Summary
L’ultrason focal avec des agents de microbubble peut ouvrir la barrière de cerveau de sang focalement et transitoirement. Cette technique a été utilisée pour délivrer un large éventail d’agents à travers la barrière cérébrale. Cet article fournit un protocole détaillé pour la livraison localisée au cerveau de rongeur avec ou sans guidage de MRI.
Abstract
La chirurgie stéréotaxique est l’étalon-or pour la livraison localisée de médicaments et de gènes au cerveau des rongeurs. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport à la livraison systémique, y compris la localisation précise d’une région cérébrale cible et la réduction des effets secondaires hors cible. Cependant, la chirurgie stéréotaxique est très invasive qui limite son efficacité translationnelle, nécessite de longs temps de récupération, et fournit des défis lors du ciblage de plusieurs régions du cerveau. L’ultrason focalisée (FUS) peut être employé en combination avec les microbubbles circulants pour ouvrir transitoirement la barrière de cerveau de sang (BBB) dans les régions millimétriques de taille. Cela permet la localisation intracrânienne des agents livrés de façon systémique qui ne peuvent normalement pas traverser le BBB. Cette technique fournit une alternative non invasive à la chirurgie stéréotaxique. Toutefois, à ce jour, cette technique n’a pas encore été largement adoptée dans les laboratoires de neurosciences en raison de l’accès limité à l’équipement et aux méthodes normalisées. L’objectif global de ce protocole est d’offrir une approche de banc à fus bbb ouverture (BBBO) qui est abordable et reproductible et peut donc être facilement adopté par n’importe quel laboratoire.
Introduction
Malgré les nombreuses découvertes en neurosciences fondamentales, le nombre de traitements émergents pour les troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifsreste relativement limité 1,2. Une meilleure compréhension des gènes, des molécules et des circuits cellulaires impliqués dans les troubles neurologiques a suggéré des traitements prometteurs irréalisables chez l’homme avec les techniques actuelles3. Les traitements efficaces sont souvent limités par la nécessité d’être pénétrables du cerveau et spécifiques au site4,5,6,7,8. Cependant, les méthodes existantes d’administration localisée de médicaments dans des régions spécifiques du cerveau (p. ex., l’administration par injection ou canule) sont invasives et nécessitent une ouverture dans le crâne9. L’invasivité de cette chirurgie empêche l’utilisation systématique de l’accouchement localisé dans le cerveau humain. En outre, les dommages de tissu et les réponses inflammatoires résultantes sont des confusions omniprésentes pour des études fondamentales et précliniques qui s’appuient sur l’injection intracerbrale10. La capacité de délivrer non invasivement des agents à travers la barrière cérébrale (BBB) et de les cibler vers des régions cérébrales spécifiques pourrait avoir un impact énorme sur les traitements pour les troubles neurologiques, tout en fournissant un puissant outil d’investigation pour la recherche préclinique.
Une méthode de transport ciblé à travers le BBB avec des lésions tissulaires minimales est l’échographie transcrânienne focalisée (FUS) ainsi que des microbobbles pour ouvrir focalement et transitoirement le BBB11,12,13,14,15,16. Fus BBB ouverture a attiré l’attention récente pour le traitement des troubles neurodégénératifs, accident vasculaire cérébral et gliome en localisant des thérapeutiques pour cibler les régions du cerveau tels que les facteurs neurotrophiques17,18 , 19, thérapiesgéniques 20,21,22, anticorps23, neurotransmetteurs24, et nanoparticules25,26,27,28,29. Avec sa large gamme d’applications et sa nature non invasive30,31, FUS BBB ouverture est une alternative idéale aux injections intracrâniens stéréotaxiques de routine. En outre, en raison de son utilisation actuelle chezl’homme 30,32, les investigations précliniques utilisant cette technique peuvent être considérées comme hautement translationnelles. Toutefois, l’ouverture du FUS BBB n’a pas encore été une technique largement établie en sciences fondamentales et en recherche préclinique en raison du manque d’accessibilité. Par conséquent, nous fournissons un protocole détaillé pour une approche benchtop à fus bbb ouverture comme point de départ pour les laboratoires intéressés à établir cette technique.
Ces études ont été menées soit avec un transducteur ultrasonique spécifique fus à air de haute puissance ou un transducteur d’immersion ultrasonique focalisée à faible puissance. Les transducteurs étaient entraînés par un amplificateur de puissance RF conçu pour les charges réactives et un générateur de fonction standard. Les détails de ces articles peuvent être trouvés dans le tableau des matériaux.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’UAB.
1. Installation focalisée d’équipement de conduite d’ultrason
- Utilisez 50 câbles BNC coaxiaux Ohm pour connecter (1) l’entrée du transducteur à ultrasons à la sortie de l’amplificateur RF et (2) l’entrée de l’amplificateur RF à la sortie du générateur de fonction.
- Réglez le mode générateur de fonction sur un éclat sinusoïde une fois par seconde avec un cycle de service de 1%.
- Pour le transducteur d’immersion de faible puissance amorti de 1 MHz avec une distance focale de 0,8 pouce utilisée avec un amplificateur RF de 50 dB, réglez les réglages de départ à : 1 onde sinusoïde MHz, 1 V de pointe à pic, cycle de 10 k, intervalle de 1 s (ou période).
- Pour l’air soutenu, transducteur de haute puissance de 1,1 MHz, réglez les réglages initiaux à : onde sinusoïde de 1,1 MHz, pic de 50 mV au sommet, cycles de 11 k, intervalle de 1 s.
REMARQUE : N’actionnons pas les transducteurs à moins qu’ils ne soient submergés. Ne placez pas une main ou une autre partie du corps au point d’ultrason ou ne touchez pas le visage transducteur pendant qu’il fonctionne.
2. Configuration focalisée de banc d’ultrason
- Imprimez en 3D le cadre stéréotaxique et le support stéréotaxique du cadre.
- Connectez le transducteur au positionneur XYZ à l’aide d’une pince tenant un tuyau en PVC (Figure 1a). Boulonner la pince sur la glissière x-axe et verrouiller avec un écrou d’aile.
- Si vous utilisez le transducteur à ultrasons de grande puissance, fixez-le au tuyau en PVC à l’aide d’une paire d’aimants assortie. Assurez-vous qu’un aimant a un trou et que l’autre a une saillie correspondante. Caper le fond du tuyau en PVC et y attacher l’un des aimants à l’aide d’époxy (voir figure 1b).
- Fixez le deuxième aimant au centre supérieur du transducteur à ultrasons de grande puissance à l’aide d’époxy. Assurez-vous qu’il est au centre même du transducteur (Figure 1c).
- Si vous utilisez le transducteur à ultrasons de grande puissance, faites un pointeur pour annuler le positionneur XYZ. La pointe de ce pointeur indique l’emplacement dans l’espace du centre de la mise au point du transducteur lorsque le transducteur à ultrasons est fixé au positionneur XYZ. Faire un pointeur à partir d’une aiguille de 18 G coupée pour être la longueur de la distance focale du transducteur plus l’épaisseur du transducteur (Figure 1d).
- Appliquer l’époxy sur un troisième aimant (cet aimant se couple également avec l’aimant à bouchon en PVC) et l’attacher au sommet du pointeur. Le pointeur sera alors en mesure de s’attacher à l’aimant sur le tuyau en PVC pour xyz nulling (Figure 1d).
- Si vous utilisez le transducteur d’immersion de faible puissance, imprimez le fichier 3D pour le pointeur et le clip de montage.
- Attachez le transducteur d’immersion de faible puissance au tuyau en PVC en coupant la tonte sur le tuyau de PVC et insérez le transducteur dans l’anneau (figure 1f).
- Faire un bain d’eau en collant ensemble des morceaux coupés à partir d’une feuille acrylique qui sera en mesure de se reposer sur le dessus de la tête de l’animal au-dessus du cadre stéréotaxique (Figure 1e).
- Couper une ouverture au fond du bain qui est d’environ la taille de la tête de l’animal. Couvrir le trou dans le bain d’eau avec un ruban polyimide.
REMARQUE : Il faut veiller à ce que l’eau ne s’écoule pas autour du ruban polyimide, car elle peut mouiller la fourrure du rat et causer de l’hypothermie.
- Couper une ouverture au fond du bain qui est d’environ la taille de la tête de l’animal. Couvrir le trou dans le bain d’eau avec un ruban polyimide.
- Faites une IRM fiduciale en remplissant une sphère en plastique ou en verre à carapace mince de 4 mm de diamètre avec un liquide visible IRM (p. ex., huile de vitamine E) et scellez-la. Placez-le dans le support fiducial IRM sur le côté droit du cadre stéréotaxique imprimé en 3D (Figure 2a).
- Fixez fermement le porte-cadres imprimé en 3D au positionneur XYZ à un bon endroit pour le positionnement des animaux. Faites glisser l’onglet sur l’extrémité rostrale du support du cadre dans le canal correspondant sur le rail de l’axe Y et fixez-le avec des vis réglées(figure 1h,flèches rouges).
- Pour conduire le positionneur XYZ, installez l’USB au convertisseur en série sur un ordinateur en suivant les instructions du fabricant et branchez le convertisseur. Installez l’environnement de temps d’exécution et le logiciel de contrôleur moteur sur le PC.
- Assurez-vous que le port de série approprié est sélectionné dans le logiciel en sélectionnant l’USB au convertisseur de série dans le contrôle de dropdown de sélection de port sur le panneau avant du logiciel de contrôleur. Connectez l’USB au convertisseur de série à la boîte de contrôleur moteur stepper à l’aide d’un câble multisegment sérielle à 9 broches (p. ex., câble modem nul RS232).
- Exécutez le logiciel de contrôleur pour tester que les moteurs stepper peuvent être conduits sous contrôle logiciel. Cette étape peut nécessiter l’aide d’un support it local.
3. Procédure de ciblage intracrânienne
REMARQUE : Des rats sprague dawley mâles pesant de 250 à 350 g ont été utilisés pour ces expériences. Les animaux avaient libre accès à l’eau et au chow de rat, et ont été maintenus sur un cycle clair : foncé de 12:12 h.
- Mettez l’animal sous anesthésie (3% d’isoflurane avec de l’oxygène) et vérifiez le manque de réponse à la pincement des pieds. Insérez ensuite le cathéter tel que décrit ci-dessous.
- Réchauffer la queue avec une lampe à faire est plus facile à frapper la veine. Veillez à ne pas surchauffer l’animal ou à brûler la queue.
- Une fois que l’animal dort (ne répond pas à une pincée d’orteil), insérez le cathéter de veine de queue de 24 G qui sera employé pour livrer des microbubbles, le colorant bleu d’Evans (EBD), le contraste de MRI de gadobutrol si utilisant MRI, et l’agent expérimental d’intérêt. Une fois que la veine est frappée, le sang remplira la gaine, enlèvera lentement l’aiguille intérieure tout en poussant la gaine plus loin dans la veine.
