Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kvantitative RT-PCR'er med høj gennemløb i enkelt- og bulk-C. elegans-prøver ved hjælp af nanofluidisk teknologi

Published: May 28, 2020 doi: 10.3791/61132
Automatic Translation
*1, *2,3,5, 1, 1, 1, 2,3,4, 1, 1
1Babraham Institute, 2Gurdon Institute, University of Cambridge, 3Department of Genetics, University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

I denne artikel beskrives en protokol med høj overførselshastighed til hurtig og pålidelig bestemmelse af genekspressionsniveauer i enkelt- eller bulk-C. elegans-prøver. Denne protokol kræver ikke RNA-isolering og producerer cDNA direkte fra prøver. Det kan bruges sammen med high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforme.

Abstract

Dette papir præsenterer en high-throughput omvendt transskription kvantitative PCR (RT-qPCR) analyse for Caenorhabditis elegans, der er hurtig, robust og meget følsom. Denne protokol opnår præcise målinger af genekspression fra enkelte orme eller fra bulkprøver. Protokollen præsenteret her giver en ny tilpasning af eksisterende metoder til supplerende DNA (cDNA) forberedelse koblet til en nanofluidic RT-qPCR platform. Den første del af denne protokol, kaldet 'Worm-to-CT', tillader cDNA-produktion direkte fra nematoder uden behov for forudgående mRNA-isolation. Det øger eksperimentel gennemløb ved at tillade forberedelse af cDNA fra 96 orme i 3,5 timer. Den anden del af protokollen bruger eksisterende nanofluidic teknologi til at køre high-throughput RT-qPCR på cDNA. Dette papir evaluerer to forskellige nanofluidic chips: den første kører 96 prøver og 96 mål, hvilket resulterer i 9.216 reaktioner i ca 1,5 dages bænkarbejde. Den anden chiptype består af seks 12 x 12 arrays, hvilket resulterer i 864 reaktioner. Her demonstreres Worm-to-CT-metoden ved at kvantificere mRNA-niveauer af gener, der koder varmechokproteiner fra enkelte orme og fra bulkprøver. Forudsat er en omfattende liste over primere designet til at forstærke forarbejdede RNA for de fleste kodning gener inden for C. elegans genom.

Introduction

Optimeringen af enkeltcellet RNA-sekventering og qPCR afslørede, at transskriptionelle impulser eller bursts kan føre til massiv variation i antallet af RNA-molekyler pr. celle1. Desuden afdækkede disse teknologier betydelig cellulær heterogenitet, der tidligere blev savnet af standard transskriptionsmålinger. Afhængigt af konteksten er nogle enkeltcellede transskriptionelle variabilitet forårsaget af blandet cellulær sammensætning af væv. Men selv i isogene cellepopulationer dyrket under samme miljø er der udbredt transskriptionel heterogenitet2,3. Denne "biologiske variation" er i stigende grad identificeret som en allestedsnærværende egenskab af cellulære netværk, fra bakterier til mennesker. I nogle tilfælde kan det have fænotypiske konsekvenser i udvikling, kræftprogression, HIV-latenstid og reaktion på kemoterapi4,5.

Nematode Caenorhabditis elegans er en unik modelorganisme med ideelle egenskaber til at studere årsagerne til og konsekvenserne af biologisk variation mellem individer. Disse nematoder er en simpel modelorganisme bestående af 959 celler, og deres gennemsigtige kutikula gør dem modtagelige for in vivo-billeddiagnostiske undersøgelser6. C. elegans er en hermafroditisk art, der overvejende reproducerer gennem selvbefrugtning; dette resulterede i isogene laboratoriestammer. På trods af isogenicitet og kontrollerede kulturforhold er mange fænotyper og udskrifter variable på tværs af individer, hvilket tyder på, at stokastiske eller mikromiljøforskelle bidrager til heterogenitet på tværs af individer7,8. En sådan variation i genekspression har flere fitnesskonsekvenser, herunder variabilitet i mutationernes penetrans, overlevelse, udviklingsmæssig timing og fecundity7,8,9. På grund af disse funktioner giver undersøgelser med en enkelt orm den hidtil usete mulighed for at studere biologisk variation i en hel organisme.

Der er et grundlæggende behov i marken for at udvikle og optimere teknologier til nøjagtig detektion af udskrifter på et enkelt ormniveau. Nye teknologier, såsom enkeltorms-RNA-sekventering10, RNA-sekventering fra isoleret væv11og sekvensering af en enkelt celle12 er nu tilgængelige for C. elegans. Der er dog stadig en stor udfordring: Ved overvågning af interindividualitet falder svagt udtrykte gener ofte under påviselige niveauer13. Dette er især relevant for sjældne udskrifter isoleret fra små mængder udgangsmateriale, da der er et veletableret, omvendt forhold mellem gennemsnitligt udtryk og teknisk varians, hvilket ofte forårsager sjældne udskrifter, der falder under statistiske cutoffs13. Optimeringen af high-throughput multiplexed qPCR teknologier har vist sig nyttig for pattedyr encellede undersøgelser, især når man studerer udtrykket af sjældne udskrifter14,15. Denne teknologi kan også bruges til benchmarking og validering af andre enkeltormsteknologier.

