Summary
Fokuseret ultralyd med mikroboble midler kan åbne blodhjerne barrieren fokalt og forbigående. Denne teknik er blevet brugt til at levere en bred vifte af agenter på tværs af blodhjerne barrieren. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for den lokaliserede levering til gnaverhjernen med eller uden MR-vejledning.
Abstract
Stereotaxic kirurgi er guldstandarden for lokaliseret medicin og gen levering til gnaver hjernen. Denne teknik har mange fordele i forhold til systemisk levering, herunder præcis lokalisering til et mål hjerne region og reduktion af off target bivirkninger. Stereotaxisk kirurgi er imidlertid meget invasiv, hvilket begrænser dens translationelle effekt, kræver lange restitutionstider og giver udfordringer, når den målrettes mod flere hjerneområder. Fokuseret ultralyd (FUS) kan bruges i kombination med cirkulerende mikrobobler til forbigående at åbne blodhjernebarrieren (BBB) i millimeterstore regioner. Dette muliggør intrakraniel lokalisering af systemisk leverede agenter, der normalt ikke kan krydse BBB. Denne teknik giver et noninvasive alternativ til stereotaxic kirurgi. Til dato er denne teknik dog endnu ikke blevet udbredt i neurovidenskabslaboratorier på grund af den begrænsede adgang til udstyr og standardiserede metoder. Det overordnede mål med denne protokol er at give en bænktop tilgang til FUS BBB åbning (BBBO), der er overkommelig og reproducerbar og kan derfor let vedtages af ethvert laboratorium.
Introduction
På trods af de mange opdagelser i grundlæggende neurovidenskab forbliver antallet af nye behandlinger for neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative lidelser relativt begrænset1,2. En dybere forståelse af de gener, molekyler og cellulære kredsløb, der er involveret i neurologiske lidelser, har foreslået lovende behandlinger, der ikke kan realiseres hos mennesker med nuværende teknikker3. Effektive behandlinger er ofte begrænset af behovet for at være hjernepenetrable og stedsspecifikke4,5,6,7,8. Eksisterende metoder til lokaliseret lægemiddellevering til specifikke hjerneregioner (f.eks. levering via injektion eller kanyle) er imidlertid invasive og kræver en åbning, der skal foretages i kraniet9. Invasiviteten af denne operation forhindrer rutinemæssig brug af lokaliseret levering til den menneskelige hjerne. Derudover er vævsskader og de resulterende inflammatoriske reaktioner allestedsnærværende confounds for grundlæggende og prækliniske undersøgelser, der er afhængige af intracerebral injektion10. Evnen til ikke-invasivt at levere agenter på tværs af blodhjernebarrieren (BBB) og målrette dem mod specifikke hjerneregioner kan have en enorm indflydelse på behandlinger for neurologiske lidelser, samtidig med at det giver et kraftfuldt undersøgelsesværktøj til præklinisk forskning.
En metode til målrettet transport på tværs af BBB med minimal vævsskade er transkranial fokuseret ultralyd (FUS) sammen med mikrobobler til fokalt og forbigående åbne BBB11,12,13,14,15,16. FUS BBB åbning har fået den seneste opmærksomhed til behandling af neurodegenerative lidelser, slagtilfælde og gliom ved at lokalisere terapeutiske til at målrette hjernen regioner såsom neurotrofiske faktorer17,18,19, genterapier20,21,22, antistoffer23, neurotransmittere24, og nanopartikler25,26,27,28,29. Med sin brede vifte af applikationer og sin noninvasive natur30,31, FUS BBB åbning er et ideelt alternativ til rutinemæssige stereotaxic intrakranielle injektioner. På grund af sin nuværende anvendelse hos mennesker30,32, kan prækliniske undersøgelser ved hjælp af denne teknik betragtes som meget translationelle. Fus BBB-åbningen er dog endnu ikke en veletableret teknik inden for grundforskning og præklinisk forskning på grund af manglende tilgængelighed. Derfor leverer vi en detaljeret protokol for en bænktoptilgang til FUS BBB-åbning som udgangspunkt for laboratorier, der er interesseret i at etablere denne teknik.
Disse undersøgelser blev udført med enten en høj effekt luftstøttet FUS specifik ultralyd transducer eller en lav effekt dæmpet fokuseret ultralyd nedsænkning transducer. Transducerne blev drevet af en RF-effektforstærker designet til reaktive belastninger og en standard bænktopfunktionsgenerator. Nærmere oplysninger om disse varer findes i tabellen over materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer.
1. Fokuseret ultralyd køreudstyr setup
- Brug 50 Ohm koaksialE BNC-kabler til at forbinde (1) ultralydtransducerens indgang til RF-forstærkerens output og (2) RF-forstærkerens indgang til funktionsgeneratorens output.
- Indstil funktionsgeneratortilstanden til en sinusoid burst en gang i sekundet med en 1% arbejdscyklus.
- For den dæmpede 1 MHz laveffektdysningstransducer med en 0,8 tommer brændvidde, der bruges med en 50 dB RF-forstærker, skal du indstille startindstillingerne til: 1 MHz sinusbølge, 1 V-top til top, 10k cyklus, 1 s interval (eller periode).
