Summary
Vi presenterer en protokoll for isolering av endokardiale og koronar endotelceller fra rottehjerter gjennom sekvensiell vevfordøyelse i fordøyelsesbuffer, cellesamling fra tilbakevendende sentrifugesykluser og cellerensing ved hjelp av antirotte CD31 mikroperler.
Abstract
Det har vist seg at endokardiale endotelceller (EECs) og koronar endotelceller (CECer) varierer i opprinnelse, utvikling, markører og funksjoner. Følgelig spiller disse to cellepopulasjonene unike roller i hjertesykdommer. Nåværende studier som involverer isolerte endotelceller undersøker cellepopulasjoner bestående av både ECs og CECs. Denne protokollen skisserer en metode for selvstendig å isolere disse to cellepopulasjonene for cellespesifikk karakterisering. Etter innsamling av venstre og høyre ventrikulær fri vegg, er endotelceller fra den ytre overflaten og indre overflate separat frigjort ved hjelp av en fordøyelsesbufferløsning. Den sekvensielle fordøyelsen av den ytre overflaten og det indre endokardiale laget beholdt separasjonen av de to endotelcellepopulasjonene. Den separate isolasjonen av ECer og ADMINISTRERERe verifiseres ytterligere ved identifisering av markører som er spesifikke for hver populasjon. Basert på tidligere publisert enkeltcelle RNA profilering i musehjertet, npr3, Hapln1, og Cdh11 genuttrykk er unikt for EECs; mens Fabp4, Mgllog Cd36 genuttrykk er unikt for CECer. qPCR-data avslørte beriket uttrykk for disse karakteristiske markørene i sine respektive prøver, noe som indikerer vellykket EEC- og CEC-isolasjon, samt vedlikehold av cellefenotype, noe som muliggjør ytterligere cellespesifikk funksjonsanalyse.
Introduction
Denne artikkelen gir en detaljert protokoll (modifisert fra Gladka et al.1) for disseksjon og påfølgende isolering av endokardial edothelial celler (EECs) og koronar endotelceller (CECer) fra rottehjerter. Evnen til å undersøke disse cellepopulasjonene uavhengig ville gjøre det mulig å utforskningen av celletypespesifikke mekanismer som ligger til grunn for en rekke hjertesykdommer som kan tjene som potensielle terapeutiske mål. En vellykket metode for innsamling av disse cellepopulasjonene uavhengig har imidlertid ennå ikke blitt publisert.
CECs avvike fra EECs i forhold til deres opprinnelse, markører, og funksjoner under hjerteutvikling og sykdom1,2,3,4,5,6,7. EECs stammer fra ventraloverflaten av hjertemesutsen3. De oppstår fra Flk1+ stamceller som svar på VEGF og HIF signalisering og danner det innerste laget av de tre diskrete regionene i utviklingshjertet: atrium, ventrikkel og sinus venosus3,6. Genetisk avstamning sporing tyder på at pluripotente endokardiale celler av sinus venosus utlede venøse celler, som migrerer for å danne subepikardial lag3. Deretter skiller det subepikardiale laget til koronararterier og årer, inkludert CECer, som forblir over den perifere ventrikulære frie veggen3,4. Denne endokardial til endotelveien er regulert av VEGFC, ELA / APJ, og SOX17 signaliserer3,4,6,8,9. Den ventrikulære endokardiet utleder færre CECer i interventrikulær septum med en ukjent mekanisme3. Deretter foreslås lokalisert differensiering mellom EECer og CECer av markører som er spesifikke for disse to cellepopulasjonene, inkludert Mgll, Fabp4 og Cd36-uttrykk i CECer, eller Npr3, Cdh11 og Hapln1-uttrykk i EECs3,5,10.