Worm-to-CT er en hurtig, robust metode tilpasset fra et kit, der anvendes i cellebiologi undersøgelser, for enkelt-orm cDNA forberedelse. cDNA opnået ved denne metode kombineret med multiplekseret nanofluidic qPCR-teknologi blev valgt, fordi den giver højere eksperimentel gennemløb, et bredere dynamisk detektionsområde og er blevet valideret til enkeltcelleformål14,15. Det beskrevne cDNA-præparat kan også anvendes sammen med pcr-standardteknologier. Gennemløbet øges på to måder: For det første er cDNA-præparatet hurtigere og mere pålideligt end traditionelt guanidiumthocyanat-phenol-chloroformekstraktion, fordi orme tilsættes direkte til lysisbufferen, hvilket springer direkte isolering af let nedbrydeligt RNA over. For det andet øger brugen af nanofluidiske teknologier betydeligt antallet af prøver og mål, der kan køres samtidigt. I dette papir sammenlignes to chips: en single-array chip og en multi-array chip. En enkelt-array chip kan køre 96 enkelt orme og 96 primer sæt, hvilket resulterer i 9.216 reaktioner pr eksperiment. For at opnå en lignende overførselshastighed ved hjælp af standard qPCR-teknologier ville kræve 96 separate qPCR eksperimenter, ved hjælp af 96 godt plader. Den mindre og mere fleksible multi-array chip består af seks 12 x 12 arrays resulterer i 864 reaktioner. Metodens overlegne pålidelighed og følsomhed forstærkes af nanofluidisk teknologi og af indførelsen af et forforstærkningstrin. Den metode, der præsenteres i dette papir, er beregnet til at blive brugt sammen med en state-of-the-art statistisk algoritme til at udtrække biologisk varians. I denne artikel præsenteres protokollen til hurtig cDNA-forberedelse og qPCR med høj overførselshastighed for både enkeltorms- og batchormeksempler. algoritmen vil blive offentliggjort andetsteds. Til denne protokol skal organiseringen af hver chip forberedes forud for eksperimentet. Tabel 1 og tabel 2 viser eksempler på disse planer for henholdsvis en multi-array og single-array chip. Der er også oversigter over Worm-to-CT-protokollen, der er beskrevet i figur 1, og som kører multi-array- og single-array-chips i Figur 2.

Protocol

BEMÆRK: I hele denne protokol caenorhabditis elegans kaldes "orm" eller "orme". En række C. elegans stammer kan bestilles via online databaser eller ved direkte at kontakte laboratorier, der bruger modellen organisme. Del I i denne protokol (afsnit 1−3) beskriver cDNA-forberedelse via Worm-to-CT-protokollen. Del II i denne protokol (afsnit 4−13) beskriver kørsel med høj overførselshastighed RT-qPCR ved hjælp af nanofluidics, tilpasset fra en protokol udviklet af Fluidigm16. Denne protokol gælder for brugen af de to typer nanofluidic chips defineret tidligere, single-array chip, som kan overvåge 96 mål i 96 prøver (9.216 RT-qPCR reaktioner i alt), eller multi-array chip, der fungerer som underenheder af 12 mål x 12 prøver. Hver multi-array chip indeholder seks uafhængige arrays, der kan køres sammen eller separat. For eksempel kan brug af en hel multi-array chip overvåge 72 mål x 12 prøver (eller omvendt), eller 36 mål x 24 prøver (eller omvendt). Yderligere oplysninger om et af de materialer, der anvendes i denne protokol, finder du i Tabellen over materialer.

1. RT-qPCR primer validering

BEMÆRK: Primere i realtid blev designet ud fra de anbefalede egenskaber, der oprindeligt blev udstedt af MIQUE-retningslinjerne17. For at gøre primere specifikke for forarbejdet RNA blev produkterne designet således, at de to primere bundet til hver side af mindst et splejset kryds. Kravene til egnede primere omfattede 20%−80% guanine- og cytosinindhold, en smeltetemperatur på 58−60 °C, en forskel i smeltetemperatur mellem primerpar på ≤0,5 °C og en produktlængde på 70-120 bp. Rækkefølgen af de genererede primere findes i supplerende tabel 1. Open source-kode for de scripts, der bruges til at generere primere kan findes på https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. Primer par til udskrifter med splejsning steder blev designet således, at de ligger i to exons flankerende en intron, men var ikke designet til at være splejsning-variant specifikke, ved hjælp af NCBI Primer Blast software18. Til denne undersøgelse blev primersættene sprængt mod C. elegans-genomet for at teste for enhver komplementaritet uden for målet.

  1. Hent primere fra databasen over RT-qPCR-primere(supplerende tabel 1). Alternativt kan du designe qPCR primer-par ved hjælp af onlineværktøjer som NCBI Primer Blast18.
  2. Udfør en qPCR-standardkurve for at overvåge specificitet og PCR-effektivitet for hvert par primere ved hjælp af QPCR-standardteknikker19 og efter MIQUE-retningslinjer17,20.
    BEMÆRK: Der bør kun anvendes primerpar med R2 > 0,98 og PCR-effektivitet på mellem 85% og 115%. Sekvensen, PCR-effektiviteten og R2 for de primere, der anvendes i denne undersøgelse, er beskrevet i tabel 3.

2. Orm lysis gennem Worm-to-CT

  1. Vælg ormene fra deres bakterielle græsplæne på en frisk, useedet NGM plade og lad ormene bevæge sig rundt på pladen i 5 minutter for at fjerne de fleste af bakterierne fra ormen gennem dens bevægelse.
    BEMÆRK: Den bakterielle græsplæne og vækstbetingelserne vil variere afhængigt af det eksperimentelle design. De her præsenterede eksperimenter kræver 6 cm NGM plader seedet med OP50 Escherichia coli med orme af interesse dyrket til fase L4.9 i en 20 °C inkubator.
  2. I en RNase-fri emhætte fremstilles en masterblanding bestående af 12,5 μL 2x RT buffer, 1,25 μL 20x RT enzymbuffer og 0,25 μL nukleasefrit vand pr. prøve. Der tilsættes 14 μL masterblanding til 11 μL af hver prøve fra trin 2.8.
  3. Låget på en PCR-strimmel vendes på platformen af dissekeringsomfanget, og lysisblandingen til kuppelformede PCR-rørhætter tilsættes under et sammensat mikroskop.
    BEMÆRK: Med kun en eller to prøver er det bedre at bruge en PCR-strimmel, der indeholder mindst fire rør, da dette reducerer risikoen for, at hætterne sprænges åbne i de efterfølgende fryse-optøningstrin. Alternativt kan elastikker bruges til at holde hætterne på plads. Sørg i så fald for, at hætterne lukkes korrekt, hver gang rørene overføres.
  4. Pluk ormene fra pladen ind i hver åbning af låget, der indeholder lysisblandingen, ved at "skovle" dem (dvs. fange ormene nedenunder med plukket) for at undgå bakteriel forurening. Luk rørene og drej dem ned i 5 s ved hjælp af en bordplade mikrocentrifuge (Tabel over materialer), før du placerer dem i en Dewar kolbe fyldt med flydende nitrogen.
    BEMÆRK: Mellem 15 og 30 orme skal bruges til bulkforsøg og 1 orm til målinger med en enkelt orm.
    ADVARSEL: Ved håndtering af flydende nitrogen slid Cryo-Handsker samt beskyttende briller og overholde standard tøj regler, fordi kontakt med hud eller øjne kan forårsage alvorlig forfrysninger skade.
  5. Fastfrysning af PCR-rørene 10x ved at overføre dem mellem flydende nitrogen og et ~40 °C vandbad. Lad rørene stå i det flydende nitrogen i mindst 5 s for at sikre, at prøverne er helt frosne. Lad rørene stå i vandbadet, indtil prøverne tøer op. Efterlad ikke i en længere periode, da dette fører til RNA-nedbrydning.
    BEMÆRK: Rør kan efterlades i flydende nitrogen i en længere periode, da prøverne fryses til ca. -200 °C, hvilket reducerer RNA-nedbrydningen. Dette bør dog ikke være et protokolstoppunkt, fordi flydende nitrogen fordamper hurtigt.
  6. Prøverne blandes på en termisk mixer (Tabel over materialer), der er indstillet til 4 °C i 20−30 min. roterende ved ~1.800 omdrejninger i minuttet.
  7. Mens prøverne blandes, optøs stopopløsningen på is.
  8. Prøverne drejes ned ved hjælp af en mikrocentrifuge på bordpladen (Tabel over materialer) og tilsættes 1 μL stopopløsning til hvert rør.
    BEMÆRK: Prøverne kan efterlades ved -80 °C i op til 1 uge, før RNA'et transskriberes (afsnit 3).

3. Omvendt transskribering

BEMÆRK: Ved omvendt transskription af enkelte orme blev de her viste resultater genereret ved hjælp af de reagenser, der var forsynet med nanofluidiske chips (mulighed 2 i figur 1). De reagenser, der er fremhævet i mulighed 2 i figur 1, blev også anvendt til omvendt transskription af puljede prøver. Begge metoder fungerer i flæng for de forskellige eksempeltyper.

  1. Omvendt transskription af enkelte orme
    1. I en RNase-fri hætte tilsættes 1,25 μL omvendt transskriberingsblanding (Tabel over materialer) til et frisk PCR-rør.
      BEMÆRK: En 96 brønd PCR plade og en automatisk pipette kan bruges, hvis der er mange prøver. Ifølge producentens protokol kan der anvendes 1 μL pr. prøve.
    2. Tag 5 μL lysisopløsningen og stop opløsningsblandingen fra trin 2.8, og tilsæt den til det friske PCR-rør, der indeholder den omvendte transskriberingsblanding.
      BEMÆRK: Fabrikantens protokol angiver, at der kan anvendes 1 μL RNA (2,5 pg/μL-250 ng/μL) pr. reaktion. Der kan tilføjes en negativ RT-kontrol pr. plade ved at erstatte den omvendte transskriberingsblanding med 5 μL lyseret prøve og 1,25 μL RNAse-frit vand.
    3. Prøverne køres ved hjælp af følgende omvendte transskriberingsprogram på en termocykel: 25 °C i 5 min., 42 °C i 30 min., 85 °C i 5 min. og 4 °C for ∞.
      BEMÆRK: Den producerede cDNA kan lagres ved -20 °C, før der foretages forstærkning og dataindsamling ved hjælp af qPCR med høj overførselshastighed.
  2. Omvendt transskription for bulkeksempler (15-30 orme)
    1. I en RNase-fri emhætte fremstilles en masterblanding bestående af 12,5 μL 2x RT buffer, 1,25 μL 20x RT enzymbuffer og 0,25 μL nukleasefrit vand pr. prøve. Der tilsættes 14 μL masterblanding til 11 μL lysisopløsning og stopopløsningsblanding fra trin 2.8.
      BEMÆRK: Når der beskæftiger sig med et stort antal prøver dette kan udføres i 96 godt plader.
    2. Prøverne køres gennem en termocycler ved hjælp af følgende omvendte transskriberingsprogram: 37 °C i 60 min., 95 °C i 5 min. og 4 °C for ∞.
    3. Den producerede cDNA 1:4 fortyndes i nukleasefrit vand.
      BEMÆRK: Generelt kommer produkterne op på et endeligt volumen på 25 μL, og i så fald bør der tilsættes 75 μL. På grund af kondens kan det endelige volumen dog variere. Juster derfor i overensstemmelse hermed for at lave et 1:4-forhold i den endelige løsning. Dette fortyndingstrin gælder ikke, hvis der udføres qPCR på enkelte orme. Den producerede cDNA kan lagres ved -20 °C, før der foretages forstærkning og dataindsamling ved hjælp af qPCR med høj gennemløb.

4. Forberedelse af multiplex primer mix

  1. Forbered en fremad/omvendt (F/R) primerbestand for hvert par primere ved 50 μM endelig koncentration. Det samme volumen af fremad- og omvendte primere blandes ved hver 100 μM.
  2. 1 μL μL 50 μM F/R primerbestand for hvert primerpar, der skal testes. Dna-suspensionsbufferen tilsættes op til et samlet volumen på 100 μL.
    BEMÆRK: Lagerprimerkoncentrationerne her adskiller sig fra dem, der er beskrevet i fabrikantens protokol16, men bevarer den samme endelige koncentration på 500 nM.

5. Målret mod specifik forforstærkning

  1. Der fremstilles en masterblanding indeholdende 1 μL forforstærkningsmastermix (Tabel over materialer), 0,5 μL af den samlede primerblanding (trin 4.2) og 2,25 μL nukleasefrit vand pr. reaktion med en samlet overskudsvolumen på 10%.
  2. I en 96 brøndplade blandes aliquot 3,75 μL af masterblandingen i så mange brønde som nødvendigt for antallet af prøver, der skal køres.
  3. Der tilsættes 1,25 μL af de cDNA-løsninger af interesse, der blev genereret ved trin 3.1.3 eller 3.2.3, til hver brønd.
  4. Dæk pladen med 96 godt forsegling tape, kort vortex, og centrifuge med en bordplade plade spinner. Der overføres til en termocykelmotor, og følgende program køres: 95 °C i 2 min., 15 denatureringscyklusser ved 95 °C for 15 s, udglødning/forlængelse ved 60 °C i 4 min. og 4 °C for ∞.
    BEMÆRK: Producenten anbefaler fra 10−20 cyklusser til forforstærkningsreaktionen16. Denne protokol anbefaler 10 eller 15 cyklusser afhængigt af udtrykket niveauer af målet gener.

6. Exonuklease I behandling

BEMÆRK: Dette er for at fjerne personlige primere fra forforstærkning.

  1. Der fremstilles en exonuklease I-blanding, der indeholder 0,2 μL exonuklease I-reaktionsbuffer (Materialetabel), 0,4 μL exonuklease I ved 20 U/μL (Materialetabel) og 1,4 μL nukleasefrit vand pr. prøve. Opbevar alle reagenser på is, især exonuklease I.
  2. Fjern 96-brøndpladen (trin 5.4) fra termocyklen, centrifuge med bordpladespinneren, og fjern forsigtigt forseglingen. Der tilsættes 2 μL af den exonuklease, jeg blander, til hver forforstærkningsreaktion. Reseal, centrifuge, og læg 96-brøndpladen tilbage i termocyklen ved hjælp af følgende program: 37 °C i 30 min., 80 °C i 15 minutter og 4 °C for ∞.
  3. Prøverne udtages af termocyklæren, og de fortyndes 1:5 ved at tilsætte 18 μL 1x Tris EDTA-buffer (Tabel over materialer).
    BEMÆRK: CDNA-prøverne kan opbevares ved -20 °C til senere brug. Producentens protokol foreslår potentielle fortyndinger på 5x, 10x eller 20x på dette stadium16, afhængigt af udtryksniveauet for målene for interesse.

7. Forberedelse af analysen blandinger

BEMÆRK: Assay blandinger kan tilberedes i 384 godt plader, da brøndene har samme afstand som nanofluidic chips, hvilket gør lastning lettere.

  1. Forberedelse af analyseblandinger til en multi-array chip
    1. Der fremstilles en masterblanding bestående af 2 μL 2x assay loading reagens (Tabel over materialer) og 1,6 μL DNA-suspensionsbuffer ( Tabel overmaterialer) for hver brønd i henhold til den forberedte plan. Aliquot 3,6 μL af denne master mix per godt i en 384 godt plade.
    2. Der tilsættes 0,4 μL af den 50 μM F/R primer bestand, der er forberedt i trin 4.1, til de relevante brønde i henhold til den forberedte plan.
      BEMÆRK: Dette giver i alt 4 μL analyseblanding pr. brønd med et overskud på 1 μL.
  2. Forberedelse af assayblandinger til en enkelt-array chip
    1. Der fremstilles en masterblanding bestående af 3 μL 2x assaybelastningsreagens og 2,4 μL DNA-suspensionsbuffer for hver brønd i henhold til den forberedte plan. Aliquot 5,4 μL af denne master mix per godt i en markeret 384 godt plade.
    2. Der tilsættes 0,6 μL af primerbestanden på 50 μM F/R til de relevante brønde i henhold til den forberedte plan.
      BEMÆRK: Dette giver i alt 6 μL analyseblanding pr. brønd med et overskud på 1 μL.

8. Forberedelse af prøveblandingerne

BEMÆRK: Prøveblandinger kan tilberedes op til 1 dag i forvejen og opbevares ved 4 °C.

  1. Forberede eksempler på en multi-array chip
    1. Der fremstilles en prøvemasterblanding bestående af 2 μL 2x fluorescerende sonde supermix med lav ROX (Tabel over materialer) og 0,2 μL prøvereagens ( Tabel overmaterialer) pr. prøve. 2,2 μL af denne blanding hældes i den mærkede 384 brøndplade.
      BEMÆRK: Fabrikanten anbefaler, at prøvereagenset ikke hvirvles16.
    2. Pipette 1,8 μL af hver forforstærket, exonuklease behandlede jeg prøven fra trin 3.2.3 til de relevante brønde i overensstemmelse med den forberedte plan.
      BEMÆRK: Dette giver i alt 4 μL med et overskud på 1 μL.
  2. Forberede eksempler på en enkelt-array chip
    1. Der fremstilles en prøvemasterblanding bestående af 3 μL 2x fluorescerende sonde supermix med lav ROX (Tabel over materialer) og 0,3 μL af 20x DNA-bindende farveprøvebelastningsreagens ( Tabel overmaterialer) pr. prøve. 3,3 μL af denne blanding hældes i den mærkede 384 brøndplade.
    2. Pipette 2,7 μL af hver forforstærket og eksornuklease behandlede jeg prøven fra trin 6.3 til de relevante brønde i henhold til den forberedte plan.
      BEMÆRK: Dette giver i alt 6 μL med et overskud på 1 μL. Hvis der er brønde, der skal køres uden en prøve, skal disse lastes med prøve master mix og 2,7 μL vand i stedet for cDNA. Dette anbefales til begge chiptyper. Maskinen har brug for lav ROX i hvert indløb for at detektere chippens gitter.

9. Grunding af nanofluidic chip

BEMÆRK: En multi-array chip behøver kun at blive primet på det første løb. Hvis der er efterfølgende kørsler af den samme chip, kan denne fase springes over. Disse trin er de samme for begge chiptyper.

  1. Langsomt og forsigtigt injiceres den fulde 150 μL af kontrolledningsvæsken fra de sprøjter, der indgår i spånens akkumulatorer. Sørg for, at ingen kontrolvæske rører chippen ved at holde chippen i en 45°-vinkel og holde spidsen af sprøjten væk for at undgå spild.
  2. Fjern den blå beskyttelsesfilm fra bunden af chippen.
  3. Placer chippen i nanofluidics PCR priming maskine(Table of Materials), med stregkoden vender udad. Kør scriptet 'Prime (153x)', som tager ~15-20 min.
    BEMÆRK: Tænd for nanofluidics thermocycler (Table of Materials) på dette tidspunkt, fordi kameraet tager ca. 10 minutter at køle ned til under 0 °C.

10. Påfyldning af nanofluidic chip

  1. Fjern barrierepropperne sekventielt, når lastningen finder sted. Dette reducerer risikoen for fejlbelastning af brønde.
  2. Der overføres enten 3 μL for en multi-array chip eller 5 μL for en enkelt-array chip af hver primer assay blandinger og prøveblandinger til de tilsvarende indløb af nanofluidic chip i henhold til den forberedte plan. Sørg for ikke at introducere bobler, hvilket kan medføre, at den samlede overførte volumen er mindre end ønsket.
    BEMÆRK: Hvis der er brønde, der vil blive kørt uden en primer, er det vigtigt, at disse lastes med masterblanding og erstatter primervolumenet med vand. Dette gælder for begge chiptyper. På dette stadium kan det være lettere at placere chippen på en mørk overflade, hvilket gør det lettere at se brøndene.

11. Kørsel af nanofluidic chip

BEMÆRK: Første gang du kører en multi-array-chip, skal du konfigurere sporingsfilen ved at vælge Værktøjer | Flex Six Usage Tracking, klik på Ny, angiv et filnavn, og vælg en placering, før du klikker på Udført.

  1. Åbn dataindsamlingssoftwaren. Klik på Start ny kørsel. Placer den indlæste chip i nanofluidics termocykleren med stregkoden vendt udad.
  2. Vælg projektindstillingen, hvis det er relevant, og klik derefter på Næste | Indlæs. Hvis du indlæser en multi-array-chip, skal du vælge de partitioner (arrays), der skal køres.
  3. Vælg programmet Reference Probes, ret derefter programtypen til Gene Expression, og ret den passive reference til ROX. Vælg Single Probe Assay, skift sondetypen til Eva Green, og klik på Næste.
  4. Vælg den termiske cykelprotokol GE FLEX seks Fast PCR+Melt v1 for at køre en multi-array chip, eller protokollen GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 for at køre en single-array chip.
  5. Bekræft, at Automatisk eksponering er markeret, og klik på Start kør.

12. Post chip køre

BEMÆRK: Dette afsnit er kun nødvendigt for multi-array chips, når du ikke bruger hele chippen.

  1. Tag chippen ud af nanofluidics termocycler og indlæse i nanofluidics PCR priming maskine og køre Post Run (153x) script, som varer 5 min.
  2. Mærk de stik, der bruges til personlig reference.
    BEMÆRK: Chippen kan nu opbevares ved stuetemperatur, og de resterende arrays på chippen kan køres inden for 2 måneder.

13. Oprydning og analyse af data

  1. Åbn dataene i softwaren 'REAL-Time PCR Analysis'(Table of Materials). Kontroller den smeltende toptemperatur for hvert primerpar, der testes. Eliminer resultater, der udviser mere end en smeltetemperaturtop, for et givet primerpar.
    BEMÆRK: Flere toppe vises kun lejlighedsvis, formentlig når primerpar danner dimers eller fra interaktioner mellem målprimere med andre primere i det samlede primer-mix.
  2. Eksporter dataene som en 'heatmap'-regnearksfil, og fjern mislykkede prøver eller primere.
  3. Analyser data ved hjælp af Delta-Ct-standardmetoden21. Til statistisk evaluering skal du udføre envejs-ANOVA på relative udtryksniveauer.

Representative Results

Validering af Worm-to-CT som cDNA-forberedelsesmetode

For at teste, om Worm-to-CT-protokollen er en gyldig cDNA-ekstraktionsmetode, blev den sammenlignet med standard guanidiumthocyanat-phenol-chloroformekstraktionsmetoder. Resultaterne er vist i figur 3, hvor cDNA blev fremstillet af et gennemsnit på ~ 1.000 orme ved hjælp af standard guanidium thiocyanat-phenol-chloroform ekstraktionsteknikker22 og fra 30 orme ved hjælp af Worm-to-CT-metoden. Prøverne blev varmechokt samtidigt (30 minutter ved 34 °C). Globalt set var hsp-70 mRNA-ekspressionsniveauer pr. 100 ng af det samlede RNA sammenlignelige ved hjælp af begge metoder. Men i tilfælde af højeste hsp-70 udtryk (dvs. i N2 efter varmechok) ekspressionsniveauer var højere med Worm-to-CT-metoden, hvilket indikerer forbedret følsomhed.

For at afgøre, om et forventet fald i hsp-ekspressionen i hsf-1(sy441)23, en mutation i hovedtransskriptionsregulatoren for molekylære chaperoner23,24, kunne reproduceres, blev transskriptionel chaperoninduktion efter et kort varmechok sammenlignet. Med begge metoder blev der påvist et fald i hsp-70 induktion hos hsf-1 (sy441) dyr. Dette var forventet, fordi mutant hsf-1 (sy441) dyr udviser en nedsat evne til at fremkalde chaperoner på grund af en afkortning i transaktivering domæne HSF-1. For guanidium faldt thiocyanat-phenol-chloroformekstraktion hsp70 med 82,7% i forhold til kontrol og 92,3% for Worm-to-CT sammenlignet med vilde dyr (Figur 3). Resultaterne var sammenlignelige mellem begge metoder og sammenlignelige med tidligere rapporter23. Disse resultater viser, at Worm-to-CT-metoden er et gyldigt alternativ til standard cDNA-synteseteknikker.