- For luftstøttet, 1,1 MHz højeffekttransducer, skal du indstille de første indstillinger til: 1,1 MHz sinusbølge, 50 mV top til top, 11k cyklusser, 1 s interval.
BEMÆRK: Transducerne må ikke betjenes, medmindre de er nedsænket. Placer ikke en hånd eller anden kropsdel på ultralydsfokus eller rør transducerens ansigt, mens det fungerer.
2. Fokuseret ultralyd benchtop setup
- 3D-print den stereotaxiske ramme og den stereotaktiske rammeholder.
- Tilslut transduceren til XYZ-positionen ved hjælp af en klemme, der holder et PVC-rør (Figur 1a). Bolt klemmen på X-aksen dias og lås med en vinge møtrik.
- Hvis du bruger ultralydstransduceren med høj effekt, skal du fastgøre den til PVC-røret ved hjælp af et matchende par magneter. Sørg for, at den ene magnet har et hul, og den anden har et matchende fremspring. Hætten i bunden af PVC-røret og fastgør en af magneterne til den ved hjælp af epoxy (se figur 1b).
- Fastgør den anden magnet til toppen midten af high-power ultralyd transducer ved hjælp af epoxy. Sørg for, at det er i centrum af transduceren(Figur 1c).
- Hvis du bruger ultralydstransduceren med høj effekt, skal du lave en pointer til annullering af XYZ-positionen. Spidsen af denne pointer angiver placeringen i rummet af midten af transducerfokus, når ultralydtransduceren er fastgjort til XYZ-positionen. Lav en pointer ud af en 18 G nål skåret til at være længden af brændvidden af transduceren plus tykkelsen af transduceren (Figur 1d).
- Påfør epoxy på en tredje magnet (denne magnet parres også med PVC-hættemagneten) og fastgør den til toppen af markøren. Markøren vil derefter være i stand til at fastgøre til magneten på PVC-røret for XYZ-annullering (Figur 1d).
- Hvis du bruger transduceren til nedsat effekt, skal du 3D-udskrive filen til markøren og monteringsklippet.
- Vedhæft den energibesparende nedsænkningstransducer til PVC-røret ved at klippe monteringsklemmen på PVC-røret og indsætte transduceren i ringen (Figur 1f).
- Lav et vandbad ved at lime sammen stykker skåret af akryl ark, der vil være i stand til at hvile på toppen af dyrets hoved over stereotaktisk ramme (Figur 1e).
- Skær en åbning i bunden af badet, der er på størrelse med dyrets hoved. Dæk hullet i vandbadet med et polyimidbånd.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at der ikke siver vand omkring polyimidbåndet, da det kan vådte rottens pels og forårsage hypotermi.
- Skær en åbning i bunden af badet, der er på størrelse med dyrets hoved. Dæk hullet i vandbadet med et polyimidbånd.
- Lav en MR-fiducial ved at fylde en 4 mm diameter tyndskallet plast eller glaskugle med en MR-synlig væske (f.eks. E-vitaminolie) og forsegle den. Placer den i MRI-fiducialholderen på højre side af den 3D-printede stereotaxiske ramme (Figur 2a).
- Fastgør den 3D-printede rammeholder til XYZ-positionen på et godt sted til positionering af dyr. Skub fanen i rammens talerende ind i den matchende kanal på Y-aksens skinne, og fastgør med indstillede skruer(Figur 1h, røde pile).
- Hvis du vil køre XYZ positioner, skal du installere USB'en på seriel konverter på en computer ved at følge producentens anvisninger og tilslutte konverteringsprogrammet. Installer kørselsmiljøet og motorcontrollersoftwaren på pc'en.
- Kontroller, at den korrekte serielle port er valgt i softwaren, ved at vælge USB'en til seriel konverter i rullelisten til valg af port på controllersoftwarens frontpanel. Tilslut USB til seriel konverter til steppermotorcontrollerboksen ved hjælp af et 9-benet serielt crossoverkabel (f.eks. RS232 null-modemkabel).
- Kør controllersoftwaren for at teste, at steppermotorerne kan køres under softwarestyring. Dette trin kan kræve hjælp fra lokal it-support.
3. Procedure for intrakraniel målretning
BEMÆRK: Mandlige Sprague Dawley rotter vejer 250-350 g blev brugt til disse eksperimenter. Dyr havde fri adgang til vand og rotte chow, og blev opretholdt på en 12:12 h lys: mørk cyklus.
- Sæt dyret under anæstesi (3% isofluran med ilt) og kontroller for manglen på respons på tåklem. Indsæt derefter kateteret som beskrevet nedenfor.
- Varm halen med en lampe for at gøre det lettere at ramme venen. Pas på ikke at overophede dyret eller at brænde halen.
- Når dyret sover (reagerer ikke på en tå knivspids), skal du indsætte 24 G hale vene kateter, der vil blive brugt til at levere mikrobobler, Evans blå farvestof (EBD), gadobutrol MRI kontrast, hvis du bruger MRI, og det eksperimentelle middel af interesse. Når venen er ramt, vil blodet fylde skeden, langsomt fjerne den indre nål, mens du skubber kappen længere ind i venen.