EECs og CECer spiller forskjellige roller i hjertefunksjon. Endokardial til mesenchymal overgang, ventildannelse, kammermodning, utstrømningskanalregulering og atrioventrikulær kanalutvikling er betinget av EECs6. Alternativt bidrar CECer til vasomotoriske tone og betennelse i koronararterier11. Disse avvikene i funksjonen resulterer i individualiserte roller i sykdomsutvikling4,12. For eksempel tyder bevis på at funksjonsfeil EECs kan føre til medfødt ventil sykdom6, noncompaction myocardium6, atrioventrikulær septal effekt6, endokardial fibroelastosis13, hypoplastisk venstre hjerte syndrom13, ventrikulær hypoplasi13, og hjerte hypertrofiofi12. Tilsvarende, studier har funnet at unormale CECs bidra til koronarsykdom14 og trombose11.
Vellykket isolering av EECs og CECs er nødvendig for å oppnå omfattende kunnskap om disse to cellepopulasjonene, som kan benyttes i både forskning og kliniske miljøer. Bestemme vekst og differensiering faktorer av disse cellepopulasjoner ville gi en referanse for differensiering av endotelsubtyper fra indusertpluripotente stamceller (iPSCer). Videre er fullstendig identifisering av avvikene i utvikling, regulering og funksjon av ECs og CECs avgjørende for å forstå genomiske og epigenomiske faktorer som er ansvarlige for mange hjertesykdommer på en celletypespesifikk måte. Denne artikkelen beskriver trinn for vellykket samling av ECer og ADMINISTRERERe uavhengig, og gir bevis for separasjon ved å vurdere genuttrykksnivåene til celletypespesifikke markører.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC31608) ved Stanford University.
1. Utarbeidelse av buffere
- Klargjør fordøyelsesbufferen ved hjelp av reagensene som er oppført i tabell 1.
- Forbered DNase I lagerløsning: Oppløs DNase I i RNase-fritt vann for en lagerløsning på 2000 enheter/ml (1 mg/ml). Aliquot og lagre lagerløsningen ved -20 °C.
- Forbered liberaseløsningen: Løs opp liberase med RNase-fritt vann til en lagerløsning på 5 mg/ml. Roter den på en rullebank ved 4 °C i 30 min. Aliquot og oppbevar aksjeløsningen ved -20 °C.
- Forbered sorteringsbufferen ved å fortynne 0,5 M etylendiaminetalacetatsyre (EDTA) og 10 % storfeserumalbumin (BSA) med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) for en endelig konsentrasjon på 2 mM EDTA og 0,5 % av BSA.
2. Hjerte samling
MERK: Seks Sprague Dawley rotter som veide 50-100 g ble brukt i denne protokollen. Ingen kjønnsforskjell ble observert.
- Euthanize rotten med CO2 og plasser den i en supine posisjon på en dissekering plattform. Pin ekstremitetene ned og steriliser både magen og brystet med 70% etanol.
- Åpne magen med saks og sett en 21 G nål inn i den delen av bakre vena cava som ligger bak tarmene. Trekk sprøytestempelet tilbake, trekk blodet fra venen til leveren ser lettere ut i fargen og ikke mer blod kan trekkes tilbake, noe som indikerer tilstrekkelig fjerning av blod.
- Bruk saks, åpne brystet nøye for å unngå å skade lungene og hjertet. Løft aortabuen/atriet med tang og kutt aorta, lungearterien, lungevenene og vena cava for å frigjøre og fjerne hjertet.
- Vask hjertet med 50 ml kald 1x Hanks' balanserte saltoppløsning (HBSS) buffer 3x for å fjerne for mye blod.
- Under et mikroskop for mikrodisseksjon fjerner du den høyre ventrikulære frie veggen i et 5 ml rør som inneholder Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (Figur 1A,B).
- Legg hjertet på sin flatere, bakre ansikt for å identifisere venstre og høyre side.
- Finn lungearterien, den mest fremre av venene og arteriene som forgrener seg fra toppen av hjertet og skjær gjennom lungearterien ned til høyre ventrikulær kammer. På hjertets fremre ansikt, kutt langs septumet til du når toppen. Fortsett å kutte fra toppen opp den bakre siden av hjertet langs septumet til lungearterien og høyre ventrikulær kammerknutepunkt (Figur 1A).
- Fra lungearterien og høyre ventrikulær koblingspunkt, kutt både fremre og bakre side av hjertet vinkelrett til forrige disseksjon og bort fra septum, til høyre ventrikulær fri vegg frigjøres fra resten av hjertet (Figur 1B).
- Under mikrodisseksjonsmikroskopet fjerner du den venstre ventrikulære frie veggen i et 5 ml rør som inneholder DMEM (Figur 1C,D).
- Finn aorta, forgrening fra toppen av hjertet bak lungearterien, og gjenta metoden som er beskrevet i trinn 2.5 for å kutte av venstre ventrikulær fri vegg.
3. EEC fordøyelse
- Plasser både høyre og venstre ventrikulære frie veggvev i en 60 cm kulturrett med den indre overflaten liggende flatt, vendt ned (Figur 2).
MERK: Den indre overflaten er innsiden av det litt konkave formede ventrikkelen som vist i figur 2A,C. - Tilsett 0,5–1 ml fordøyelsesbuffer til parabolen, plasser spissen av pipetten direkte under vevet. Fortsett til bare den indre overflaten er nedsenket.
- Inkuber parabolen i en 5% CO2,37 °C inkubator i 5 min.
- Legg EC medium til kulturretten for å stoppe fordøyelsen.
MERK: Oppbevar mengden fordøyelsesbuffer til EC-medium som et 1:5-forhold. - Bruk en 1 ml pipette til å skylle den indre overflaten av ventriklene med EC-medium og overføre avrenningen til et 50 ml oppsamlingsrør gjennom en 40 mm sil (figur 2E). Oppbevar samlingene på is for nedstrøms rensing.
4. CEC fordøyelse
- Skjær langs den ytre overflaten av venstre ventrikkel uten forurensning fra det indre laget (Figur 2B,D) og legg hver i et eget 5 ml rør som inneholder 1 ml fordøyelsesbufferen.
MERK: Venstre ventrikkel kan identifiseres som den tykkere ventrikkelen, og den ytre overflaten kan bestemmes som det ytre ansiktet til det litt konkave ventrikkelen. - Ved hjelp av disseksjonsaks, hakk ventrikulær veggen i små, 1 mm3 stykker.
- Inkuber røret i et 37 °C vannbad i ca. 15–20 min. Vortex hver 2–3 min.
- Pipette 4 ml EC-medium inn i 5 ml røret for å avslutte fordøyelsen.
- Overfør oppløsningen med en 5 ml serologisk pipette til et 50 ml rør gjennom en 40 mm sil (Figur 2E). Oppbevar samlingene på is for nedstrøms rensing.
5. Cellesamling
- Sentrifugerrørene på 300 x g i 10 min ved romtemperatur (RT) og deretter aspirere supernatanten.
- Hvis pelleten fremstår rød, må pelleten suspenderes i 1–2 ml 1x lysbuffer (RBC) lysing buffer (Figur 2F).
MERK: Hvis det ikke er noen RbCer, går du videre til trinn 6. - Inkuber rørene i et 37 °C vannbad i 5 min.
- Pipette 10 ml PBS i 50 ml rør for å stoppe lysis.
- Sentrifugerrørene på 300 x g i 10 min ved RT, og deretter aspirere supernatanten.
6. EF-sortering
- Tilsett 90 μL sorteringsbuffer og 10 μL anti-CD31 PE-antistoff i 50 ml rørene.
- Vorrørsrørene og inkuber dem i 10 min i et kjøleskap på 4 °C.
- Tilsett 10 ml sorteringsbuffer i rørene, bland godt, og deretter sentrifuge på 300 x g i 10 min ved RT.
- Aspirer supernatanten og resuspend pellet en 80 μL sorteringsbuffer og 20 μL anti-PE mikroperler.
- Vortex rørene og inkuber ved 4 °C i 15 min.
- Vask cellene ved å legge til 10 ml sorteringsbuffer i rørene, bland godt, og deretter sentrifuge dem på 300 x g i 10 min på RT.
- Aspirer supernatanten og resuspend pellet en 500 μL sorteringsbuffer.
- Plasser en kolonne som inneholder superparamagnetiske sfærer i en magnetisk separator og skyll kolonnen med 3 ml sorteringsbuffer.
- Når kolonnen er "flow stop", pipette 500 μL av cellesuspensjonen i kolonnene og vask deretter kolonnene med sorteringsbuffer. Gjenta vasken 3x, hver med 3 ml sorteringsbuffer (Figur 2G).
- Fjern kolonnene fra skilletegnet og plasser dem på toppen av et nytt 15 ml samlingsrør.
- Med en pipette legger du til 5 ml EC-medium til kolonnene, og driver løsningen gjennom ved hjelp av et kolonnestempel.
- Sentrifugerer oppsamlingsrørene på 300 x g i 10 min på RT og deretter aspirere supernatanten.
- Trekk ut RNA fra cellepelleten til EEC- og CEC-prøvene ved hjelp av et sett, etter produsentens instruksjoner. Minimum 500 ng av RNA kan oppnås.
MERK: Etter RNA-ekstraksjon kan prøven oppbevares ved -80 °C. - Omvendt transkribere 500 ng av RNA for å få cDNA ved hjelp av en tilfeldig primer og et sett, etter produsentens instruksjoner.
- Utfør kvantitativ PCR for validering av endokardiale og endotelpopulasjoner (figur 2H). Primersekvenser er oppført i tabell 2.
- Tilsett 5 μL EEC eller CEC cDNA (1 ng/μL) i brønnene på en 384 qPCR-plate. Tilsett EEC eller CEC cDNA i nok brønner slik at det er tre brønner per antall primere.
- Bland 6 μL 2x qPCR SYBR grønn buffer med 0,5 μL av hver 10 μM primer, inkludert både forover og revers primerer, og legg dem i en enkelt brønn som tilsvarer hvert kandidatgen.
- Forsegle platen med plastfilm og sentrifuge i 1 min ved 300 x g ved RT.
- Plasser platen i en qPCR-maskin, og start deretter programmet ved 95 °C i 3 min, etterfulgt av 95 °C i 15 s, deretter 55 °C i 60 s. Gjenta de påfølgende to trinnene i 45 sykluser.
Representative Results
Prosessen med EEC- og CEC-isolasjon er beskrevet i figur 2. Den vellykkede isoleringen av EECs og CECer ble bestemt ved å vurdere tilstedeværelsen av pan-endotelcellemarkører, samt de som er forskjellige for de to undertypenpopulasjonene. Som spådd, qPCR viste at βi forhold tilβ-actin, EECs uttrykt høyere nivåer av endokardial markører Npr3, Hapln1, og Cdh11 sammenlignet med CECs (Figur 3A). På samme måte uttrykte CECer høyere nivåer av koronarmarkører Fabp4, Mgllog Cd36 sammenlignet med EECs (Figur 3B). I tillegg uttrykte både EECer og CECer pan-EC-markørgenet Cdh5, med litt høyere nivåer i CEC (figur 3C).
Figur 1: Diagram av hjertedisseksjon. (A) Først kuttet laget for å skille høyre ventrikkel fri vegg fra septum. (B) Andre kutt laget for å frigjøre høyre ventrikkel helt. (C) Først kuttet laget for å skille venstre ventrikkel fri vegg fra septum. (D) Andre kutt laget for å frigjøre venstre ventrikkel helt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Diagram over fordøyelsesoppsett av CECer og ECer og følgende ordning for cellesortering. (A) Innerst fri ventrikulær vegg og (B) ytterste ventrikulær fri vegg var (C) nedsenket i fordøyelsesbuffer eller (D) fordøyd i fordøyelsesbufferhet. (E) Innsamling og filtrering av celleløsninger etterfulgt av (F) røde blodlegemer (RBC) lysis og (G) magnetisk aktivert cellesortering (MACS) ved hjelp av CD31-antistoffet. (h) Rensede ECer ble behandlet for genuttrykksverifisering ved hjelp av qPCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: qPCR-data som bekrefter isolering av CECer og ECer. (A) Genuttrykksnivåer av EEC-markørene Npr3, Cdh11og Hapln1 i ECs og CECer ble kvantifisert av sanntids PCR. (B) Genuttrykksnivåer av CEC-markørene Mgll, Fabp4og Cd36 i EECs og CECer ble kvantifisert av sanntids PCR. (C) Pan-EC-markøren Cdh5 ble kvantifisert i ECs og CECer av sanntids PCR. (n = 3 i hver gruppe). Stolper representerer gjennomsnitt ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 vs. EEC, uparet t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tabell 1. Fordøyelsesbuffer (1,5 ml) | |||
| Lager Con. | Endelig Con. | Volum | |
| Liberase TM | 5 mg/ml | 0,5 mg/ml | 150 ul (150 ul) |
| Dnase Jeg | 1 mg/ml | 20 ug/ml | 30 ul (andre er i kua) |
| HEPES (ANDRE) | 1 M (andre kan være på denne | 10 mM (andre kan være på siden) | 15 ul (andre kan være på samme tid) |
| DMEM (andre er i seg selv) | - | - | 1305 ul (1305 ul) |
Tabell 1: Oppskrift på fordøyelsesbufferen.
| Tabell 2. Primer Sekvenser | ||
| Gennavn | Frem | Omvendt |
| Npr3 (andre er i sin pris | TCCTTGCAAATCATGTGGCCTA (Andre) | En maskinoversatt eller Community-utgitt i «den amerikanske ...vi den ble imidlertid foreføring av den amerikanske |
| Cdh11 (andre er i verden) | GTGAATGGGACTGGGACTGG | Gtaatttctggcccttgc (Nær GTAATTTCTGGCCCTTGC) |
| Hapln1 (andre er i seg selv) | CcaGCTAAGTGGGACTCGAAG | En maskinoversatt eller Community-hotell som er skrevet av Eno, fra O.M. |
| Mgll (andre) | Cccggggcccaaagac (andre er i seg selv) | Gaagatgagggccttgggtg (andre kan være på engelsk) |
| Fabp4 (andre er i dag) | AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG | Actctctgaccggatgacga |
| Cd36 (andre kan være på denne siden) | GCAAAACGACTGCAGGTCAA (andre kan være på engelsk) | CCCGGTCACTTGGTTTCTGA (andre kan være på vei mot |
| Cdh5 (andre er i verden) | Ccattgagacagaccccgac | TGTGGAACGTGTACTGCTGG (Nær TGTGGAACGTACTGCTGG) |
| B-actin (andre er i gang med å | TCTGTGGATTGGTGGCTC (Andre) | CGGACTCATCGTACTCCTGC (andre er i gang med å |
Tabell 2: Primer sekvenser
Discussion
CECs og EECs varierer i opprinnelse, markører og funksjoner, og dermed kan spille unike roller i utvikling og sykdom. Eksisterende protokoller for endotelcelleisolerisoleriksjon er begrenset til makrovaskulært vev, og forsømmer samlingen av ECer, og begrenser dermed studien av CEC- og EEC-spesifikke funksjoner. Det er viktig å isolere og studere disse to populasjonene uavhengig, da denne kunnskapen vil gi en referanse for differensiering av iPSCer til CECs og EECs for fremtidige studier og lette undersøkelsen av disse cellepopulasjonene for potensielle terapeutiske mål for ulike hjertesykdommer. Denne nye protokollen skisserer en metode for isolering av EECs fra den indre overflaten og CECer fra den ytre overflaten av ventrikulær fri vegg av voksne rotter.
Det er avgjørende å kontrollere timingen for hvert trinn veldig nøyaktig i denne protokollen. Fordi antall eecs er svært begrenset i rotte hjertevev, vi minimert fordøyelsen tid av det indre laget av hjertet for å hindre cellulær skade og enda viktigere, CEC forurensning. Umiddelbar tilsetning av EC-mediumløsningen for å avslutte den enzymatiske reaksjonen er også svært viktig for å opprettholde høy cellelevedyktighet. En rød pellet etter celleinnsamling antyder tilstedeværelsen av et stort antall RBC-er. Avhengig av mengden RBC-kontaminering, kan 1–2 ml RBC lysisbuffer legges til for å forringe RBCene. Inkubasjon må være nøye tidsbestemt for å unngå betydelig skade på cellene, og PBS blir umiddelbart lagt til for å avslutte reaksjonen. Ved hjelp av den nåværende protokollen kunne vi isolere 105 EECer fra seks rottehjerter. Disse cellene kan ses på en cellekulturrett for ytterligere ekspansjon og karakterisering.
Når du forbereder vevet for fri vegg samling, hjertet ble vasket med HBSS å fjerne flertallet av de gjenværende RBCs. HBSS er det anbefalte mediet på grunn av sin klare utseende, som gjør det mulig å visualisere blodceller, i motsetning til DMED inneholder fenol rød. Sammensetningen av fordøyelsesbufferen sikrer tilstrekkelig frigjøring av endotelceller, hvor liberase fordøyelsesenzymer strimler vevet til de eksponerte cellene, DNase Jeg eliminerer DNA fra de døde cellene for å fremme celleavløsning som kan hemmes av DNA-limkvalitet, HEPES-bufferbalanserer pH, og DMEM er et modifisert basalmedium med en høyere konsentrasjon av aminosyrer og vitaminer for bedre cellevedlikehold og inneholder kalsiumsom er nødvendig for å aktivere liberase.
Ifølge encellede RNA sekvensering (scRNA-seq) hentet fra både menneskelig15 og musehjerte10, ble flere markører tilskrevet spesifikke EC populasjoner rapportert. Vi valgte noen av de mest berikede genene for å undersøke renheten av isolerte EECer (dvs. Npr3, Cdh11og Hapln1) og EECs (dvs. Mgll, Fabp4og Cd36). I βforhold tilβ-Actin, Npr3, Cdh11, og Hapln1 markører demonstrertøkt uttrykk i EECs sammenlignet med CECs. På samme måte var uttrykket for Mgll, Fabp4og Cd36 markører større i ADMINISTRERE-enheter sammenlignet med EECs. De unikt uttrykte markørene for hver prøve er i samsvar med markører som er karakteristiske for henholdsvis ECer og ADMINISTRERENde direktører, noe som indikerer vellykket isolasjon.
Den nåværende protokollen kan imidlertid ikke utelukke krysskontaminering mellom de to EC-populasjonene under isolasjonen, selv med nøye kontrollerte sekvensielle fordøyelser. Derfor kan noen celleoverflatemarkører brukes for ytterligere rensing. For eksempel merker NPR3 vanligvis endokardiet10, mens APJ kan spore et flertall av CECene16. Fordi disse to markørene uttrykkes på celleoverflaten, kan de brukes til fluorescensaktivert cellesortering (FACS), og antistoffer som brukes til å rense forskjellige EC-populasjoner ytterligere. I tillegg kan menneskelig15 og mus10 hjerte scRNA-seq bekrefte berikelse av Npr3 i EECs, og Cd36 kan potensielt brukes for CEC rensing.
Til slutt skisserer den presenterte protokollen den uavhengige isolasjonen av ECs og CECer fra rottehjertet. Omfattende identifisering av cellulære egenskaper, aktivert av celleisolasjon, kan brukes til betydelige nedstrømsapplikasjoner.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne setter stor pris på Dr. Lingli Wang for hennes hjelp med dyreprotokollen, og Department of Pediatrics ved Stanford for infrastrukturstøtte. Dette arbeidet ble støttet av NIH/NHLBI K99 HL135258 (til M.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
| 15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
| 50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
| 5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
| DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
| Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
| Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
| Strabismus Scissors - Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
| Vannas Spring Scissors - Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |
References
- Gladka, M. M., et al. Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua). Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration. Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).
- Yu, S. Y., et al. Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions. Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner. Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).
- Zhang, H., et al. Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls. Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).
- Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. Endothelial function and coronary artery disease. Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).
- Jacques, D., Bkaily, G. Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy. Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).
- Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).
- Li, Y., et al. Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease. Cardiovascular Research. , (2019).
- Miao, Y., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome. bioRxiv. , (2019).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