REMARQUE: Voir un guide comme Stuart et Schroeder33 si faire les injections de veine de queue de rat pour la première fois. - S’il n’y a pas de flux sanguin, déplacez lentement la gaine de cathéter hors de la veine pour tester que l’aiguille a pu percer la veine. Si le sang coule lorsque le cathéter est légèrement tiré vers l’arrière, puis d’abord poke est passé par la veine et le placement du cathéter devra être redémarré à un autre endroit sur la queue qui est rostral à l’emplacement précédent.
- Remplissez le bouchon de cathéter avec de la solution saline et vissez le bouchon de cathéter à l’extrémité du port de cathéter dès que le port est rempli de sang. Enveloppez soigneusement le ruban de laboratoire autour du cathéter et de la queue pour le maintenir en place. Commencez par un petit morceau en haut et travaillez dans la direction caudale, laissant la toute fin de la prise de cathéter exposée.
- Branchez la ligne d’anesthésie sur le connecteur d’anesthésie sur le cadre stéréotaxique (Figure 2a) et fixez la tête des animaux dans le cadre en plaçant la bouche sur la barre de morsure et en guidant les barreaux d’oreille dans les deux canaux auditifs, puis serrez les vis réglées. Assurez-vous que la tête des animaux est sûre et de niveau.
- Déplacez l’animal dans le lit d’IRM et connectez la ligne d’anesthésie au cône avant. Dans ce protocole, une IRM de petit forage de 9,4 T a été utilisée.
- Recueillir des images coronale et axiale pondérées en T2 qui capturent l’ensemble du cerveau ainsi que l’IRM fiduciale (Figure 2b) pour coordonner les mesures. Fournissez au physicien ou à la technologie d’IRM local les informations suivantes afin qu’ils puissent construire le protocole IRM.
- Pour les images coronal(figure 2b en haut), utilisez les paramètres suivants : nombre d’images : 27, largeur : 62,2 mm, hauteur : 62,2 mm, profondeur : 37,97 mm, taille Voxel : 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
- Pour les images axials(figure 2b en bas), utiliser les paramètres suivants: nombre d’images: 13, Largeur: 61,47 mm, Hauteur: 53,81 mm, Profondeur: 16,7 mm, Taille Voxel: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’avoir ces paramètres exacts tant que le coronal dans la résolution du plan est proche de 0,25 mm et les images couvrent l’ensemble du cerveau et fiducial.
- Recueillir les mesures de coordonnées à partir des images ci-dessus en enregistrant la distance entre l’IRM fiduciale et la région du cerveau qui sera ciblée par fus.
- Au scanner, sur les images coronaires recueillies à l’étape 3.5, trouver l’image dans laquelle le fiducial est le plus grand, indiquant le centre de la fiducial. Enregistrez la distance entre le haut du fiducial et la région cérébrale d’intérêt pour mm (le logiciel d’IRM aura un outil de mesure d’échelle ou de point, consultera la technologie locale d’IRM ou le physicien sur la façon de le faire) dans la direction médiale/latérale et dans la direction ventrale dorsale(figure 2b, en haut).
- Au scanner, sur les images axiales recueillies à l’étape 3.5, trouvez l’image qui montre tout le haut du fiducial et mesurez la distance entre le centre du fiducial et la région du cerveau cible, tant dans la direction dorsale/ventrale que dans la direction médiale/latérale(figure 2b, en bas).
- Comparez les deux mesures médial/latérales et si elles sont différentes utiliser la moyenne. Ces mesures de coordonnées seront utilisées plus tard à l’étape 4.3 pour guider le point focal fus vers la région du cerveau cible avec le positionneur XYZ.
- Recueillir des images prescan IRM. Comparez ces images aux images recueillies après l’ouverture du FUS BBB( Figure 4). Les images pondérées en T1 seront plus tard utilisées pour visualiser l’ouverture du BBB, les images pondérées en T2 seront plus tard utilisées pour s’assurer qu’aucun dommage tissulaire ne s’est produit après le traitement fus34.
- Pour les images axials pondérées en T1, utilisez les paramètres suivants : largeur : 30 mm, hauteur : 51,2 mm, profondeur : 3,0 mm, taille voxel : 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3,nombre d’images : 13.
- Pour les images axials pondérées en T2, utilisez les paramètres suivants : largeur : 30 mm, hauteur : 51,2 mm, profondeur : 2,6 mm, taille voxel : 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3,nombre d’images : 13.
- Pour les images coronal pondérées en T1, utilisez les paramètres suivants : largeur : 30 mm, hauteur : 30 mm, profondeur : 27 mm, taille voxel : 0,16 x 0,16 x 1 mm3,nombre d’images : 27.
- Pour les images coronal pondérées en T2, utilisez les paramètres suivants : largeur : 30 mm, hauteur : 30 mm, profondeur : 27 mm, taille voxel : 0,12 x 0,12 x 1 mm3,nombre d’images : 27.
REMARQUE : Comme à l’étape 3.5, ces paramètres d’imagerie n’ont pas besoin d’être exactement les mêmes que ceux énumérés. Ces images ont un FOV plus petit et une résolution plus élevée que celles collectées à l’étape 3.5.
- En gardant l’animal dans le cadre stéréotaxique, transportez rapidement l’animal du lit d’IRM à l’installation fus benchtop. Assurez-vous que l’animal reste endormi pour le transfert sous l’effet de l’anesthésie.
- Pour des temps de transfert plus longs, utilisez une boîte pour un transfert suffisamment grand pour s’adapter à l’animal et au cadre. Avec la prise d’anesthésie encore attachée, placez l’animal et cadrez à l’intérieur de la boîte et laissez l’excès d’isoflurane remplir la boîte pendant quelques minutes. Débranchez la ligne d’anesthésie et transférez-la rapidement.
4. Procédure focalisée d’ultrason
- En arrivant à la configuration du banc FUS, branchez immédiatement la ligne d’anesthésie dans le cône avant et continuez à fonctionner 1,5-3% isoflurane avec de l’oxygène. Faites-le le plus rapidement possible pour éviter que l’animal ne se réveille.
- Faites glisser le cadre dans le support du cadre et enclenchez-le fermement en place. Utilisez des tondeuses pour raser la tête de l’animal. Brossez l’excès de cheveux et appliquez de la crème dissolvante sur le cuir chevelu. Laisser reposer 3 minutes et essuyer avec de l’eau et de la gaze.
- Si l’IRM n’est pas disponible pour le ciblage, utilisez un cadre stéréotaxique standard (non imprimé en 3D) pour annuler la position du pointeur à bregma en touchant la pointe du pointeur à bregma (une incision du cuir chevelu sera nécessaire pour cela) et en annulant le logiciel ou en enregistrant les coordonnées. Déplacez le chariot XYZ vers le haut de 50 millimètres en cliquant sur le bouton vers le haut de 50 dans le logiciel et en échangeant le pointeur pour le transducteur. Basé sur un atlas du cerveau de rat tel que décritprécédemment 35, passer aux coordonnées cérébrales souhaitées en utilisant les boutons de marche dans le logiciel. Si vous utilisez cette méthode au lieu de l’IRM, passez à la section 4.6.
- Si vous utilisez des conseils d’IRM, fixez le pointeur et déplacez le pointeur à l’emplacement de l’IRM fiduciale (Figure 1d,g). Placez le pointeur en haut et au centre de l’IRM fiducial (un petit trou dans le haut du support fiducial est prévu pour le pointage). Cliquez sur le bouton de position nulle qui est le point à partir duquel toutes les distances de l’image IRM ont été calculées.
- Retirez le pointeur et déplacez le positionneur vers les coordonnées médiales/latérales et les coordonnées rostrales/caudales. Soulevez le positionneur en appuyant sur le bouton jusqu’à 50 pour permettre le placement du bain d’eau et du gel à ultrasons. Si le haut de l’axe Z est atteint, l’emplacement nulling sera invalidé. La coordonnée dorsale/ventrale sera réglée après l’ajout du transducteur.
- Appliquez du gel à ultrasons sur le cuir chevelu de l’animal et placez le bain d’eau sur l’animal avec la fenêtre en ruban polyimide pressée sur le gel. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le gel à ultrasons.
- Remplissez le bain d’eau d’eau dégazée.
- Si vous utilisez le transducteur de haute puissance, abaissez le positionneur de sorte que l’aimant est juste au-dessus de l’eau. Attachez le transducteur au positionneur en abaissant soigneusement le transducteur dans l’eau à un angle pour empêcher les bulles d’air de se coincer sous le visage et de connecter les aimants.
- Si vous utilisez le transducteur d’immersion de faible puissance, abaissez le positionneur dans l’eau juste au-dessus du clip du transducteur. Ensuite, coupez le transducteur en place en l’abaissant lentement dans l’eau à un angle pour empêcher les bulles d’air de se coincer sous le visage.
REMARQUE: Un bain transparent est utile lorsque vous regardez sous le visage transducteur pour les bulles. - Abaissez le positionneur à la coordonnée dorsale/ventrale.
- Allumez l’ampli de puissance RF.
- Injecter 1 mL/kg de colorant bleu Evans (EBD) à 3 % en collant la pointe de l’aiguille dans le bouchon de cathéter et en l’injectant. Laissez-le circuler pendant 5 min.
- Activez les microbubbles en les secouant violemment avec le shaker à bulles.
- Préparer 5 fois la dose de 30 μL/kg de microbubbles (bulle conc. 1.2 x 1010/mL)dans 0,2 mL de solution saline pour tenir compte des 2 traitements FUS et du tube dans l’ensemble d’infusion ailé de 18 G. Par exemple, si le rat pèse 200 g, remplissez la seringue contenant 18 G de pointe d’aiguille avec 30 μL de microbombs dans 1 mL de solution saline.
REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser des pointes d’aiguille de 18 G pour prendre et injecter avec l’ensemble d’infusion ailé. - Inversez la seringue plusieurs fois pour obtenir une distribution uniforme de microbobouillages. Attachez et remplissez ensuite l’ensemble d’infusion ailé. Placez la seringue sur la pompe à perfusion et réglez la pompe à perfusion pour livrer 0,2 mL à une vitesse de 6 mL/h. Ceci fournira l’infusion lente des microbubbles au-dessus de l’exposition fus de 2 minutes.
- Insérez l’aiguille ailé dans le bouchon de cathéter.
- Préparer 5 fois la dose de 30 μL/kg de microbubbles (bulle conc. 1.2 x 1010/mL)dans 0,2 mL de solution saline pour tenir compte des 2 traitements FUS et du tube dans l’ensemble d’infusion ailé de 18 G. Par exemple, si le rat pèse 200 g, remplissez la seringue contenant 18 G de pointe d’aiguille avec 30 μL de microbombs dans 1 mL de solution saline.
- Tout d’abord, faire fonctionner la pompe à perfusion, attendre 3 s et commencer le traitement FUS en appuyant sur le bouton de sortie activer sur le générateur de fonction (étiqueté "sur" sur le générateur de fonction dans la table des matériaux). Répétez ces deux fois par région avec 5 min entre les deux pour permettre aux microbubbles de se dégager.
- Appuyez à nouveau sur le bouton sur le générateur de fonction pour arrêter le traitement FUS lorsque la pompe à perfusion s’arrête à 2 min.
- Attendez 5 min pour que les microbobouillages se dégagent. Ensuite, commencer l’infusion et le deuxième traitement FUS.
- Immédiatement après le deuxième traitement fus, injecter le contraste de gadobutrol (si utilisant MRI) et l’agent d’intérêt, par exemple, les particules virales. Le volume total livré de tous les agents ne doit pas dépasser 5 mL/kg.
REMARQUE : Le moment de la livraison (p. ex., avant ou après l’ouverture du FUS BBB) de l’agent d’intérêt peut varier selon l’agent utilisé.
- Éteignez l’ampli électrique RF et transportez immédiatement l’animal à l’IRM.
5. Confirmation IRM de l’ouverture de BBB
- Si l’IRM n’est pas disponible, passez à la section 6 et utilisez l’expression EBD pour confirmer l’ouverture du BBB.
- Remettre l’animal sur le lit de l’IRM exactement au même endroit qu’à l’étape 3.7 et brancher la ligne d’anesthésie.
- Recueillir les analyses post IRM avec les mêmes paramètres d’imagerie utilisés à l’étape 3.7 pour visualiser l’amélioration de l’IRM gadobutrol dans la région de l’ouverture BBB (Figure 3b,e).
6. Perfusion et collecte de tissus
- Perfuser l’animal avec de la formaline froide de 4% jusqu’à ce que le sang soit complètement clair.
- Retirez le cerveau et placez-le dans 4% de formaline ou de PFA à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, placez le cerveau dans la solution de saccharose à 30% jusqu’à ce que le cerveau coule (environ 2-3 jours). Enfin, congeler le flash dans l’azote liquide ou sur la glace sèche et conserver à -80 °C jusqu’à ce que la cryosection.
- Congeler le cerveau en OCT et prendre des cryosections.
- Fixer et couvre les sections pour la microscopie par fluorescence. L’excitation de l’EBD culmine à 470 et 540 nm et les pics d’émission à 680 nm. Coverslip avec support de montage DAPI afin de visualiser la morphologie cellulaire globale.
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Representative Results
Ici, nous démontrons que l’échographie focalisée avec des microbobouillis peut induire l’ouverture localisée de BBB utilisant les paramètres spécifiés ci-dessus avec le transducteur d’immersion de basse puissance (figure 3) et le transducteur fus (figure 4). Tout d’abord, dans les premières expériences, le transducteur d’immersion de faible puissance a été ciblé sur un hémisphère cérébral antérieur (figure 3b) ou médial (Figure 3a). Les animaux ont ensuite été sacrifiés deux heures plus tard par perfusion (figure 3a) ou sans perfusion (figure 3b) et 10 sections de cerveau congelé de μm ont été recueillies. L’ouverture du FUS BBB était évidente par l’autofluorescence ebd (excitation : 470 et 540 nm, émission : 680 nm) dans l’hémisphère cible (flèches blanches Figure 3a et 3b).
Nous avons trouvé qu’il était préférable de parcourir les animaux pour une visualisation claire de l’ouverture bbb avec autofluorescence EBD. Toutefois, l’ouverture bbb peut encore être visualisée sans dégager les vaisseaux sanguins( Figure 3b). L’absorption cellulaire et le dégagement de l’EBD après l’ouverture de BBB commencent dès 30 minutes après l’ouverture de BBB et augmentent au-dessus de 24heures 37. Pour l’évaluation de l’ouverture bbb avec autofluorescence EBD, il est préférable de sacrifier l’animal entre 15 minutes et 3 heures d’ouverture BBB. Bien qu’en fin de compte, le temps du sacrifice dépendra de l’agent qui a été livré. Par exemple, dans une étude de l’AAV, 3 semaines après l’ouverture du BBB et la livraison de l’AAV (figure 5c) peuvent être appropriées.
Dans des expériences ultérieures, le transducteur FUS a été ciblé soit à l’hippocampe (Figure 4a-c) ou le cortex cingulaire antérieur (ACC) (Figure 4 d-f) et en plus de l’EBD, l’agent de contraste IRM gadobutrol (0,1 mL/kg) a été injecté IV pour vérifier l’ouverture ciblée de la BBB in vivo. Figure 4b,e montrent le contraste amélioré d’IRM où le contraste de gadobutrol est entré dans le tissu 1 heure après l’ouverture de BBB et l’injection d’agent de contraste. Ce changement de contraste est évident lorsque l’on compare aux prescans IRM pris avant la procédure FUS (Figure 4a,d). Les animaux ont ensuite été sacrifiés par perfusion 1,5 heure après l’ouverture du BBB et 10 cryosections de μm ont été recueillies. L’autofluorescence de l’EBD est évidente dans les régions ciblées par fus indiquant davantage l’emplacement de l’ouverture du BBB(figure 4c,f). Ce chiffre montre comment le contraste de l’IRM peut parfois être difficile à voir (comme dans la différence entre la figure 4b et la figure 4e); par conséquent, il est utile de confirmer l’ouverture de BBB avec la visualisation de l’autofluorescence d’EBD comme dans le micrographe de fluorescence dans la figure 4f.
Pour évaluer si cette technique pourrait être employée pour la livraison ciblée de gène AAV9-hsyn-GFP et le contraste de gadobutrol ont été injectés IV (titer : 1.32 x 1014 GC/mL, 0.05 mL/kg) immédiatement après l’ouverture de BBB dans l’hippocampe. L’animal a ensuite été photographié 30 minutes après l’ouverture du BBB et sacrifié 3 semaines plus tard par perfusion. 10 cryosections de μm ont été rassemblées pour la formation image fluorescente de l’expression de GFP. L’ouverture de BBB était évidente par le contraste de gadobutrol dans l’hippocampe cible(figure 5a,b). En outre, la livraison de gène a été confirmée par l’expression de GFP dans l’hippocampe cible évident par fluorescence verte (figure 5c). Notez qu’à ce stade EBD s’est effacé et n’est évident que dans les ventricules (Figure 5c).
Figure 1 : Configuration du banc FUS. (a) Configuration FUS comprenant le positionneur XYZ, un tuyau en PVC de 30 mm de diamètre pour la fixation du transducteur, le cadre stéréotaxique imprimé en 3D et la pompe à perfusion. b)L’extrémité du tuyau en PVC est plafonnée, et un aimant y est fixé avec de l’époxy. c)Un autre aimant assorti est fixé au centre supérieur du transducteur de haute puissance avec époxy. d) En outre, un autre aimant correspondant est fixé au pointeur pour l’annulation du positionneur en haut et au centre de l’IRM fiducial. e)Le pointeur est éventuellement remplacé par le transducteur de grande puissance et un bain d’eau est couplé à la tête de l’animal avec du gel à ultrasons. f)Le transducteur d’immersion de faible puissance peut être fixé au tuyau en PVC avec le clip transducteur imprimé en 3D. (g)Pour le positionnement, le transducteur est remplacé par le pointeur imprimé en 3D et le positionneur est nulle en haut et au centre de la fiducial IRM. h)Le porte-cadres imprimé en 3D stationnaire permet de retourner l’animal à la même position après l’IRM si plusieurs traitements fus sont nécessaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Cadre stéréotaxique avec IRM fiduciale pour les coordonnées guidées par IRM. a)Lesanimaux sont d’abord placés dans un cadre stéréotaxique imprimé en 3D équipé d’une IRM fiduciale. b)Le cadre est ensuite placé à l’intérieur du lit d’IRM et la distance entre le fiducial (cercle pointillé) et la région du cerveau cible est mesurée à l’aide d’images coronales pour les mesures dorsales/ventrales (D/V) et d’images axiales pour les mesures rostrales/caudales (R/C), la mesure médiale/latérale (M/L) peut être recueillie à partir des deux axes. Les animaux sont gardés dans le cadre et transférés à la station FUS où un pointeur est utilisé pour annuler le positionneur XYZ à l’emplacement du fiducial. Le pointeur est ensuite remplacé par le transducteur et peut ensuite être déplacé en fonction des coordonnées collectées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le colorant bleu Evans (EBD) confirme l’ouverture du FUS BBB avec et sans perfusion. (a) Micrographe d’une section cérébrale de 10 μm 2 heures après l’ouverture du FUS BBB avec le transducteur d’immersion de faible puissance ciblé sur l’hémisphère gauche médial. Il s’agit d’une image représentative d’un animal qui a été perfusé avec 4% de formaline tamponnée avant la collecte des tissus. L’ouverture de BBB est évidente par l’autofluorescence rouge d’EBD (flèche). b)Micrographe d’une section cérébrale de 10 μm 2 heures après l’ouverture du FUS BBB ciblée sur l’hémisphère gauche antérieur. Il s’agit d’une image représentative d’un animal qui n’a pas été perfusé avant la collecte des tissus par conséquent, EBD reste dans les vaisseaux sanguins. L’ouverture de BBB est évidente où EBD a fui des vaisseaux sanguins (flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Ouverture de FUS BBB confirmée avec le contraste de MRI de Gadobutrol et l’expression d’EBD. Images MR avant (a et d) et après (b et e) ouverture BBB. l’amélioration de contraste de gadobutrol confirme l’emplacement de l’ouverture de BBB in vivo(b et e,flèches). (c) section cérébrale de 10 μm montrant une confirmation supplémentaire de l’ouverture de BBB avec autofluorescence EBD (rouge) dans l’hippocampe (tache nucléaire BLEUE DAPI). Barre d’échelle; 500 μm. (f) Micrographe d’une section cérébrale de 10 μm suivant l’ouverture de BBB dans le cortex cingulaire antérieur évident par autofluorescence rouge EBD (flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Livraison localisée d’AAV9-hsyn-GFP à l’hippocampe par l’ouverture du FUS BBB. Confirmation d’IRM de l’ouverture de BBB avec l’agent de contraste de MRI, contraste de MRI (flèches) dans les images coronal (a) et axiale (b) T1-weighted. c) confirmation histologique de l’expression de GFP dans l’hippocampe ciblé de FUS (vert) 3 semaines après l’ouverture de FUS BBB et l’injection d’AAV9-hsyn-GFP IV. Le bleu indique la tache nucléaire de DAPI pour la morphologie cellulaire globale. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici nous avons décrit une approche de benchtop au microbubble a aidé FUS BBB ouverture avec des approches alternatives comprenant, deux transducteurs différents et méthodes pour le ciblage intracrânal avec et sans guidage de MRI. Actuellement, afin d’établir l’ouverture fus BBB guidée par IRM dans le laboratoire, il ya la possibilité d’acheter d’excellents appareils prêts à l’emploi qui fournissent des résultats hautement standardisés et reproductibles avec des interfaces conviviales. Cependant, de nombreux laboratoires ne sont pas préparés au coût de ces instruments. Par conséquent, l’objectif principal de ce protocole est de fournir un point de départ que n’importe quel laboratoire pourrait établir afin de développer leur expertise dans la technique.
Fus BBB ouverture est maintenant une technique largement utilisée et il est souvent le cas que différents groupes utilisent une variété d’agents et d’anesthésiques, dont chacun peut affecter le degré d’ouverture bbb et d’extravasation. Fait important, l’anesthésie particulière utilisée peut affecter l’ampleur de l’ouverture bbb il est donc important d’en tenir compte lors de l’exécution de ceprotocole 38. Ici, l’isoflurane anesthésique est utilisé parce que les animaux peuvent être maintenus sous isoflurane pour la longueur du protocole et les niveaux de gaz isoflurane peuvent être facilement ajustés en fonction de la fréquence respiratoire de l’animal et la fréquence cardiaque. En outre, nous avons livré de l’isoflurane avec de l’oxygène parce qu’il était plus accessible que l’air médical; cependant, l’air médical peut permettre l’ouverture plus étendue de BBB39. Certains agents de contraste IRM sont plus appropriés pour ce protocole que d’autres. Par exemple, dans nos mains, gadoteridol n’a produit aucune amélioration de contraste même quand la fuite d’EBD était clairement présente dans l’autopsie de tissu. La formulation de microbubble est également importante. Ici, nous utilisons des microsphères lipidiques perflutren. D’autres formulations de microbubble telles que les microbobbles de type protéine A perflutren sont facilement disponibles, mais le type de microbobble utilisé affectera les résultats15.
Les commandes des générateurs de fonction peuvent varier un peu, alors référez-vous au manuel pour des instructions sur la façon d’entrer les paramètres énumérés dans l’étape 1. La tension de commande appropriée (v pic à pic sur le générateur de fonction) dépend fortement des propriétés transducteurs, gain d’amplificateur RF, amplificateur RF à l’appariement transducteur, l’âge et la taille de l’animal, le type de microbubble et la concentration, et l’effet de traitement désiré. Le pic au pic V devra être déterminé par tâtonnements. Commencez par les paramètres suggérés à l’étape 1 et déterminez l’effet histologiquement. S’il y a des lésions tissulaires, abaissez le pic pour atteindre un maximum de V de 10 % et réessayer. De même, s’il n’y a pas de BBBO, augmentez le pic pour atteindre un pic V de 10% et réessayer. Le réglage trop élevé d’un V peut endommager le transducteur d’immersion de faible puissance. Cela sera évident comme une fissuration ou une distorsion du visage transducteur. Les délais de fabrication sur les transducteurs peuvent être longs, donc lors du démarrage, nous vous suggérons d’acheter plus d’un transducteur comme une sauvegarde. Les transducteurs à ultrasons peuvent également endommager les amplificateurs s’ils sont mal appariés. Pour plus de simplicité et de fiabilité, nous vous suggérons d’utiliser un amplificateur de puissance robuste qui peut générer des charges complexes (comme l’amplificateur de puissance RF dans la table des matériaux). Notez que si le transducteur de haute puissance est livré avec un circuit assorti, le transducteur d’immersion de faible puissance ne le fait pas. L’amplificateur RF suggéré peut gérer la puissance réfléchie du transducteur mal assorti, mais certains amplificateurs peuvent être endommagés dans cette configuration. En outre, si l’étape 2.7 s’avère problématique après l’installation du pilote et du logiciel, vérifiez que le port de série approprié est sélectionné dans le logiciel. Ensuite, essayez un câble de série différent. Si cela échoue, puis demander un soutien local it.
Par expérience, il faudra de la pratique et de multiples ajustements pour atteindre une précision serrée dans le ciblage de la région du cerveau. Cela se voit dans les différences de ciblage entre les premières expériences (figure 3) et les expériences les plus récentes (Figure 5). Nous avons commencé les expériences à l’aide d’un cadre stéréotaxique classique et nous l’incluons comme une option ici s’il n’y a pas d’accès à une imprimante 3D ou s’il n’y a pas d’accès à l’IRM des rongeurs. Cependant, mri-guidance avec irm fiducials et le cadre imprimable 3D fourni (ou d’une conception personnalisée) est la méthode idéale. Tout d’abord, il explique les différences individuelles entre les animaux en recueillant des coordonnées à l’intérieur de l’animal plutôt que de s’appuyer sur un atlas moyen du cerveau des rats. En outre, l’utilisation de l’IRM permet la confirmation de l’emplacement FUS ciblage in vivo plutôt que de s’appuyer sur l’expression post mortem EBD. Ceci est important lors de la livraison d’agents qui peuvent nécessiter plus de 24 heures pour prendre effet comme les AAV (Figure 5). Enfin, le support de cadre fourni permet de ramener l’animal à la même position après l’IRM pour corriger les erreurs de ciblage ou de répéter fus après ouverture BBB insuffisante sans avoir à refaire les coordonnées. Le cadre stéréotaxique portable imprimé en 3D peut être utilisé dans n’importe quelle IRM avec un alésage clair de 200 mm ou plus.
Selon la distribution des vaisseaux sanguins dans l’emplacement cible, l’épaisseurdu crâne 40, la présence de ventricules, et d’autres facteurs le degré d’ouverture BBB peut varier. Pour cette raison, nous fournissons une méthode pour le ciblage répété avec le cadre et le support du cadre. L’exactitude du ciblage dépend de façon critique du maintien de la mise au point du transducteur à un endroit cohérent par rapport au pointeur de ciblage. La pointe de ce pointeur doit indiquer l’emplacement dans l’espace du centre de la mise au point du transducteur lorsque le transducteur est fixé au positionneur XYZ. Les aimants permettent au pointeur et au transducteur d’être facilement échangés tout en maintenant cette colocalisation. Le trou et la saillie dans les aimants doivent correspondre aussi précisément que possible. Toute variabilité de cette connexion réduit la répétabilité du ciblage de mise au point FUS. Cependant, il y aura un décalage spatial entre la pointe du pointeur et la mise au point de l’ultrason. Une fois qu’il est confirmé que le décalage est cohérent, il peut être corrigé en utilisant les images MR pour calculer la différence en mm de l’emplacement d’ouverture BBB résultant (emplacement du contraste IRM) et l’emplacement cible prévu. Cette différence peut ensuite être prise en compte dans l’emplacement nul. La précision et la répétabilité bénéficient également grandement de l’utilisation de la même fréquence d’ultrasons et de l’utilisation de rats d’une taille et d’un âge similaires dans un ensemble donné d’expériences. L’atténuation par ultrason par le cerveau de rat et le crâne de rat varie avec la fréquence et la taille de crâne et l’épaisseur de crâne varie selon l’âge. Le crâne est également une petite cavité en ce qui concerne l’impulsion ultrasonique et l’échographie incidente interagit avec les réflexions à l’intérieur du crâne pour produire un champ sonore complexe qui dépend du tissu, du crâne, de la fréquence et de la position du transducteur40.
Comme indiqué ailleurs, ce protocole vise à fournir une alternative à faible investissement à d’excellentes solutions commerciales compatibles IRM qui sont déjà disponibles à l’achat. Il y a d’importantes limites qui résultent du maintien du coût bas. Il y a aussi des limites inhérentes à la technique donnée à la physique et à l’état actuel de l’art. Remarquablement, en dépit de ces limitations, et comme indiqué dans les résultats représentatifs, nous pouvons réaliser la livraison cohérente des dyes, des particules, et des virus à l’hippocampe des rats avec la précision de submillimètre. Les limitations les plus importantes sont que (1) la forme de l’accent FUS dépend du tissu intermédiaire et surtout de la forme et de l’épaisseur du crâne{...}. La nécessité d’enlever l’animal de l’IRM pour effectuer le traitement fus empêche la rétroaction en temps réel sur la localisation et l’intensité de l’accent FUS. Sans cette rétroaction en temps réel, plusieurs expériences doivent être faites pour confirmer le paramètre pour chaque combinaison d’emplacement de ciblage. Une fois que les paramètres sont « composés », nous avons trouvé une bonne répétabilité. (2) Le système de positionnement et de fiducial XYZ tel qu’il est construit, bien que précis, ne fournit pas de précision dans le cadre de coordonnées du positionneur d’une expérience à l’autre. Les emplacements relatifs de la maison XYZ, le crâne du rongeur, et le cadre peuvent se déplacer les uns par rapport aux autres de l’expérience à l’expérience. Ceci est obvié en utilisant une image IRM pour le ciblage, un pointeur de ciblage et fiducial avec un emplacement connu dans l’espace par rapport à la mise au point FUS, en s’assurant que le système de coordonnées IRM est parallèle au système de positionneur XYZ, en faisant des traitements d’essai avant l’ensemble des traitements réels et en faisant l’ensemble de la procédure en une seule session afin que l’animal n’a pas besoin d’être repositionné dans le cadre. Notez que, parce qu’un seul fiducial est utilisé, les rotations de trame ne sont pas corrigeables, il est donc essentiel de s’assurer que le cadre est de niveau par rapport au lit d’IRM et à l’alésage. En résumé, l’emplacement du pointeur n’indique pas la véritable mise au point fus, mais nous avons constaté que le décalage est cohérent pour un emplacement donné du cerveau à condition que le crâne ne tourne pas par rapport au transducteur ultrasons. Notez également que le moment cohérent de la livraison de gadobutrol par rapport à l’ouverture bbb et l’imagerie est cruciale pour des résultats cohérents, surtout si le changement de contraste IRM est utilisé comme un proxy pour la quantité d’ouverture BBB (voir 36).
Nous avons commencé fus BBB ouverture dans le laboratoire avec le transducteur d’immersion de faible puissance décrit ci-dessus. Nous avons constaté qu’il s’agit d’une option abordable pour commencer avec cette technique. Plus important encore, l’adaptation de ce protocole peut fournir une alternative non invasive à la chirurgie stéréotaxique intracrânienne et la recherche préclinique effectuée avec cette technique peut être considérée comme hautement translationnelle en raison de l’utilisation actuelle de fus transcrânienschez l’homme 30,32,41. Une fois établie dans un laboratoire, cette technique peut être utilisée comme alternative non invasive à la chirurgie stéréotaxique. Ainsi, transformer un outil strictement d’investigation en un outil hautement translationnel. Notre laboratoire utilisera cette technique pour l’IRM guidée, la livraison localisée de virus et de nanoparticules pour développer de nouvelles techniques de neuromodulation non invasives qui peuvent être utilisées dans le comportement libre des rongeurs éveillés et des primates non humains. Les travaux actuels se concentrent sur les médicaments de conception exclusivement conçus pour les récepteurs concepteurs (DREADDs) et la sensibilisation des neurones à de faibles doses de particules à haute énergie telles que les rayons X. Le laboratoire travaille également sur une nouvelle version de ce protocole qui peut être effectuée dans un scanner humain à 3 T afin d’éliminer la nécessité de déplacer l’animal pendant le traitement et de permettre une rétroaction de ciblage en temps réel.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été appuyée en partie par une subvention du FNSE pour l’infrastructure de recherche EPSCoR à l’Université Clemson (1632881). En outre, cette recherche a été soutenue en partie par le Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Les auteurs reconnaissent avec gratitude l’utilisation des services et des installations de l’Université de l’Alabama à Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Les auteurs reconnaissent Rajiv Chopra pour son soutien et ses conseils.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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