BEMÆRK: Se en guide som Stuart og Schroeder33, hvis du laver rottehale vene injektioner for første gang. - Hvis der ikke er nogen blodgennemstrømning, langsomt flytte kateteret kappen ud af venen for at teste, at nålen kan have stukket gennem venen. Hvis blodet strømmer, når kateteret trækkes lidt tilbage, gik først stikket gennem venen, og kateterets placering skal genstartes et andet sted på halen, der er rostral til det tidligere sted.
- Fyld kateterets stik med saltvand, og skru kateterets stik ind i enden af kateterets port, så snart porten er fyldt med blod. Pak forsigtigt laboratoriebåndet rundt om kateteret og halen for at holde det på plads. Start med et lille stykke øverst og arbejd i kaudale retning, så til allersidst kateteret er udsat.
- Sæt anæstesilinjen på anæstesistikket på den stereotaxiske ramme (Figur 2a) og fastgør dyrene hovedet ind i rammen ved at placere munden på bidestangen og ved at lede ørestængerne ind i begge ørekanaler og derefter stramme sætskruerne. Sørg for, at dyrene hovedet er sikkert og niveau.
- Flyt dyret ind i MRI-sengen og tilslut anæstesilinjen til næseke keglen. I denne protokol blev der anvendt en 9,4 T lille bar dyr MRI.
- Indsamle koronar og aksial T2-vægtede billeder, der fanger hele hjernen samt MR-fiducial (Figur 2b) for koordinat målinger. Giv den lokale MR-fysiker eller teknologi følgende oplysninger, så de kan opbygge MR-protokollen.
- For koronabilleder(Figur 2b top) skal du bruge følgende parametre: antal billeder: 27, bredde: 62,2 mm, højde: 62,2 mm, dybde: 37,97 mm, Voxel-størrelse: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
- For aksiale billeder(Figur 2b nederst) skal du bruge følgende parametre: antal billeder: 13, Bredde: 61,47 mm, Højde: 53,81 mm, Dybde: 16,7 mm, Voxel-størrelse: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at have disse nøjagtige parametre, så længe koronaen i planopløsning er tæt på 0,25 mm, og billederne dækker hele hjernen og fiducialen.
- Indsaml koordinatmålinger fra ovenstående billeder ved at registrere afstanden fra MRI-fiducialen til hjerneregionen, der vil blive målrettet med FUS.
- Ved scanneren, på koronabillederne indsamlet i trin 3.5, skal du finde det billede, hvor fiducialen er den største, hvilket angiver midten af fiducialen. Registrer afstanden fra toppen af fiducial til hjernen region af interesse i mm (MR-software vil have en skala eller punkt måleværktøj, konsultere lokale MRI tech eller fysiker om, hvordan du gør dette) i både mediale / laterale retning og i dorsal ventral retning(Figur 2b, top).
- Ved scanneren, på de aksiale billeder indsamlet i trin 3.5, skal du finde det billede, der viser toppen af fiducialen og måle afstanden fra midten af fiducialen til målhjerneregionen i både den dorsale / ventrale retning og i den mediale / laterale retning(Figur 2b, bund).
- Sammenlign de to mediale/laterale målinger, og hvis de er forskellige, skal du bruge gennemsnittet. Disse koordinatmålinger vil blive brugt senere i trin 4.3 til at lede FUS-omdrejningspunktet til målhjerneregionen med XYZ-positionen.
- Indsaml MR-forhåndsscanningsbilleder. Sammenlign disse billeder med de billeder, der er indsamlet efter FUS BBB-åbning (Figur 4). T1-vægtede billeder vil senere blive brugt til at visualisere BBB åbning, T2-vægtede billeder vil senere blive brugt til at sikre, at der ikke er sket vævsskader efter FUS-behandling34.
- For T1-vægtede aksiale billeder skal du bruge følgende parametre: bredde: 30 mm, højde: 51,2 mm, dybde: 3,0 mm, voxelstørrelse: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, antal billeder: 13.
- For T2-vægtede aksiale billeder skal du bruge følgende parametre: bredde: 30 mm, højde: 51,2 mm, dybde: 2,6 mm, voxelstørrelse: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, antal billeder: 13.
- For T1-vægtede koronabilleder skal du bruge følgende parametre: bredde: 30 mm, højde: 30 mm, dybde: 27 mm, voxel størrelse: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, antal billeder: 27.
- For T2-vægtede koronabilleder skal du bruge følgende parametre: bredde: 30 mm, højde: 30 mm, dybde: 27 mm, voxel størrelse: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, antal billeder: 27.
BEMÆRK: Som i trin 3.5 behøver disse billedparametre ikke at være nøjagtigt de samme som angivet. Disse billeder har en mindre FOV og højere opløsning end dem, der indsamles i trin 3.5.
- Hold dyret i den stereotaxiske ramme, og transporter hurtigt dyret fra MRI-sengen til FUS-opsætningen på bænken. Sørg for, at dyret forbliver i søvn til overførsel under bedøvelse.
- For længere overførselstider skal du bruge en kasse til overførsel, der er stor nok til at passe dyret og rammen. Med anæstesiproppen stadig fastgjort, læg dyret og rammen inde i kassen og lad den overskydende isoflurane fylde kassen i et par minutter. Tag bedøvelseslinjen ud, og overfør hurtigt.
4. Fokuseret ultralyd procedure
- Ved ankomsten til FUS bordplade setup, straks sætte anæstesi linje i næsen kegle og fortsætte med at køre 1,5-3% isoflurane med ilt. Gør dette så hurtigt som muligt for at undgå, at dyret vågner op.
- Skub rammen ind i rammeholderen, og fastgør den fast. Brug klipper til at barbere dyrets hoved. Børst overskydende hår væk og påfør hårfjernercreme på hovedbunden. Lad sidde i 3 minutter og tørre væk med vand og gaze.
- Hvis MR-scanning ikke er tilgængelig til målretning, skal du bruge en standard (ikke 3D-printet) stereotaktisk ramme for at null markørpositionen til bregma ved at røre ved markørspidsen til bregma (et hovedbundsindsnit er nødvendigt for dette) og annullere softwaren eller optage koordinaterne. Flyt XYZ-vognen op med 50 mm ved at klikke på den opfølgende 50-knap i softwaren og bytte markøren til transduceren. Baseret på en rotte hjerne atlas som beskrevet tidligere35, flytte til den ønskede hjerne koordinater ved hjælp af stepping knapper i softwaren. Hvis du bruger denne metode i stedet for MRI, skal du gå ned til afsnit 4.6.
- Hvis du bruger MRI-vejledning, skal du vedhæfte markøren og flytte markøren til placeringen af MRI-fiducialen (Figur 1d,g). Placer markøren helt øverst og midt på MRI-fiducialen (der er et lille hul i toppen af fiducialholderen til at pege). Klik på nulpositionsknappen, som er det punkt, hvorfra alle afstande i MRI-billedet blev beregnet.
- Fjern markøren, og flyt positionen til de mediale/laterale koordinater og rostrale/kaudale koordinater. Hæv positionen op ved at trykke på op 50 knappen for at give mulighed for placering af vandbad og ultralyd gel. Hvis toppen af Z-aksens vandring nås, bliver annulleringsplaceringen ugyldig. Dorsal-/ventralkoordinaten indstilles, når transduceren er tilføjet.
- Påfør ultralydgel til dyrets hovedbund og læg vandbadet over dyret med polyimidbåndsvinduet presset på gelen. Sørg for, at der ikke er luftbobler i ultralydsgelen.
- Fyld vandbadet med afgasset vand.
- Hvis du bruger højeffekttransduceren, skal du sænke positionen, så magneten er lige over vandet. Fastgør transduceren til positionen ved forsigtigt at sænke transduceren i vandet i en vinkel for at forhindre luftbobler i at blive fanget under ansigtet og forbinde magneterne.
- Hvis du bruger den energibesparende nedsænkningstransducer, skal du sænke positionen ned i vandet lige over transducerclipsen. Klip derefter transduceren på plads ved langsomt at sænke den ned i vandet i en vinkel for at forhindre luftbobler i at blive fanget under ansigtet.
BEMÆRK: Et gennemsigtigt bad er nyttigt, når du kigger under transducerens ansigt efter bobler. - Sænk positionen til ryg-/ventralkoordinaten.
- Tænd rf-forstærkeren.
- Der injiceres 1 mL/kg 3% Evans blå farvestof (EBD) ved at stikke nålespidsen ind i kateterets stik og injicere. Lad det cirkulere i 5 min.
- Aktiver mikrobobler ved at ryste dem voldsomt med med boble shaker.
- Der fremstilles 5x dosis på 30 μL/kg mikrobobler (boble conc. 1,2 x 1010/mL) i 0,2 mL saltvand for at tage højde for de 2 FUS-behandlinger og slangen i det 18 G vingede infusionssæt. For eksempel, hvis rotten vejer 200 g, skal du fylde sprøjten indeholdende 18 G nålespids med 30 μL mikrobobler i 1 mL saltvand.
BEMÆRK: Sørg for at bruge 18 G nålespidser til både optagning og injektion med det vingede infusionssæt. - Vend sprøjten flere gange for at få en ensartet fordeling af mikrobobler. Fastgør og fyld derefter det bevingede infusionssæt. Placer sprøjten på infusionspumpen, og indstil infusionspumpen til at levere 0,2 mL med en hastighed på 6 mL/h. Dette vil give langsom infusion af mikrobobler over 2-minutters FUS eksponering.
- Sæt den bevingede nål i kateterets stik.
- Der fremstilles 5x dosis på 30 μL/kg mikrobobler (boble conc. 1,2 x 1010/mL) i 0,2 mL saltvand for at tage højde for de 2 FUS-behandlinger og slangen i det 18 G vingede infusionssæt. For eksempel, hvis rotten vejer 200 g, skal du fylde sprøjten indeholdende 18 G nålespids med 30 μL mikrobobler i 1 mL saltvand.
- Kør først infusionspumpen, vent 3 s, og start FUS-behandlingen ved at trykke på outputaktiveringsknappen på funktionsgeneratoren (mærket "på" på funktionsgeneratoren i materialebordet). Gentag disse to gange pr. region med 5 minutter imellem for at gøre det muligt for mikroboblerne at rydde.
- Tryk igen på knappen på funktionsgeneratoren for at stoppe FUS-behandlingen, når infusionspumpen stopper ved 2 min.
- Vent i 5 minutter på, at mikroboblerne ryddes. Start derefter infusionen og den anden FUS-behandling.
- Umiddelbart efter den anden FUS-behandling injiceres gadobutrolkontrast (hvis der bruges MRI) og det agens, der er af interesse, f.eks. Den samlede leverede mængde af alle agenter må ikke overstige 5 mL/kg.
BEMÆRK: Tidspunktet for levering (f.eks. før eller efter FUS BBB-åbning) for den anvendte agent kan variere afhængigt af den anvendte agent.
- Sluk for RF-effektforstærkeren, og transporter straks dyret tilbage til MR-scanningen.
5. MR-bekræftelse af BBB-åbning
- Hvis MR-scanning ikke er tilgængelig, skal du gå til afsnit 6 og bruge EBD-udtryk til bekræftelse af BBB-åbning.
- Placer dyret tilbage på MRI-sengen på nøjagtig samme sted som i trin 3.7 og tilslut bedøvelseslinjen.
- Indsaml MR-scanningerne med de samme billeddiagnostiske parametre, der blev anvendt i trin 3.7 til at visualisere mri-forbedringen af gadobutrol i området BBB-åbning (Figur 3b,e).
6. Perfusion og vævsindsamling
- Perfuse dyret med koldt 4% formalin, indtil blodet løber helt klart.
- Fjern hjernen og sted i 4% formalin eller PFA ved 4 °C natten over. Placer derefter hjernen i 30% saccharoseopløsning, indtil hjernen synker (ca. 2-3 dage). Endelig flash fryse i flydende nitrogen eller på tøris og opbevares ved -80 ° C, indtil cryosectioning.
- Frys hjernen i OCT og tag cryosections.
- Fastgør og coverlip sektioner til fluorescens mikroskopi. EBD excitation topper ved 470 og 540 nm og emission toppe ved 680 nm. Coverslip med DAPI monteringsmedium for at visualisere den overordnede cellulære morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi, at fokuseret ultralyd med mikrobobler kan fremkalde lokaliseret BBB-åbning ved hjælp af de parametre, der er angivet ovenfor, med både laveffektsænkningstransduceren (Figur 3) og FUS-transduceren (Figur 4). For det første blev laveffekttransduceren i de tidlige eksperimenter målrettet mod en hjernehalvdel enten forreste (figur 3b) eller mediale (Figur 3a). Dyr blev derefter ofret 2 timer senere med perfusion (figur 3a) eller uden perfusion (figur 3b), og der blev indsamlet 10 μm frosne hjernesektioner. FUS BBB-åbningen fremgik tydeligt af EBD's autofluorescens (excitation: 470 og 540 nm, emission: 680 nm) på målhalvkuglen (hvide pile Figur 3a og 3b).
Vi har fundet det bedst at gennemgå dyrene for klar visualisering af BBB åbning med EBD autofluorescens. BBB-åbning kan dog stadig visualiseres uden at rense blodkarrene (Figur 3b). Cellulær optagelse og frihøjde af EBD efter BBB-åbning begynder allerede 30 minutter efter BBB-åbning og stiger over 24 timerog 37. Til evaluering af BBB-åbning med EBD-autofluorescens er det bedst at ofre dyret mellem 15 minutter og 3 timers BBB-åbning. Men i sidste ende, vil tidspunktet for ofringen afhænge af agenten, der blev leveret. I en AAV-undersøgelse kan 3 uger efter BBB-åbning og AAV-levering (figur 5c) f.eks.
I senere forsøg var FUS-transduceren rettet mod enten hippocampus (figur 4a-c) eller den forreste cingulate cortex (ACC) (figur 4 d-f), og ud over EBD blev MRI-kontrastmidlet gadobutrol (0,1 mL/kg) injiceret IV for at verificere en målrettet åbning af BBB in vivo. Figur 4b,e viser øget MR-kontrast, hvor gadobutrol kontrasten er kommet ind i vævet 1 time efter BBB åbning og kontrast agent injektion. Denne kontrastændring er tydelig, når man sammenligner med de MRI-forudsætninger, der blev truffet før FUS-proceduren(figur 4a,d). Dyrene blev derefter ofret ved perfusion 1,5 timer efter BBB's åbning, og der blev indsamlet 10 μm kryosections. EBD-autofluorescens er tydelig i FUS-målrettede regioner, hvilket yderligere indikerer placeringen af BBB-åbning (figur 4c,f). Dette tal viser, hvordan MR-kontrast undertiden kan være vanskelig at se (som i forskellen mellem figur 4b og figur 4e); derfor er det nyttigt at bekræfte BBB åbning med visualisering af EBD autofluorescens som i fluorescens mikrograf i figur 4f.
For at vurdere, om denne teknik kunne anvendes til målrettet genlevering, blev AAV9-hsyn-GFP og gadobutrolkontrast injiceret IV (titer: 1,32 x10 14 GC/mL, 0,05 mL/kg) umiddelbart efter BBB-åbningen i hippocampus. Dyret blev derefter MR afbildet 30 minutter efter BBB åbning og ofret 3 uger senere ved perfusion. Der blev indsamlet 10 μm kryosections til fluorescerende billeddannelse af GFP-ekspression. BBB-åbningen var tydelig ved gadobutrolkontrast i mål hippocampus (figur 5a,b). Derudover blev genlevering bekræftet af GFP-ekspressionen i mål hippocampus tydeligt ved grøn fluorescens (Figur 5c). Bemærk, at EBD på nuværende tidspunkt er ryddet ud og kun er tydelig i hjertekamrene (Figur 5c).
Figur 1: OPSÆTNING AF FUS-bordplade ( a) FUS-opsætning, herunder XYZ-positionen, et PVC-rør med en diameter på 30 mm til fastgørelse af transduceren, den 3D-printede stereotaxiske ramme og infusionspumpen. (b) Enden af PVC-røret er lukket, og en magnet er fastgjort til den med epoxy. (c) En anden matchende magnet er fastgjort til den øverste midten af high-power transducer med epoxy. (d) Desuden er en anden matchende magnet fastgjort til markøren for at ophæve positionen øverst og midt på MRI-fiducialen. (e) Markøren erstattes til sidst med højeffekttransduceren, og et vandbad kobles til dyrets hoved med ultralydgel. f)Den energibesparende nedsænkningstransducer kan fastgøres til PVC-røret med det 3D-printede transducerclips. g) Ved placering erstattes transduceren med den 3D-printede pointer, og positionen annulleres øverst og i midten af MRI-fiducialen. h)Den stationære 3D-printede rammeholder gør det muligt at returnere dyret til samme position efter MR-scanning, hvis der er behov for flere FUS-behandlinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Stereotaxic ramme med MR-fiducial for MR-styrede koordinater. a)Dyrene anbringes først i en 3D-printet stereotaxisk ramme, der er udstyret med en MR-fiducial. (b) Rammen placeres derefter inde i MRI-sengen, og afstanden fra fiducialen (den slemerede cirkel) til målhjerneområdet måles ved hjælp af både koronabilleder til dorsale/ventrale (D/V) målinger og aksiale billeder til rostral/kaudale (R/C) målinger, mediale/laterale (M/L) målinger kan indsamles fra begge akser. Dyr holdes i rammen og overføres til FUS-stationen, hvor en pointer bruges til at null XYZ-positionen på stedet for fiducialen. Markøren erstattes derefter med transduceren, og som derefter kan flyttes baseret på de indsamlede koordinater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Evans blå farvestof (EBD) bekræfter, at FUS BBB åbner både med og uden perfusion. (a) Mikrograf af en 10 μm hjerne sektion 2 timer efter FUS BBB åbning med lav effekt nedsænkning transducer målrettet til mediale venstre halvkugle. Dette er et repræsentativt billede af et dyr, der blev perfunderet med 4% buffered formalin før vævsindsamling. BBB åbning er tydeligt ved EBD rød autofluorescens (pil). (b) Mikrograf af en 10 μm hjerne sektion 2 timer efter FUS BBB åbning målrettet til den forreste venstre halvkugle. Dette er et repræsentativt billede af et dyr, der ikke var perfunderet før vævsindsamling derfor EBD forbliver i blodkarrene. BBB åbning er tydeligt, hvor EBD har sivet ud af blodkarrene (pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: FUS BBB-åbning bekræftet med Gadobutrol MRI-kontrast og EBD-udtryk. MR-billeder før (a og d) og efter (b og e) BBB åbning. gadobutrol kontrast ekstraudstyr bekræfter placeringen af BBB åbning in vivo (b og e, pile). (c) 10 μm hjernesektion, der viser yderligere bekræftelse af BBB-åbning med EBD-autofluorescens (rød) i hippocampus (blå DAPI-atomplet). Skalalinje; 500 μm. (f) Mikrografi af en hjernesektion på 10 μm efter BBB-åbning i den forreste cingulate cortex tydeligt ved EBD rød autofluorescens (pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Lokaliseret levering af AAV9-hsyn-GFP til hippocampus via FUS BBB-åbning. MR-bekræftelse af BBB-åbning med MRI-kontrastmiddel, MR-kontrast (pile) i både koronar (a) og aksial (b) T1-vægtede billeder. c) histologisk bekræftelse af GFP-ekspressionen i den FUS-målrettede hippocampus (grøn) 3 uger efter FUS BBB-åbningen og AAV9-hsyn-GFP IV-injektionen. Blå angiver DAPI atomplet for den samlede cellulære morfologi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en benchtop tilgang til mikroboble assisteret FUS BBB åbning med alternative tilgange, herunder to forskellige transducere og metoder til intrakraniel målretning med og uden MR-vejledning. For at etablere MRI-guidet FUS BBB-åbning i laboratoriet er der i øjeblikket mulighed for at købe fremragende brugsklare enheder, der giver meget standardiserede og reproducerbare resultater med brugervenlige grænseflader. Men mange laboratorier er ikke forberedt på omkostningerne ved sådanne instrumenter. Derfor er hovedformålet med denne protokol at give et udgangspunkt, som ethvert laboratorium kunne etablere for at opbygge deres ekspertise i teknikken.
FUS BBB-åbning er nu en udbredt teknik, og det er ofte tilfældet, at forskellige grupper bruger en række forskellige anæstesimidler, som hver især kan påvirke graden af BBB-åbning og ekstravasation. Det er vigtigt, at den anvendte bedøvelse kan påvirke størrelsen af BBB-åbning, så det er vigtigt at overveje dette, når du udfører denne protokol38. Her anvendes bedøvelsesisofluranen, fordi dyr kan holdes under isofluran for protokollens længde, og isoflurangasniveauerne let kan justeres baseret på dyrets åndedrætshastighed og puls. Derudover leverede vi isoflurane med ilt, fordi det var mere tilgængeligt end medicinsk luft; Medicinsk luft kan dog tillade en mere omfattende BBB-åbning39. Nogle MR-kontrast agenter er mere passende for denne protokol end andre. For eksempel producerede gadoteridol i vores hænder ingen kontrastforbedring, selv når EBD-lækage var tydeligt til stede i væv efter døden indtraf. Mikroboble formulering er også vigtigt. Her bruger vi perflutren lipid mikrosfærer. Andre mikroboble formuleringer såsom perflutren protein-type A mikrobobler er let tilgængelige, men den type mikrobobler, der anvendes, vil påvirke resultaterne15.
Kontrol af funktionsgeneratorer kan variere en hel del, så se vejledningen for vejledning i, hvordan du indtaster de indstillinger, der er angivet i trin 1. Den passende kommandospænding (V-top til top på funktionsgeneratoren) afhænger i høj grad af transduceregenskaberne, RF-forstærkerforstærkeren, RF-forstærkeren til transducer matching, dyrets alder og størrelse, mikrobobletypen og koncentrationen og den ønskede behandlingseffekt. Toppen til toppen V skal bestemmes af trial and error. Start med de indstillinger, der foreslås i trin 1, og bestem effekten histologisk. Hvis der er vævsskader, skal du sænke toppen til toppen V med 10% og prøve igen. Ligeledes, hvis der ikke er nogen BBBO derefter hæve toppen til toppen V med 10% og prøv igen. Hvis du sætter for højt af et V, kan det beskadige transduceren for nedsat effekt. Dette vil være tydeligt som en revner eller forvrængning af transducerens ansigt. Produktionstiderne på transducere kan være lange, så når du starter, foreslår vi at købe mere end en transducer som backup. Ultralydtransducere kan også beskadige forstærkere, hvis de er forkert matchet. For enkelhed og pålidelighed foreslår vi at bruge en robust effektforstærker, der kan drive komplekse belastninger (såsom RF-effektforstærkeren i materialebordet). Bemærk, at mens højeffekttransduceren leveres med et matchende kredsløb, gør transduceren med lav effekt nedsænkning ikke. Den foreslåede RF-forstærker kan håndtere den reflekterede effekt fra den dårligt matchede transducer, men nogle forstærkere kan blive beskadiget i denne konfiguration. Hvis trin 2.7 viser sig problematisk efter installation af driveren og softwaren, skal du dobbelttjekke, at den korrekte serielle port er valgt i softwaren. Prøv derefter et andet serielt kabel. Hvis det mislykkes, skal du søge lokal it-support.
Af erfaring, vil det tage praksis og flere justeringer for at opnå stram nøjagtighed i hjernen region målretning. Dette fremgår af forskellene i målretning mellem de tidlige forsøg (figur 3) og de seneste forsøg (figur 5). Vi begyndte forsøgene ved hjælp af en klassisk stereotaxic ramme, og vi inkluderer det som en mulighed her, hvis der ikke er adgang til en 3D-printer, eller hvis der ikke er adgang til gnaver MRI. MR-vejledning med MR-fiducials og den medfølgende 3D-printbare ramme (eller et brugerdefineret design) er imidlertid den ideelle metode. For det første tegner det sig for individuelle forskelle mellem dyr ved at samle koordinater inden for dyret i stedet for at stole på et gennemsnitligt rottehjerneatlas. Derudover giver brugen af MR-scanning mulighed for bekræftelse af FUS-placeringsmålretning in vivo i stedet for at stole på EBD-udtryk efter døden. Dette er vigtigt, når der leveres agenter, der kan kræve mere end 24 timer at træde i kraft, såsom AAV'er (Figur 5). Endelig giver den medfølgende rammeholder dyret mulighed for at vende tilbage til samme position efter MR-scanning for at rette eventuelle målretningsfejl eller gentage FUS efter utilstrækkelig BBB-åbning uden at skulle gentage koordinaterne. Den bærbare 3D-printede stereotaxiske ramme kan bruges i enhver MR-scanning med en klar boring på 200 mm eller bredere.
Afhængigt af blodkarfordelingen i målplaceringen, kranietykkelse40, tilstedeværelsen af ventrikler og andre faktorer kan graden af BBB-åbning variere. Af denne grund leverer vi en metode til gentagen målretning med ramme- og rammeholderen. Nøjagtigheden af målretning afhænger kritisk af at holde transducerfokus på et ensartet sted med hensyn til målretningsmarkøren. Spidsen af denne pointer skal angive placeringen i rummet af midten af transducerfokuseringen, når transduceren er fastgjort til XYZ-positionen. Magneterne gør det nemt at udskifte markøren og transduceren, samtidig med at denne kolocalisering opretholdes. Hullet og fremspringet i magneterne skal matche så præcist som muligt. Enhver variation i denne forbindelse reducerer repeterbarheden af FUS-fokusmålretningen. Der vil dog være en rumlig forskydning mellem markørspidsen og ultralydsfokus. Når det er bekræftet, at forskydningen er konsistent, kan den korrigeres ved at bruge MR-billederne til at beregne forskellen i mm for den resulterende BBB-åbningsplacering (placering af MRI-kontrast) og den tilsigtede målplacering. Denne forskel kan derefter indregnes i null-placeringen. Nøjagtighed og repeterbarhed drager også stor fordel af at bruge den samme ultralydsfrekvens og bruge rotter af samme størrelse og alder i et givet sæt eksperimenter. Ultralyddæmpning af rottehjernen og rotteskallen varierer med hyppighed, og kraniestørrelsen og kranietykkelsen varierer med alderen. Kraniet er også et lille hulrum med hensyn til ultralydspulsen, og hændelse ultralyd interagerer med refleksioner inde i kraniet for at producere et komplekst lydfelt, der er afhængigt af væv, kranium, frekvens og placeringen af transduceren40.
Som nævnt andetsteds, denne protokol er beregnet til at give en lav investering alternativ til fremragende MR-kompatible kommercielle løsninger, der allerede kan købes. Der er vigtige begrænsninger, der skyldes at holde omkostningerne lave. Der er også begrænsninger forbundet med den teknik, der gives fysik og den nuværende state of the art. Bemærkelsesværdigt, på trods af disse begrænsninger, og som vist i de repræsentative resultater, kan vi opnå konsekvent levering af farvestoffer, partikler og vira til hippocampus af rotter med submillimeter nøjagtighed. De vigtigste begrænsninger er, at (1) formen af FUS fokus afhænger af det mellemliggende væv og især formen og tykkelsen af kraniet {...}. Behovet for at fjerne dyret fra MR-scanningen for at udføre FUS-behandlingen forhindrer feedback i realtid om lokaliseringen og intensiteten af FUS-fokus. Uden denne feedback i realtid skal der udføres flere eksperimenter for at bekræfte indstillingen for hver kombination af målretningsplacering. Når indstillingerne er "ringet ind", har vi fundet god repeterbarhed. (2) XYZ-positionerings- og fiducialsystemet som konstrueret, men præcist, giver ikke nøjagtighed i positioneringsrammen fra eksperiment til eksperiment. De relative placeringer af XYZ-hjemmet, gnaverens kranium og rammen kan bevæge sig i forhold til hinanden fra eksperiment til eksperiment. Dette undgås ved at bruge et MR-billede til målretning, en målretningspointer og fiducial med kendt placering i rummet i forhold til FUS-fokus, hvilket sikrer, at MRI-koordinatsystemet er parallelt med XYZ-positionersystemet, ved at udføre testbehandlinger forud for sættet af rigtige behandlinger og ved at udføre hele proceduren inden for en session, så dyret ikke behøver at blive flyttet ind i rammen. Bemærk, at fordi der kun anvendes en fiducial, er rammerotationer ikke korrigerelige, så det er vigtigt at sikre, at rammen er i niveau med hensyn til MRI-sengen og boringen. Sammenfattende indikerer markørplaceringen ikke det sande FUS-fokus, men vi har fundet, at forskydningen er konsistent for en given hjerneplacering, forudsat at kraniet ikke roterer i forhold til ultralydtransduceren. Bemærk også, at konsekvent timing af gadobutrol levering i forhold til BBB åbning og billeddannelse er afgørende for ensartede resultater, især hvis MR-kontrast ændring bruges som en proxy for mængden af BBB åbning (se 36).
Vi begyndte først fus BBB åbning i laboratoriet med low-power nedsænkning transducer beskrevet ovenfor. Vi fandt ud af, at det er en overkommelig mulighed for at komme i gang med denne teknik. Vigtigst er det, tilpasning af denne protokol kan give et noninvasive alternativ til intrakraniel stereotaxisk kirurgi og præklinisk forskning udført med denne teknik kan betragtes som meget translationel på grund af den nuværende brug af transkranial FUS hos mennesker30,32,41. Når etableret i et laboratorium, denne teknik kan bruges som en noninvasive alternativ til stereotaxic kirurgi. Således omdanne en strengt efterforskning værktøj til en meget translationel værktøj. Vores laboratorium vil bruge denne teknik til MR-styret, lokaliseret levering af vira og nanopartikler til at udvikle nye, ikke-invasive neuromodulationsteknikker, der kan bruges til frit at opføre sig vågen gnavere og ikke-menneskelige primater. Det nuværende arbejde fokuserer på Designer Drugs udelukkende designet til Designer Receptorer (DREADDs) og sensibilisering af neuroner til lave doser af høj energi partikler såsom røntgenstråler. Laboratoriet arbejder også på en ny version af denne protokol, der kan udføres i en menneskelig 3 T-scanner for at eliminere behovet for at flytte dyret under behandlingen og for at give feedback i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af et NSF EPSCoR Research Infrastructure-tilskud til Clemson University (1632881). Derudover blev denne forskning delvist støttet af Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Forfatterne taknemmeligt anerkende brugen af de tjenester og faciliteter ved University of Alabama i Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Forfatterne anerkender Rajiv Chopra for hans støtte og vejledning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
- Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
- Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
- Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
- Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
- Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
- Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
- Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
- Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15 (2018).
- Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986 (2018).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
- Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
- Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
- Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
- Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
- Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
- Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
- Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
- Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
- Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
- Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86 (2019).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
- Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
- Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
- Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
