Denne procedure blev indført for at udvikle avancerede 3D-leverkulturer in vitro, som kan give en mere fysiologisk relevant vurdering af de genotoksiske farer, der er forbundet med nanomaterialeeksponering over både en akut eller langvarig, gentagen dosis regimer.
På grund af den hurtige udvikling og implementering af en bred vifte af manipulerede nanomaterialer (ENM) er eksponering for ENM uundgåelig, og udviklingen af robuste, prædiktive in vitro-testsystemer er afgørende. Levertoksikologi er nøglen, når man overvejer ENM eksponering, som leveren tjener en afgørende rolle i metaboliske homøostase og afgiftning samt at være et vigtigt sted for ENM akkumulering post eksponering. Baseret på dette og den accepterede forståelse af, at 2D-hepatocytmodeller ikke nøjagtigt efterligner kompleksiteten af indviklede multicellulære interaktioner og metabolisk aktivitet observeret in vivo, er der større fokus på udviklingen af fysiologisk relevante 3D-levermodeller skræddersyet til ENM-farevurderingsformål in vitro. I overensstemmelse med principperne i 3R’erne til at erstatte, reducere og forfine dyreforsøg er der udviklet en 3D HepG2 cellelinjebaseret levermodel, som er et brugervenligt og omkostningseffektivt system, der kan understøtte både udvidede og gentagne ENM-eksponeringsordninger (≤14 dage). Disse sfæroide modeller (≥ 500 μm i diameter) bevarer deres proliferative kapacitet (dvs. dividere cellemodeller), så de kan kombineres med mikrokerneanalysen »guldstandard« for effektivt at vurdere genotoksicitet in vitro. Deres evne til at rapportere om en række toksikologiske endpoints (f.eks. leverfunktion, (pro)inflammatorisk respons, cytotoksicitet og genotoksicitet) er blevet karakteriseret ved hjælp af flere ENMs på tværs af både akutte (24 h) og langsigtede (120 h) eksponeringsregimer. Denne 3D-in vitro-levermodel har kapacitet til at blive anvendt til at evaluere mere realistiske ENM-eksponeringer, hvilket giver en fremtidig in vitro-tilgang til bedre at understøtte ENM-farevurdering på en rutinemæssig og lettilgængelig måde.
På grund af den hurtige udvikling og implementering af en bred vifte af manipulerede nanomaterialer (ENM) på tværs af en overflod af menneskebaserede applikationer (f.eks. fødevarer, kosmetik, tøj, sportsudstyr, elektronik, transport og medicin) er det uundgåeligt, at mennesker regelmæssigt vil blive udsat for ENM. Med dette er der øget bekymring for, at de nye, størrelsesspecifikke fysiokemiske egenskaber, der anser disse materialer for fordelagtige i mange applikationer, kan forårsage negative virkninger på menneskers sundhed og miljøet samtidig. I øjeblikket er der mange internationale aktiviteter på plads for aktivt at afspejle mere fysiologisk relevante eksponeringer for disse ENM og vurdere disse materialers potentielle toksicitet i scenarier med akut, langvarig og gentagen lavdosiseksponering.
Levertoksikologi er nøglen, når man overvejer ENM-eksponering, da det er almindeligt kendt, at leveren er et vigtigt sted for ENM-akkumulering efter eksponering1,2. Desuden er leveren det primære organsystem til metabolisme og afgiftning af stoffer, der kommer i systemiskcirkulation 3. Baseret på den accepterede forståelse af , at 2D hepatocytmodeller ikke nøjagtigt efterligner kompleksiteten af indviklede flercellede interaktioner eller passende repræsenterer metabolisk aktivitet observeret in vivo , er der etableret et større fokus på at udvikle robuste og fysiologisk relevante in vitro 3D-levermodeller for in vivo-erstatningsteknologier4,5. Brug af avancerede 3D-kulturteknologier forbedrer levetiden af in vitro-levermodeller, hvilket giver mulighed for langsigtede, gentagne eksponeringsordninger, der skal undersøges. Derudover fremmer dette avancerede kulturformat dannelsen af forbedrede fysiologiske, organotypiske træk som galdekanaliculi, aktive transportprocesser og forbedrede CYP450-lægemiddelmetaboliseringsfunktioner, hvilket forbedrer forudsigeligheden af modellerne6. Nuværende 3D-in vitro-levermodeller bestående af monokulturer (kun hepatocytter) eller samkulturer (hepatocytter med ikke-parenchymale celler) findes i flere formater, lige fra mikrotissuer eller sfæroider i ultralow vedhæftningsplader, hængende dråbesprædroider, celler indlejret i matricer og/eller stilladser og mikrofluidiske cellekulturplatforme, som alle anses for effektive avancerede in vitro-modeller til vurdering af levertoksicitet6,7. Men de fleste af disse modelsystemer er høj vedligeholdelse, kræver specialiseret udstyr og er dyre. Desuden er disse modeller ofte statiske (dvs. ikke-opdelte cellemodeller), der forhindrer deres anvendelse i vurderingen af fareslutpunkter, såsom genotoksicitetstest ved hjælp af metoder, der kvantificerer fast DNA-skade. Genotoksicitet er en central forudsætning for lovgivningsmæssig toksikologi, og det er en vigtig del af risikovurderingen af ethvert toksiksmiddel8. Der er ingen enkelt analyse, der kan anvendes til at kvantificere alle former for DNA-skader, der kan opstå efter eksponering for et eksogent middel. En kernekomponent i in vitro-genotoksicitetstestbatteriet er imidlertid mikrokerneanalysen, som er en pålidelig og mangefacetteret teknik, der måler bruttokromosomskader9. Det er en guldstandardteknik, der er beskrevet i OECD’s testretningslinje 487 til vurdering af in vitro-DNA-skader og genotoksicitet og er en del af kravet om testbatterier til lovgivningsmæssig farevurdering10,11.