Validering af den nanofluidics PCR-platform, der bruges til at forstærke mRNA-mål

For at teste konsistensen af resultaterne ved hjælp af nanofluidisk qPCR til transskriptionsforstærkning blev PCR-resultaterne fra Worm-to-CT-bulkmetoden sammenlignet på både et standard qPCR-system (Tabel over materialer) og et nanofluidisk qPCR-system ved hjælp af en multi-array chip. Den sammenfoldelige ændring i udtrykket af tre forskellige gener, sma-3 (Figur 4A), sma-10 (Figur 4B) og dnj-26, blev overvåget (Figur 4C) hos dyr, der bar en null-allel i dbl-1 (dbl-1(nk3))25 sammenlignet med modparter af vild type. Dbl-1 koder den eneste ligand af Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalvejen. sma-3 og sma-10 er gener, der koder SMAD orthologues, nøglekomponenter i BMP-signalkaskaden. Dnj-26 koder en molekylær anstandsdame, et mål for BMP signalering. Disse resultater viser lidt at ingen forskel i folden ændring sammenligne resultaterne af de to metoder, hvilket resulterer i ikke signifikantE P-værdier på 0,3113, 0,2635, og 0,3481 for sma-3, sma-10, og dnj-26, hhv . Alt i alt viser disse resultater, at Worm-to-CT-metoden, der anvendes på bulkprøver, er en effektiv og hurtig måde at udtrække RNA fra få orme og giver pålidelige data, når den kombineres med enten standard PCR-systemer eller nanofluidics-baserede qPCR-platforme med høj overførselshastighed.

Sammenligning mellem de ekspressionsniveauer, der opnås ved masseprøver, med gennemsnit fra enkelte orme

De relative udtryksniveauer blev beregnet ved hjælp af enten cDNA fra bulkprøver (25 orme) eller ud fra et gennemsnit på 36 enkeltormsprøver (Figur 5). Begge CDA'er blev opnået ved hjælp af Worm-to-CT-metoden og forstærket ved hjælp af nanofluidics PCR-teknologi. Som det fremgår af figur 5A-C, påviste metoderne sammenlignelige udtryksniveauer for alle testede chaperoner (dvs. hsp16.1, F44E5.4, hsp-70). Disse resultater indikerer, at parametre fra enkelte orme er pålidelige.

Anvendelse af Worm-to-CT koblet til nanofluidics teknologi til at estimere enkelt-orm genekspression parametre

Da single-array-chippen tillader overvågning af op til 96 måludskrifter på 96 individuelle prøver, er den derfor velegnet til at overvåge individuelle variabilitet i udskriftsudtryk mellem enkelte orme. Figur 6A viser et repræsentativt resultat, der viser middeludtrykket af flere hsk-udskrifter fra enkelte orme efter et kort varmechok. Som det fremgår af figuren, varierede variationen i udtrykket af udskrifter dramatisk på tværs af forskellige gener (Figur 6A). For at opnå yderligere indsigt blev variationskoefficienten (CV) beregnet ved at dividere standardafvigelsen med gennemsnittet af udtrykket niveau26 (Figur 6B). Tre gener, hvis CV-værdier tidligere er blevet anslået ved hjælp af alternative metoder, blev overvåget (ikke-offentliggjorte data). To stabile udskrifter (ife-1 og Y45F10D.4) og en variabel (nlp-2927) viste deres forventede variation. Grafen viser også tydeligt det velkendte inverse forhold mellem variabilitetsværdier og udtryksniveauer26 (Figur 6B).

Tekniske replikater er af afgørende betydning for at sikre reproducerbarhed ved brug af bulkprøver. Dette er dog ikke nødvendigvis tilfældet for enkeltcelleforsøg14,15,28. For at afgøre, om brugen af tekniske replikater er nødvendig for parameterestimering ved brug af enkeltormsprøver, blev der høstet 28 individuelle orme efter et kort varmechok og behandlet ved hjælp af tekniske triplikater. CV-værdierne beregnet ud fra enkeltormsdata, der er opnået i tre eksemplarer (blå prikker i figur 7, teknisk CV) i forhold til dem for hver udskrift, der er opnået fra individuelle orme (røde prikker i figur 7, biologisk variation) blev sammenlignet. For hver test, der blev testet, var de tekniske CV'er lavere end de biologiske CV'er, hvilket indikerer, at tekniske triplikater ikke var nødvendige for parameterestimering. Det faktum, at tekniske replikater ikke er påkrævet, øger eksperimentets gennemløb uden at gå på kompromis med kvaliteten.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over Worm-to-CT-protokollen.
Denne figur viser en kort oversigt over de forskellige trin, der kræves for at køre orme gennem Worm-to-CT-protokollen. Der vises to valgfrie metoder for det omvendte transskriberingstrin. disse er udskiftelige metoder til begge typer chip. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over forberedelse og drift af nanofluidisk qPCR.
Denne figur viser forberedelserne til at køre det nanofluidiske qPCR-system ved hjælp af en multi-array chip og en single-array chip. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Worm-to-CT-protokollen på bulkprøver gav pålidelige resultater.
Sammenligning af Worm-to-CT-protokollen kontra almindelig guanidiumthocyanat-phenol-chloroformekstraktion22 på bulkprøver. I overensstemmelse med tidligere resultater, i hsf-1 (sy441)mutanter23, niveauet af hsp udskrifter som reaktion på varmechok faldt. Ovennævnte histogrammer viser induktionen af hsp-70 i mangel af (-) eller efter (+) et kort varmechok på 30 min ved 34 °C. CDNA blev opnået ved hjælp af guanidium thiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion anvendes på 1.000 orme (venstre) eller ved hjælp af Worm-to-CT metode anvendes på 30 grupperede orme (højre). Udtrykket niveauer af hsp-70 pr. 100 ng af det samlede RNA opnået ved hver metode blev sammenlignet. Som forventet faldt den transskriptionelle induktion af hsp-70 som reaktion på varmechok betydeligt med 82,7% ved hjælp af guanidium thiocyanat-phenol-chloroform og med 92,3% ved hjælp af Worm-to-CT-metoden. MRNA-niveauerne fra målgener blev normaliseret i forhold til gennemsnittet af de tre husholdningsgener cdc-42, pmp-3og ire-1. Hver prik repræsenterer en biologisk replikat. Data blev registreret til statistisk analyse, da de ikke opfyldte de konventioner, der kræves til parametrisk analyse. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en RM-One-way ANOVA ved hjælp af Sidak's flere sammenligninger test. Vild type = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Søjler angiver middelværdiens standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Udtryksmønstrene var konsistente mellem qPCR-standard- og nanofluidiske qPCR-systemer.
(A)Udtrykket niveau af sma-3 (A), sma-10 (B) eller dnj-26 (C) mRNA blev bestemt gennem regelmæssig qPCR og nanofluidic qPCR (multi-array chip) fra tre biologiske replikater af cDNA genereret gennem Worm-til CT fra den vilde type stamme (N2) og dbl-1 (nk3) knockout stamme25. Relative mRNA-ekspressionsniveauer blev bestemt for hver stamme ved hjælp af Delta-Ct-metoden21. Foldændring blev derefter bestemt ved at dividere de udtryksniveauer, der blev opnået i dbl-1(nk3) orme, med de tilsvarende mRNA-niveauer i N2-stammen. Som vist i panel Avar mønstrene konsistente for begge metoder i hver enkelt biologisk replikat. (B) og (C) er de samme som (A) for henholdsvis sma-10- og dnj-26 mRNA-niveauer. Target mRNA niveauer blev normaliseret mod husholdning gener CDC-42 og pmp-3. Statistisk analyse blev beregnet for hvert gen ved hjælp af en parret t-test, der sammenlignede resultaterne af de tre biologiske replikater, der blev produceret gennem standard qPCR, og dem, der blev genereret gennem nanofluidisk qPCR. P-værdierne i disse sammenligninger var henholdsvis 0,3113, 0,2635 og 0,3481 for henholdsvis sma-3, sma-10og dnj-26. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Brug af Worm-to-CT-metoden på bulkeksempler eller på enkelte orme gav lignende udtryksniveauer, når den blev normaliseret pr. orm.
Udtrykket (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4, og (C) hsp-70 (C12C8.1) blev analyseret hos unge voksne dyr i mangel af varmechok enten ved at udføre Worm-to-CT på en bulk af 25 dyr eller på 36 enlige individer. Da dataene blev normaliseret pr. orm, var der ingen signifikant forskel mellem de niveauer, der blev opnået pr. orm for hver udskrift ved hjælp af begge metoder. MRNA-niveauerne fra målgener blev normaliseret i forhold til gennemsnittet af de tre husholdningsgener cdc-42, pmp-3og ire-1. Søjler repræsenterer middelværdiens standardfejl. Statistik = parret t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Rt-qPCR med høj overførselshastighed på enkelte orme ved hjælp af Worm-to-CT-metoden kan overvåge variabiliteten mellem de enkelte i genekspressionen.
(A)Middeludtryksniveauerne for 53 udskrifter opnået ved udsættelse for et kort varmechok (30 min ved 34 °C). Boxplots repræsenterer fordelingen af middel mRNA-udtryk fra individuelle orme (i gennemsnit blev der anvendt tre tekniske replikater pr. individuel orm). Prikkerne repræsenterer udtryksniveauer i 28 individuelle orme. MRNA-niveauerne fra målgener blev normaliseret i forhold til gennemsnittet af de tre husholdningsgener cdc-42, pmp-3og ire-1. (B) Variationskoefficienten26 (CV) som funktion af middel mRNA-ekspressionen for 53 udskrifter efter udsættelse for et kort varmechok blev beregnet ud fra 28 individuelle dyr (rådata vist i panel B). Sættet af udskrifter omfatter variablen NLP-29 udskrift27 og to stabile udskrifter(ife-1 og Y45F10D.4; ikke-offentliggjorte data). CV'et er forholdet mellem standardafvigelsen og middelværdi. Dette CV blev brugt til at estimere inter-individuelle variabilitet i udskrift udtryk mellem de enkelte orme. Som forventet skaleres variabiliteten mellem de enkelte med reducerede gennemsnitlige ekspressionsniveauer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Tekniske replikater var ikke nødvendige, når man analyserede inter-individuelle variabilitet i genekspression ved hjælp af en nanofluidisk chip.
Dataene i denne graf blev indhentet i 28 individuelle orme efter et kort varmechok (30 min ved 34 °C). Hver rød prik repræsenterer variationskoefficienten (CV) for gennemsnitlige udskriftsudtryksniveauer for en transskription analyseret mellem 28 individuelle orme (bio CV). Hver blå prik repræsenterer CV af udtryksniveauer mellem tre tekniske replikater opnået fra en enkelt orm, pr udskrift analyseret (teknisk CV). Denne graf viser, at den tekniske variation (mellem tekniske replikater) var meget lavere end biologisk variation (mellem de enkelte orme), hvilket tyder på, at det er unødvendigt at udføre tekniske replikater på et nanofluidisk genekspressionsmatrix, når man analyserer genekspression i enkeltorme, svarende til enkeltcelleundersøgelser14,15,28. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Planlayout for en multi-array chip. Tabellen ovenfor viser et simpelt layout, der kan bruges, når du planlægger en multi-array chipkørsel. Til venstre er de rum, der skal fyldes med primer mål af interesse og til højre er rum, der skal fyldes med prøver af interesse. Hver analyse og prøve array er parret nummer-klog gennem chippen. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Planlayout for en enkelt-array chip. Tabellen ovenfor viser et simpelt layout, der kan bruges, når du planlægger en single-array chipkørsel. Til venstre er rum, der skal fyldes med primer mål af interesse og til højre er rum, der skal fyldes med prøver af interesse. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Liste over RT-qPCR-primere, der anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 1: Primere fra databasen over RT-qPCR primere. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

I dette papir har Worm-to-CT-protokollen vist sig at være en hurtig og effektiv metode til at udtrække RNA fra enkelte orme eller en lille gruppe orme. Det nanofluidiske systems høje gennemløb gør det ideelt til kvantificering af målinger af variabilitet mellem de enkelte. Desuden gør denne metodes høje følsomhed det muligt at detektering af gener udtrykt ved lave niveauer, der falder under detektionen, når du bruger RNA-seq-teknologier med en enkelt orm9.

Når man overvejer valget af metode til at forberede cDNA fra enkelt orme. Ly et al.29 optimeret en protokol, der er afhængig af proteinase K for kutikula fordøjelsen. Neglebåndet er en stor forhindring for isolering af molekyler fra orme og proteinase K giver en effektiv metode til at bryde det. Proteinase K skal dog varmeinaktiveres for at kunne bruge enzymer til omvendt transskribering. Mens Ly et al. brugte en 10 minutters eksponering for 96 °C, blev dette trin undgået i denne protokol, fordi RNA er let nedbrydeligt. I stedet for at bruge proteinase K, gentagne fryse-optø cykler blev brugt til at bryde neglebånd. Fryse-optøningen er en effektiv metode til at bryde neglebåndet, fordi mere RNA kan isoleres pr. Orm. Ly et al. rapporterer, at det samlede RNA udvundet pr. orm er 35 ng ved hjælp af proteinase K, mens denne protokol opnår 51,75 ng ± 6,74 SEM af det samlede RNA pr. orm. Undgåelse af varmeeksponering kombineret med forforstærkningstrin udvider tilsyneladende Worm-to-CT's dynamiske detektionsområde sammenlignet med standardprotokoller. Ly et al. rapport absolutte Ct værdier på 21,1 ± 0,15 for hsp-16,2 og 22,8 ± 0,17 for hsp-70 efter varmechok. Ved hjælp af de samme varmechokforhold (1 h ved 30 °C) opnår denne protokol absolutte Ct-værdier på 17,93 ± 0,57 for hsp-16,2 og 21,13 ±0,33 for hsp-70. Dette indikerer, at fryse-optø lysis-metoden giver højere udbytter af RNA og er mere passende til lavt udtrykte udskrifter.

Nanofluidiske systemer er ideelle, når man undersøger et givet sæt måludskrifter og brugen af enten mindre (multi-array chip) eller større (single-array chip) antal prøver, der giver mulighed for tilpasning til eksperimentets skala. For at få et upartisk billede af alle udskrifter udtrykt i en enkelt orm, er det oplagte valg at bruge RNA-sekventering. Men hvis fokus for eksperimentet er et mindre, men stadig relativt stort sæt målgener, er det mere omkostningseffektivt at bruge denne protokol, forudsat at forskeren har adgang til en nanofluidics PCR-maskine. Omkostningerne ved det nanofluidiske system reagenser og en enkelt-array chip anslås til ca £ 13 per orm, mens omkostningerne ved reagenser til enkelt-orm sekventering ville være ca £ 60 per orm, ikke inklusive sekventering omkostninger.

Når man overvejer, hvilken PCR-platform der skal bruges, giver Worm-to-CT-metoden koblet til nanofluidic qPCR fordele med hensyn til tid og overførselshastighed. Det er muligt at opnå 9.216 RT-qPCR resultater i ca 2 dages arbejde, mens forstærkning af det samme antal mål ved hjælp af en standard qPCR platform ville tage ca 5 arbejdsuger ved hjælp af 96 godt plade assays, der kører fire plader om dagen. Men hvis antallet af mål, der skal testes, er mindre, er det mere omkostningseffektivt at bruge Worm-to-CT kombineret med en standard qPCR-maskine. Single-array-chipsene kan ikke køres igen, så kørsel af tomme brønde reducerer omkostningseffektiviteten.

En begrænsning af metoden er den potentielle dannelse af primer-primer dimers under multiplexing trin, men dette sker i mindre end 1% af tilfældene. Selvom Worm-to-CT-protokollen er effektiv og giver pålidelige resultater, når den anvendes på enkelte orme, er der en fejlrate på ca. 5%, hvilket sandsynligvis svarer til tilfælde, hvor ormen forbliver fanget i hætten eller toppen af røret under høsttrinnet.

Sammen tilbyder denne alsidige og pålidelige metode øget gennemløb og følsomhed sammenlignet med mere standardteknikker. Denne metode kan være meget nyttig til validering af skærme med høj overførselshastighed og er et glimrende valg til enten at overvåge eller validere enkeltorms genekspressionsniveauer. Denne metode kan anvendes på andre udfordrende teknikker, såsom kvantantitation af genekspression fra isolerede væv. For eksempel giver isolering af fulde væv, såsom tarmen, gonader eller celler isoleret af FACs, nok materiale til at udføre RNA-sekventeringseksperimenter. Begrænsede mængder materiale fører dog ofte til duplikerede læsninger, hvilket udelukker kvantantitation af sjældne udskrifter. I dette scenario bør brugen af nanofluidics-baseret teknologi give ekstra følsomhed over for forsøgene og øge omkostningseffektiviteten, hvis forskerne kun skal overvåge en delmængde af alle udskrifter i disse væv eller celler.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. JLP blev støttet af Wellcome Trust (093970/Z/10/Z), og OC understøttes af ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent Fluidigm 100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC Fluidigm BMK-M-96.96 Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software Fluidigm 101-6793 Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system Fluidigm 100-2451 K1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs Fluidigm 89000021 Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer TEKnova T0021
domed PCR caps
Exonuclease I New England BioLabs M0293L
Exonuclease I reaction buffer New England BioLabs B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent Fluidigm 100-7673 referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC Fluidigm 100-6308 referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide Fluidigm 68000088 This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX Fluidigm 68000112 I1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR Fluidigm 100-2297 Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge StarLab C1301B-230V Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner Labnet K4050725 mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit invitrogen 4402955 This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix Fluidigm 100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions Fluidigm 100-6299 One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad Laboratories 172-5211 referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA TEKnova T0224 Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C Eppendorf 5382000031 Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol Thermo-Fisher 15596026 Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).
  2. Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
  3. Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
  4. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
  5. Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).
  7. Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
  8. Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
  9. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  10. Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).
  11. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).
  12. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  13. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
  14. Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
  15. Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
  16. Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).
  19. Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
  20. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
  21. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).
  22. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
  23. Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).
  24. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  25. Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
  26. Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
  27. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
  28. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  29. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).

Tags

Genetik RT-qPCR single-orm C. elegans bulk prøver orm-til-CT nematoder høj-throughput nanofluidic multiplex
Kvantitative RT-PCR'er med høj gennemløb i enkelt- og <em>bulk-C. elegans-prøver</em> ved hjælp af nanofluidisk teknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F.,… More

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F., Todtenhaupt, P., Biggins, L., Miska, E. A., Andrews, S., Casanueva, O. High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology. J. Vis. Exp. (159), e61132, doi:10.3791/61132 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter