,d). Die Tiere wurden dann 1,5 Stunden nach bBB-Öffnung durch Perfusion geopfert und 10 m Kryosektionen gesammelt. Die EBD-Autofluoreszenz ist in FUS-Zielregionen deutlich, die den Standort der BBB-Öffnung weiter anzeigen (Abbildung 4c,f). Diese Abbildung zeigt, wie der MRT-Kontrast manchmal schwer zu erkennen ist (wie in der Differenz zwischen Abbildung 4b und Abbildung 4e); Daher ist es hilfreich, die BBB-Öffnung mit Visualisierung der EBD-Autofluoreszenz wie in der Fluoreszenzmikroskopie in Abbildung 4fzu bestätigen.
Um zu beurteilen, ob diese Technik für die gezielte Genabgabe verwendet werden könnte, wurden AAV9-hsyn-GFP und Gadobutrolkontrast IV (Titer: 1,32 x 1014 GC/ml, 0,05 ml/kg) unmittelbar nach BBB-Öffnung im Hippocampus injiziert. Das Tier wurde dann 30 Minuten nach BBB-Öffnung MR-Bild und 3 Wochen später durch Perfusion geopfert. Für die fluoreszierende Bildgebung der GFP-Expression wurden 10 m Kryosektionen gesammelt. BBB Öffnung wurde durch Gadobutrol Kontrast im Ziel Hippocampus offensichtlich (Abbildung 5a,b). Darüber hinaus wurde die Genabgabe durch GFP-Expression im Zielhippocampus bestätigt, die durch grüne Fluoreszenz sichtbar wird (Abbildung 5c). Beachten Sie, dass ebD zu diesem Zeitpunkt ausgeräumt ist und nur in den Ventrikeln sichtbar ist (Abbildung 5c).
Abbildung 1: FUS-Tischaufbau. (a) FUS-Setup mit XYZ-Positionierer, EINEM PVC-Rohr mit 30 mm Durchmesser zur Befestigung des Messumformers, des 3D-gedruckten Stereotaxi-Rahmens und der Infusionspumpe. (b) Das Ende des PVC-Rohres ist verkappt, und ein Magnet wird mit Epoxid befestigt. (c) An der oberen Mitte des Hochleistungswandlers ist ein weiterer passender Magnet mit Epoxid befestigt. (d) Darüber hinaus wird ein weiterer passender Magnet am Zeiger befestigt, um den Positionierer an der Ober- und Mitte des MRT-Fiducials zunichte zu machen. (e) Der Zeiger wird schließlich durch den Hochleistungswandler ersetzt und ein Wasserbad wird mit Ultraschallgel an den Kopf des Tieres gekoppelt. (f) Der Low-Power-Tauchwandler kann mit dem 3D-gedruckten Messumformerclip am PVC-Rohr befestigt werden. (g) Zur Positionierung wird der Messumformer durch den 3D-gedruckten Zeiger ersetzt und der Positionierer an der Oberseite und in der Mitte des MRT-Fiducials für null erklärt. (h) Der stationäre 3D-gedruckte Rahmenhalter ermöglicht es, das Tier nach der MRT an die gleiche Position zurückbringen zu lassen, wenn mehrere FUS-Behandlungen erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Stereotaxie-Rahmen mit MRT-Fiducial für MRT-geführte Koordinaten. (a) Tiere werden zuerst in einem 3D-gedruckten stereotaxic Rahmen positioniert, der mit einem MRT-Fiducial ausgestattet ist. (b) Der Rahmen wird dann innerhalb des MRT-Bettes platziert und der Abstand vom fiduzialen (gepunkteten Kreis) zum Zielhirnbereich wird mit beiden koronalen Bildern für die dorsalen/ventralen (D/V) Messungen und axialen Bildern für die rostralen/kaudalen (R/C) Messungen gemessen, medial/laterale (M/L) Messungen können von beiden Achsen erfasst werden. Die Tiere werden im Rahmen gehalten und zur FUS-Station gebracht, wo ein Zeiger verwendet wird, um den XYZ-Positionierer an der Position des Treuhandszustelles zu nicht igzulizieren. Der Zeiger wird dann durch den Messumformer ersetzt und kann dann basierend auf den gesammelten Koordinaten bewegt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Evans Blauer Farbstoff (EBD) bestätigt die Öffnung von FUS BBB sowohl mit als auch ohne Perfusion. (a) Mikrograph eines 10-m-Gehirnabschnitts 2 Stunden nach der Eröffnung von FUS BBB mit dem Stromabnehmer mit geringem Stromverbrauch, der auf die mediale linke Hemisphäre ausgerichtet ist. Dies ist ein repräsentatives Bild eines Tieres, das vor der Gewebeentnahme mit 4% gepuffertem Formalin durchdrungsbar war. Die BBB-Öffnung wird durch die rote Autofluoreszenz (Pfeil) der EBD deutlich. (b) Mikrograph eines 10-m-Gehirnabschnitts 2 Stunden nach der Eröffnung von FUS BBB, die auf die vordere linke Hemisphäre ausgerichtet ist. Dies ist ein repräsentatives Bild eines Tieres, das vor der Gewebeentnahme nicht durchdrungwart wurde, daher bleibt EBD in den Blutgefäßen. Die BBB-Öffnung ist offensichtlich, wenn EBD aus den Blutgefäßen (Pfeil) ausgetreten ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: FUS BBB Öffnung bestätigt mit Gadobutrol MRT Kontrast und EBD-Ausdruck. MR-Bilder vor (a und d) und nach (b und e) BBB-Öffnung. gadobutrol Kontrastverbesserung bestätigt Die Position der BBB Öffnung in vivo (b und e, Pfeile). (c) 10 m Hirnabschnitt mit weiterer Bestätigung der BBB-Öffnung mit EBD-Autofluoreszenz (rot) im Hippocampus (blauer DAPI-Kernfleck). Skalenbalken; 500 m (f) Mikrograph eines 10 m Gehirnabschnitts nach BBB-Öffnung im vorderen cingulate Cortex, der durch EBD rote Autofluoreszenz (Pfeil) sichtbar wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Lokalisierte Lieferung von AAV9-hsyn-GFP an den Hippocampus über FUS BBB-Öffnung. MRT-Bestätigung der BBB-Öffnung mit MRT-Kontrastmittel, MRT-Kontrast (Pfeile) in koronalen (a) und axialen (b) T1-gewichteten Bildern. (c) histologische Bestätigung der GFP-Expression im FUS-gezielten Hippocampus (grün) 3 Wochen nach der Eröffnung von FUS BBB und der AAV9-hsyn-GFP IV-Injektion. Blau zeigt DAPI-Kernfleck für die gesamte zelluläre Morphologie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier beschrieben wir einen Benchtop-Ansatz zur mikrobubbleunterstützten FUS BBB-Öffnung mit alternativen Ansätzen, einschließlich zweier verschiedener Messumformer und Methoden für intrakranielles Targeting mit und ohne MRT-Führung. Um die MRT-geführte FUS BBB-Öffnung im Labor zu etablieren, besteht derzeit die Möglichkeit, hervorragende gebrauchsfertige Geräte zu erwerben, die hochstandardisierte und reproduzierbare Ergebnisse mit benutzerfreundlichen Schnittstellen liefern. Viele Labore sind jedoch nicht auf die Kosten solcher Instrumente vorbereitet. Daher besteht das Hauptziel dieses Protokolls darin, einen Ausgangspunkt zu schaffen, den jedes Labor einrichten könnte, um sein Fachwissen in der Technik aufzubauen.
FUS BBB Öffnung ist jetzt eine weit verbreitete Technik und es ist oft der Fall, dass verschiedene Gruppen eine Vielzahl von Agenten und Anästhetika verwenden, von denen jede den Grad der BBB Öffnung und Extravasation beeinflussen kann. Wichtig ist, dass das verwendete Anästhetikum die Größe der BBB-Öffnung beeinflussen kann, daher ist es wichtig, dies bei der Ausführung dieses Protokolls38zu berücksichtigen. Hier bei der Anästhesie wird das Anästhetikum Isofluran verwendet, da Tiere für die Länge des Protokolls unter Isofluran gehalten werden können und der Gehalt an Isoflurangas leicht an die Atmungsrate und Herzfrequenz des Tieres angepasst werden kann. Darüber hinaus lieferten wir Isofluran mit Sauerstoff, weil es zugänglicher als medizinische Luft war; jedoch kann medizinische Luft eine umfangreichere BBB-Öffnung39ermöglichen. Einige MRT-Kontrastmittel sind für dieses Protokoll besser geeignet als andere. Zum Beispiel, in unseren Händen, gadoteridol produziert keine Kontrastverbesserung, auch wenn EBD Leckage war deutlich in Gewebe postmortem vorhanden. Microbubble Formulierung ist auch wichtig. Hier verwenden wir perflutren Lipid Mikrosphären. Andere Mikrobubble-Formulierungen wie Perflutren-Protein-Typ-A-Mikroblasen sind leicht verfügbar, aber die Art der verwendeten Mikrobubble wirkt sich auf die Ergebnisse15aus.
Die Steuerung von Funktionsgeneratoren kann sehr unterschiedlich sein, daher finden Sie im Handbuch Anweisungen zur Eingabe der in Schritt 1 aufgeführten Einstellungen. Die entsprechende Befehlsspannung (V Peak to Peak auf dem Funktionsgenerator) hängt stark von den Wandlereigenschaften, HF-Verstärkerverstärkung, HF-Verstärker zum Wandler-Matching, dem Alter und der Größe des Tieres, dem Mikroblasentyp und der Konzentration sowie dem gewünschten Behandlungseffekt ab. Der Peak bis Peak V muss durch Versuch und Irrtum bestimmt werden. Beginnen Sie mit den in Schritt 1 vorgeschlagenen Einstellungen und bestimmen Sie den Effekt histologisch. Wenn es Gewebeschäden gibt, senken Sie den Peak auf Peak V um 10% und versuchen Sie es erneut. Ebenso, wenn es keine BBBO dann erhöhen Sie die Spitze auf Spitzenwert V um 10% und versuchen Sie es erneut. Eine zu hohe Einstellung eines V kann den Einschaltrum mit geringer Leistung beschädigen. Dies wird als Riss oder Verzerrung der Wandlerfläche sichtbar sein. Die Produktionsdurchlaufzeiten auf Messumformern können lang sein, daher empfehlen wir beim Start, mehr als einen Messumformer als Backup zu kaufen. Ultraschallwandler können auch Verstärker beschädigen, wenn sie nicht richtig aufeinander abgestimmt sind. Für Einfachheit und Zuverlässigkeit empfehlen wir die Verwendung eines robusten Leistungsverstärkers, der komplexe Lasten (z. B. den HF-Leistungsverstärker in der Materialtabelle) antreiben kann. Beachten Sie, dass der Hochleistungswandler zwar mit einer passenden Schaltung kommt, der Einschalter mit geringer Leistung jedoch nicht. Der vorgeschlagene HF-Verstärker kann die reflektierte Leistung des schlecht abgestimmten Messumformers verarbeiten, aber einige Verstärker können in dieser Konfiguration beschädigt sein. Wenn sich Schritt 2.7 nach der Installation des Treibers und der Software als problematisch erweist, überprüfen Sie auch, ob die richtige serielle Schnittstelle in der Software ausgewählt ist. Versuchen Sie es als Nächstes mit einem anderen seriellen Kabel. Wenn dies fehlschlägt, suchen Sie nach lokalem IT-Support.
Aus Erfahrung wird es Praxis und mehrere Anpassungen erfordern, um eine enge Genauigkeit im Brain Region Targeting zu erreichen. Dies zeigt sich an den Unterschieden zwischen den frühen Experimenten (Abbildung 3) und den jüngsten Experimenten (Abbildung 5). Wir begannen die Experimente mit einem klassischen stereotaxic Rahmen und wir nehmen es als Option hier, wenn es keinen Zugang zu einem 3D-Drucker oder wenn es keinen Zugang zu Nagetier MRT. Die MRT-Führung mit MRT-Treuhändern und dem mitgelieferten 3D-Druckrahmen (oder in einem kundenspezifischen Design) ist jedoch die ideale Methode. Erstens berücksichtigt es individuelle Unterschiede zwischen Tieren, indem es Koordinaten innerhalb des Tieres sammelt, anstatt sich auf einen durchschnittlichen Rattenhirnatlas zu verlassen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von MRT die Bestätigung des FUS-Standort-Targetings in vivo, anstatt sich auf postmortale EBD-Expression zu verlassen. Dies ist wichtig, wenn Agenten geliefert werden, die möglicherweise mehr als 24 Stunden benötigen, um wirksam zu werden, z. B. AAVs (Abbildung 5). Schließlich ermöglicht der mitgelieferte Rahmenhalter die Rückgabe des Tieres an die gleiche Position nach der MRT, um Targeting-Fehler zu beheben oder FUS nach unzureichender BBB-Öffnung zu wiederholen, ohne die Koordinaten wiederholen zu müssen. Der tragbare 3D-gedruckte Stereotaxic-Rahmen kann in jeder MRT mit einer klaren Bohrung von 200 mm oder breiter verwendet werden.
Abhängig von der Blutgefäßverteilung in der Zielposition, Schädeldicke40, das Vorhandensein von Ventrikeln und anderen Faktoren kann der Grad der BBB-Öffnung variieren. Aus diesem Grund bieten wir eine Methode für wiederholtes Targeting mit dem Rahmen und Rahmenhalter. Die Genauigkeit des Targetings hängt entscheidend davon ab, dass der Messumformerfokus an einem konsistenten Ort in Bezug auf den Zielzeiger bleibt. Die Spitze dieses Zeigers sollte die Position im Raum des Mittelpunkts des Messumformers anzeigen, wenn der Messumformer an der XYZ-Positionierer befestigt ist. Die Magnete ermöglichen es, Zeiger und Messumformer leicht zu tauschen, während diese Kolokalisierung beibehalten wird. Das Loch und der Vorsprung in den Magneten sollten so genau wie möglich passen. Jede Variabilität in dieser Verbindung reduziert die Wiederholbarkeit des FUS-Fokus-Targetings. Es wird jedoch einen räumlichen Versatz zwischen der Zeigerspitze und dem Ultraschallfokus geben. Sobald bestätigt ist, dass der Offset konsistent ist, kann er korrigiert werden, indem die MR-Bilder verwendet werden, um die Differenz in mm der resultierenden BBB-Öffnungsposition (Position des MRT-Kontrasts) und der beabsichtigten Zielposition zu berechnen. Dieser Unterschied kann dann in die Nullposition eingerechnet werden. Genauigkeit und Wiederholbarkeit profitieren auch stark von der Verwendung der gleichen Ultraschallfrequenz und der Verwendung von Ratten ähnlicher Größe und Alter in einem bestimmten Satz von Experimenten. Die Ultraschalldämpfung durch das Gehirn der Ratte und den Schädel der Ratte variiert je nach Häufigkeit und Schädelgröße und Schädeldicke variiert je nach Alter. Der Schädel ist auch eine kleine Höhle in Bezug auf den Ultraschallpuls und der einfallende Ultraschall interagiert mit Reflexionen im Inneren des Schädels, um ein komplexes Klangfeld zu erzeugen, das von Gewebe, Schädel, Frequenz und der Position des Wandlers40abhängt.
Wie bereits an anderer Stelle erwähnt, soll dieses Protokoll eine kostengünstige Alternative zu exzellenten MRT-kompatiblen kommerziellen Lösungen bieten, die bereits zum Kauf verfügbar sind. Es gibt wichtige Einschränkungen, die sich daraus ergeben, dass die Kosten niedrig bleiben. Es gibt auch Einschränkungen, die der Technik der Physik und dem aktuellen Stand der Technik innewohnen. Bemerkenswerterweise können wir trotz dieser Einschränkungen und wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt, eine konsistente Lieferung von Farbstoffen, Partikeln und Viren an den Hippocampus von Ratten mit Submillimeter-Genauigkeit erreichen. Die wichtigsten Einschränkungen sind, dass (1) die Form des FUS-Fokus vom dazwischenliegenden Gewebe und insbesondere von der Form und Dicke des Schädels abhängt. Die Notwendigkeit, das Tier aus dem MRT zu entfernen, um die FUS-Behandlung durchzuführen, verhindert Echtzeit-Feedback über die Lokalisierung und Intensität des FUS-Fokus. Ohne dieses Echtzeit-Feedback müssen mehrere Experimente durchgeführt werden, um die Einstellung für jede Kombination von Zielort zu bestätigen. Sobald die Einstellungen "eingewählt" sind, haben wir eine gute Wiederholbarkeit gefunden. (2) Das XYZ-Positionierungs- und Treuhandsystem in seiner konstruierten, aber präzisen Weise liefert keine Genauigkeit im Koordinatenrahmen des Positionierers von Experiment zu Experiment. Die relativen Positionen des XYZ-Hauses, der Schädel des Nagers und der Rahmen können sich relativ zueinander von Experiment zu Experiment bewegen. Dies wird durch die Verwendung eines MRT-Bildes für das Targeting, einen Targeting-Zeiger und einen Fiducial mit bekannter Position im Raum relativ zum FUS-Fokus, die Sicherstellung, dass das MRT-Koordinatensystem parallel zum XYZ-Positionierersystem ist, durch Testbehandlungen vor dem Satz realer Behandlungen und durch das gesamte Verfahren innerhalb einer Sitzung, so dass das Tier nicht in den Rahmen neu positioniert werden muss, zu kompensieren. Beachten Sie, dass, da nur ein Treuhandwerk verwendet wird, Rahmendrehungen nicht berichtigbar sind, daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Rahmen in Bezug auf das MRT-Bett und die Bohrung eben ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Zeigerposition nicht den wahren FUS-Fokus anzeigt, aber wir haben festgestellt, dass der Offset für eine bestimmte Gehirnposition konsistent ist, vorausgesetzt, der Schädel rotiert nicht relativ zum Ultraschallwandler. Beachten Sie auch, dass ein konsistentes Timing der Gadobutrol-Lieferung im Vergleich zur BBB-Öffnung und der Bildgebung entscheidend für konsistente Ergebnisse ist, insbesondere wenn DIE MRT-Kontraständerung als Proxy für die Menge der BBB-Öffnung verwendet wird (siehe 36).
Wir begannen zuerst mit der Eröffnung von FUS BBB im Labor mit dem oben beschriebenen Low-Power-Tauchaufnehmer. Wir fanden heraus, dass es eine erschwingliche Option für den Einstieg mit dieser Technik ist. Am wichtigsten ist, dass die Anpassung dieses Protokolls eine nichtinvasive Alternative zur intrakraniellen stereotaxic-Chirurgie bieten kann und präklinische Forschung, die mit dieser Technik durchgeführt wird, aufgrund der aktuellen Verwendung von transkraniellem FUS beim Menschen als hochgradig translational angesehen werden kann30,32,41. Einmal in einem Labor etabliert, kann diese Technik als nichtinvasive Alternative zur stereotaxic-Chirurgie verwendet werden. So wird ein streng investigatives Werkzeug in ein hochtranslationales Werkzeug umgewandelt. Unser Labor wird diese Technik für die MRT-geführte, lokalisierte Lieferung von Viren und Nanopartikeln verwenden, um neuartige, nicht-invasive Neuromodulationstechniken zu entwickeln, die bei frei wachen Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten eingesetzt werden können. Die aktuelle Arbeit konzentriert sich auf Designer-Medikamente, die exklusiv für Designer-Rezeptoren (DREADDs) entwickelt wurden, und die Sensibilisierung von Neuronen für niedrige Dosen von hochenergetischen Partikeln wie Röntgenstrahlen. Das Labor arbeitet auch an einer neuen Version dieses Protokolls, die in einem menschlichen 3-T-Scanner durchgeführt werden kann, um die Notwendigkeit zu vermeiden, das Tier während der Behandlung zu bewegen und Um Echtzeit-Targeting-Feedback zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde teilweise durch ein NSF EPSCoR Research Infrastructure Stipendium an die Clemson University (1632881) unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Forschung teilweise vom Civitan International Research Center, Birmingham, AL unterstützt. Die Autoren danken der Nutzung der Dienste und Einrichtungen der University of Alabama in Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Die Autoren würdigen Rajiv Chopra für seine Unterstützung und Anleitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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