Den menneskelige hepatocellulære karcinomcellelinje, HepG2, anvendes bredt til indledende risikovurderingsscreening, da cellerne er let tilgængelige, relativt billige at købe, enkle at kultur og modtagelige for høj gennemløbsscreening12,13. Når de dyrkes i 3D-sfæriske strukturer, har de vist sig at opsummere levermikromiljøet godt og tilbyde en levermodel med tilstrækkelige proliferative evner til at understøtte mikrokerneanalysen3. Yderligere udvikling af HepG2-sfæroidmodellerne blev etableret for at forbedre modellens levetid og leverlignende funktionalitet for at understøtte vurdering af genotoksicitetsfare over langsigtede, gentagne eksponeringsordninger (≤14 dage). I overensstemmelse med principperne i 3R’erne til erstatning, reduktion og forfinelse af dyreforsøg er denne protokol således blevet udarbejdet for at tilvejebringe en avanceret 3D-in vitro-levermodel, der er i stand til pålideligt at evaluere flere toksikologiske slutpunkter (f.eks. leverfunktionalitet, (pro-)inflammatoriske markører, cytotoksicitet og genotoksicitet) efter akut, langvarig og gentagen kemisk og ENM-eksponering på en rutinemæssig og let tilgængelig måde.
Her præsenterer vi en metode til at etablere et fysiologisk relevant 3D-hepatocytcellelinjebaseret in vitro-modelsystem til vurdering af genotoksicitetsfare efter akutte eller langsigtede, gentagne ENM-eksponeringer. Protokollen kan opdeles i 6 centrale faser: dyrkning cryopreserved HepG2 celler; HepG2 sfæroid forberedelse; HepG2 sfæroid overførsel fra hængende dråbe til agarose suspension; HepG2 sfærisk høst; mikrokerneanalyse og -scoring og dataanalyse.
Ansøgninger om 3D-levermodeller varierer betydeligt afhængigt af det særlige biokemiske slutpunkt eller den negative resultatvej, der målrettes mod. Hver model har sine fordele og begrænsninger, fra interdonor variation i primære menneskelige hepatocyt (PHH) modeller til reduceret cytochrom p450 aktivitet i celle-line baserede modeller, men alle er værdifulde i deres egen ret6,12,18,19. Ved vurdering af genotoksicitet er der begrænsninger i modellernes kompatibilitet med regulatoriske godkendte slutpunkter såsom in vitro-mikrokerneanalysen, da aktiv spredning er påkrævet. Dette er nødvendigt, da genotoksicitetsvurdering kræver kvantificering af fast DNA-skade, der skal vurderes efter celledeling, når der er mulighed for DNA-reparation for at korrigere forbigående læsioner. Desværre, meget differentieret hepatocyt (dvs. HepaRG) baseret sfæroider eller PHH mikrotissues, som anses for at udvise de mest fysiologisk relevante lever-lignende egenskaber form statisk (ikke-proliferative) modeller12,19,20. Som et resultat giver 3D HepG2-kugleformet model præsenteret her en passende, alternativ model, der er i stand til at understøtte genotoksicitetstest. HepG2 celle-line baseret sfæroider har tilstrækkelig aktivt dividere celler på ydersiden af spheroids samtidig opretholde grundlæggende lever-lignende egenskaber, såsom albumin og urinstof produktion og nogle CYP450 aktivitet5,12,19. Hovedsagelig denne in vitro lever model er blevet udviklet til at supplere micronucleus assay, da dette er en af de to in vitro assays anbefales i batteriet til genotoksicitet test8,10,11,21. Modellen kan dog let anvendes til DNA-sekventeringsanalyse og RNA-teknologier (Gene Expression), mens den har potentialet til at blive yderligere tilpasset og udnyttet til andre DNA-skadesslutpunkter, såsom kometanalysen. Ikke desto mindre er det vigtigt at overveje den rolle, som ENM-interferens spiller i nogle slutpunktsanalyser. F.eks. er flowcytometribaserede analyser muligvis ikke egnede til ENM-genotoksicitetsvurdering specifikt på grund af partikelinterferens22.
En begrænsende faktor for sfæroide modeller, der aktivt gennemgår celledeling, er deres størrelse. Optimering af såningstætheden er kritisk, da der skal være nok celler, der gør det muligt for modellen at fortsætte med at formere sig; men ikke for højt et cellenummer, hvilket resulterer i, at kugleformet bliver alt for kompakt, hvilket fører til en øget nekrotisk kerne. Årsagen til denne nekrose menes at være begrænset ilt og næringsstof diffusion, som grænsen for denne diffusion menes at være ca 100 – 150 μm væv23,24. Dette afhænger dog af celletype, cellenummer, stilladsinteraktioner og kulturforhold25. Siden har det vist sig, at ca. 700 μm diameter er grænsen for at undgå for tidlig nekrose i midten af C3A-sfæroider, såning 4000 HepG2-celler pr. kugleform sikrer, at modellens diameter på eksponeringstidspunktet er ≤500 μm26. Desuden fastslog Shah et al., at HepG2-celler, der var seedet over 5000 celler pr. kugleformet, udviste en 25% reduktion i levedygtigheden efter 7 dage i kultur, hvilket kunne vedrøre den gennemsnitlige diameter på 680 μm og begrænset tilgængelighed af næringsstoffer i en 20 μL hængende dråbe5. For at overvinde dette gennemgår modellen, der er udtænkt i denne protokol, et kritisk trin, hvor den hængende dråbe overføres til agarosebelagte brønde efter den første dannelse af kugleformet. Dette sikrer en større mængde af kultur medium er til stede for at opretholde det stadigt stigende antal celler i spheroids. Som følge heraf forbliver HepG2-kugleformet model over 70% levedygtig efter 10 dage i kultur og kan bruges til langsigtet farevurdering in vitro.
Mens HepG2 sfæroid model kan støtte både akut og langsigtet eksponering regimer, forfriskende cellekultur medium i længere kultur perioder er begrænset til denne model som fuldstændig udskiftning af mediet anbefales ikke på grund af det potentielle tab af spheroids. Det antages, at med ENM-eksponeringer er tendensen til homogene ENM-dispersioner til agglomerat og sediment høj. Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at den hastighed, hvormed en ENM-sedimenter kan variere afhængigt af partikelparametrene (f.eks. størrelse, form og tæthed) og kan bestemmes teoretisk ved hjælp af in vitro-sedimentations-, diffusions- og dosimetrimodellen (ISDD) eller dens nylige derivater, der ofte henvises til, når det drejer sig om ENM-eksponering (suspension) nærmer sig27,28. Med dette er sind, antages det, at hvis kun 50% af cellekulturmediet forsigtigt fjernes fra overfladen af cellekulturen, bør forstyrrelsen og den efterfølgende fjernelse af ENM-dosis i teorien være minimal. Med Brownian-bevægelse på spil er dette dog muligvis ikke strengt tilfældet, og der bør arbejdes videre med depositionen og sedimenteringen af hver enkelt ENM, der skal testes, for at sikre, at den korrekte dosimetri bevares under hele de langsigtede eksponeringsordninger27. Dette er hovedsagelig en potentiel begrænsning at overveje, når der udføres gentagne doseringsordninger, da dette kan være afgørende for den endelige akkumulerede koncentration. Kemisk baserede eksponeringer giver på den anden side, selv om de ikke er uden deres egne begrænsninger at overveje, en mere forenklet tilgang, idet kemiske stoffer har tendens til at forblive i opløsning, og en direkte erstatning af den oprindelige kemiske koncentration ud over den nyligt tilsatte koncentration sikrer, at ethvert kemikalie, der går tabt under medieforfriskning, erstattes i overensstemmelse hermed29. Fremtidige anvendelser vil omfatte en vurdering af modellens egnethed til gentagne eksponeringsordninger over længerevarende kulturperioder, da gentagne doseringsstrategier er af afgørende betydning for vurderingen af et bestemt organsystems evne til at forbedre eller overvinde eventuelle negative virkninger som følge af bioakkumulering af et xenobiotisk stof.
Afslutningsvis vil jeg sige, at denne 3D-in vitro-levermodel har kapacitet til at blive anvendt til at evaluere en række realistiske eksponeringsscenarier, hvilket giver en fremtidig in vitro-tilgang til bedre støtte til både ENM og kemikalierisikovurdering på en rutinemæssig og lettilgængelig måde.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende, at denne forskning har modtaget støtte fra EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram for PATROLS-projektet i henhold til tilskudsaftale nr.
Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
Autoclave Tape | |||
BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
Cytology Metal Clips | |||
Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
Haemocytometer and Coverslip | |||
Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
Liquid Nitrogen | |||
Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
Microwave | |||
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
P1000 and P200 micropipettes | |||
P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
Pipette Boy | |||
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
Weighing Balance | |||
Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL or 100mL Glass Bottles | |||
50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |