Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.
Debido al rápido desarrollo e implementación de una amplia gama de nanomateriales de ingeniería (ENM), la exposición a ENM es inevitable y el desarrollo de sistemas de prueba in vitro robustos y predictivos es esencial. La toxicología hepática es clave al considerar la exposición a la ENM, ya que el hígado desempeña un papel vital en la homeostasis metabólica y la desintoxicación, además de ser un sitio importante de acumulación de ENM después de la exposición. Sobre la base de esto y la comprensión aceptada de que los modelos de hepatocitos 2D no imitan con precisión las complejidades de las intrincadas interacciones multicelulares y la actividad metabólica observada in vivo, hay un mayor enfoque en el desarrollo de modelos hepáticos 3D fisiológicamente relevantes adaptados para fines in vitro de evaluación de riesgos ENM. De acuerdo con los principios de los 3R para reemplazar, reducir y refinar la experimentación con animales, se ha desarrollado un modelo hepático basado en líneas celulares 3D HepG2, que es un sistema fácil de usar y rentable que puede soportar regímenes de exposición ENM extendidos y repetidos (≤14 días). Estos modelos esferoides (≥500 μm de diámetro) conservan su capacidad proliferativa (es decir, modelos de células divisorias) lo que les permite combinarse con el ensayo de micronucleus ‘estándar de oro’ para evaluar eficazmente la genotoxicidad in vitro. Su capacidad para informar sobre una gama de puntos finales toxicológicos (por ejemplo, función hepática, (pro)respuesta inflamatoria, citotoxicidad y genotoxicidad) se ha caracterizado utilizando varios ENM en regímenes de exposición agudos (24 h) y a largo plazo (120 h). Este modelo hepático in vitro 3D tiene la capacidad de ser utilizado para evaluar exposiciones enM más realistas, proporcionando así un enfoque in vitro futuro para apoyar mejor la evaluación de riesgos enM de una manera rutinaria y de fácil acceso.
Debido al rápido desarrollo e implementación de una amplia gama de nanomateriales de ingeniería (ENM) a través de una plétora de aplicaciones basadas en humanos (por ejemplo, alimentos, cosméticos, ropa, equipos deportivos, electrónica, transporte y medicina), es inevitable que los seres humanos estén expuestos a LAM de forma regular. Con esto, hay mayores preocupaciones de que las características fisioquímicas específicas de tamaño novedosas que consideran estos materiales ventajosos en numerosas aplicaciones podrían causar efectos adversos sobre la salud humana y el medio ambiente de manera concomitante. Actualmente existen muchas actividades internacionales para reflejar activamente exposiciones más fisiológicamente relevantes a estos ENM y evaluar la toxicidad potencial de estos materiales en escenarios agudos, a largo plazo y repetidos de exposición a dosis bajas.
La toxicología hepática es clave a la hora de considerar la exposición a la ENM, ya que es ampliamente conocido que el hígado es un sitio importante de acumulación de ENM después de la exposición1,2. Además, el hígado es el sistema de órganos primarios para el metabolismo y desintoxicación de sustancias que entran en circulación sistémica3. Sobre la base de la comprensión aceptada de que los modelos de hepatocitos 2D no imitan con precisión las complejidades de interacciones multicelulares intrincadas o representan adecuadamente la actividad metabólica observada in vivo, se ha establecido un mayor enfoque en el desarrollo de modelos hepáticos 3D in vitro robustos y fisiológicamente relevantes para tecnologías sustitutivas in vivo4,5. La utilización de tecnologías avanzadas de cultivo 3D mejora la longevidad de los modelos hepáticos in vitro, lo que permite investigar regímenes de exposición repetida a largo plazo. Además, este formato de cultivo avanzado promueve la formación de características fisiológicas y organotípicas mejoradas como biliar canaliculi, procesos de transporte activo y capacidades mejoradas de metabolización de fármacos CYP450, mejorando así la predictividad de los modelos6. Los modelos hepáticos in vitro 3D actuales que consisten en monocultivos (sólo hepatocitos) o co-cultivos (hepatocitos con células no parnquimales) existen en varios formatos, que van desde microtissues o esferoides en placas de adhesión ultrarrápidas, esferoides colgantes, células incrustadas en matrices y/o andamios y plataformas de cultivo celular microfluídico, todos los cuales se consideran modelos in vitro avanzados eficaces para la evaluación de toxicidad hepática6,7. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas modelo son de alto mantenimiento, requieren equipos especializados y son caros. Además, estos modelos suelen ser estáticos (es decir, modelos celulares que no cumplen) que impiden su uso en la evaluación de puntos finales de riesgo, como pruebas de genotoxicidad utilizando métodos que cuantifican el daño fijo del ADN. La genotoxicidad es un requisito previo básico en la toxicología regulatoria, y es un componente vital de la evaluación del riesgo de cualquier tóxico8. No hay un solo ensayo que pueda aplicarse para cuantificar todas las formas de daño del ADN que puedan surgir después de la exposición a un agente exógeno. Sin embargo, un componente central de la batería de pruebas de genotoxicidad in vitro es el ensayo de micronucleos, que es una técnica fiable y multifacética que mide el daño cromosómico bruto9. Es una técnica estándar de oro descrita por la Guía de Examen 487 de la OCDE, para evaluar los daños in vitro del ADN y la genotoxicidad y forma parte del requisito de batería de prueba para la evaluación de riesgos reglamentarios10,11.
La línea celular de carcinoma hepatocelular humano, HepG2, se utiliza ampliamente para la detección inicial de evaluación de riesgos, ya que las células están disponibles, relativamente baratas de obtener, fáciles de cultivar y aptos para un cribado de alto rendimiento12,13. Cuando se cultivan en estructuras esféricas 3D, se ha demostrado que recapitulan bien el microambiente hepático y ofrecen un modelo hepático con capacidades proliferativas suficientes para soportar el ensayo micronucleus3. Se estableció un mayor desarrollo de los modelos esferoides HepG2 para mejorar la longevidad y la funcionalidad hepática del modelo con el fin de apoyar la evaluación del riesgo de genotoxicidad a largo plazo, regímenes de exposición repetida (≤14 días). Así, en consonancia con los principios de los 3R para sustituir, reducir y refinar la experimentación con animales, se ha establecido el presente protocolo para proporcionar un modelo hepático in vitro 3D avanzado capaz de evaluar de forma fiable múltiples variables toxicológicas (por ejemplo, funcionalidad hepática, marcadores inflamatorios (pro), citotoxicidad y genotoxicidad) siguiendo exposiciones químicas y ENM agudas, a largo plazo y repetidas de forma rutinaria y de fácil acceso.
Aquí, presentamos un método para establecer una línea celular hepatocito 3D fisiológicamente relevante basada en el sistema modelo in vitro para la evaluación de riesgos de genotoxicidad después de exposiciones agudas o repetidas enM a largo plazo. El protocolo se puede dividir en 6 etapas clave: cultivar células HepG2 criopreservadas; Preparación de esferoides hepG2; Transferencia de esferoide hepG2 de caída colgante a suspensión de agarose; Cosecha de esferoides hepG2; ensayo y puntuación de micronucleus; y análisis de datos.
Las aplicaciones para modelos hepáticos 3D varían considerablemente dependiendo de la variable bioquímica particular o la vía de resultado adversa que se dirige. Cada modelo tiene sus beneficios y limitaciones, desde la variación interdonor en los modelos primarios de hepatocitocito humano (PHH) hasta la reducción de la actividad del citocromo p450 en modelos basados en líneas celulares, pero todos son valiosos por derecho propio6,12,18,19. Al evaluar la genotoxicidad hay limitaciones en la compatibilidad de los modelos con los puntos finales aprobados por la reglamentación, como el ensayo de micronucleos in vitro, ya que se requiere proliferación activa. Esto es necesario, ya que la evaluación de la genotoxicidad requiere la cuantificación de los daños fijos del ADN para ser evaluados después de la división celular cuando hay oportunidad de reparación del ADN para corregir lesiones transitorias. Desafortunadamente, los esferoides a base de hepatocitos altamente diferenciados (es decir, HepaRG) o microtissues PHH, que se consideran que exhiben las características hepáticas más fisiológicamente relevantes forman modelos estáticos (no proliferativos)12,19,20. Como resultado, el modelo esferoide 3D HepG2 presentado aquí proporciona un modelo adecuado y alternativo capaz de soportar pruebas de genotoxicidad. Los esferoides basados en líneas celulares HepG2 tienen suficientes células divisorias activas en la superficie externa de los esferoides manteniendo características básicas similares al hígado, como la producción de albúmina y urea y alguna actividad cyp4505,12,19. Principalmente este modelo hepático in vitro se ha desarrollado para complementar el ensayo de micronucleus, ya que este es uno de los dos ensayos in vitro recomendados en la batería para pruebas de genotoxicidad8,10,11,21. Sin embargo, el modelo se puede aplicar fácilmente a las tecnologías de análisis de secuenciación de ADN y expresión génica (ARN), mientras que tiene el potencial de adaptarse y utilizarse aún más para otras variables de daño de ADN, como el ensayo del cometa. No obstante, es importante considerar el papel que desempeña la interferencia en el MEDE en algunos análisis de puntos finales. Por ejemplo, los análisis basados en citometría de flujo pueden no ser adecuados para la evaluación de la genotoxicidad en OCA específicamente debido a la interferencia de partículas22.
Un factor limitante de los modelos esferoides que se someten activamente a la división celular es su tamaño. La optimización de la densidad de siembra es crítica, ya que debe haber suficientes células que permitan que el modelo siga proliferando; pero no demasiado alto un número de células, lo que resulta en el esferoide se vuelve demasiado compacto, lo que conduce a un aumento del núcleo necrótico. Se cree que la causa de esta necrosis es la difusión restringida de oxígeno y nutrientes, ya que se cree que el límite de esta difusión es de aproximadamente 100 – 150 μm de tejido23,24. Sin embargo, esto depende del tipo de celda, el número de celda, las interacciones de andamios y las condiciones de cultivo25. Desde entonces, se ha demostrado que aproximadamente 700 μm de diámetro es el límite para evitar la aparición prematura de necrosis en el centro de esferoides C3A, la siembra de 4000 células HepG2 por esferoide asegura que el diámetro del modelo en el momento de la exposición sea ≤500 μm26. Además, Shah et al. establecieron que las células HepG2 sembradas por encima de 5000 células por esferoide presentaban una reducción del 25% en la viabilidad después de 7 días de cultivo, que podrían pertenecer al diámetro medio de 680 μm y una disponibilidad limitada de nutrientes en una caída colgante de 20 μL5. Para superar esto, el modelo ideado en el presente protocolo se somete a un paso crítico donde la gota colgante se transfiere a pozos recubiertos de agarose después de la formación inicial del esferoide. Esto garantiza un mayor volumen de medio de cultivo está presente para mantener el número cada vez mayor de células dentro de los esferoides. Como resultado, el modelo esferoide HepG2 sigue siendo más del 70% viable después de 10 días en cultivo y se puede utilizar para la evaluación de riesgos a largo plazo invitro.
Mientras que el modelo esferoide HepG2 puede soportar regímenes de exposición tanto agudos como a largo plazo, el medio de cultivo celular refrescante durante períodos de cultivo prolongado está restringido para este modelo, ya que no se recomienda la sustitución completa del medio debido a la pérdida potencial de los esferoides. Se presume que con las exposiciones en el ENM, la tendencia a las dispersiones homogéneas de ENM a aglomerar y sedimentos es alta. Sin embargo, es notable que la velocidad a la que un sedimento ENM puede variar dependiendo de los parámetros de partículas (por ejemplo, tamaño, forma y densidad) y se puede determinar teóricamente utilizando el modelo de sedimentación in vitro, difusión y dosimetría (ISDD), o sus derivados recientes, a menudo referidos cuando con respecto a la exposición ENM (suspensión) se acerca a27,28. Con esto es mente, se supone que si sólo el 50% del medio de cultivo celular se elimina cuidadosamente de la superficie del cultivo celular, la interrupción y posterior eliminación de la dosis de ENM debe ser en teoría mínima. Sin embargo, con el movimiento browniano en juego, esto puede no ser estrictamente el caso y se deben seguir trabajando en la deposición y sedimentación de cada ENM en particular que se va a probar para garantizar que la dosimetría correcta se conserve a lo largo de los regímenes de exposición a largo plazo27. Principalmente, se trata de una limitación potencial a tener en cuenta al realizar regímenes de dosificación repetidos, ya que esto podría ser crítico para la concentración final y acumulada. Por otra parte, las exposiciones basadas en productos químicos, si bien no están exentos de sus propias limitaciones a tener en cuenta, ofrecen un enfoque más simplista en el sentido de que las sustancias químicas tienden a permanecer en solución y, por lo tanto, una sustitución directa de la concentración química original, además de la concentración recién añadida, garantiza que cualquier producto químico perdido durante la actualización de los medios de comunicación se sustituye en consecuencia29. Las aplicaciones futuras incluirían la evaluación de la idoneidad del modelo de regímenes de exposición repetidos durante períodos de cultivo a largo plazo, ya que las estrategias de dosificación repetidas son cruciales para evaluar la capacidad de un sistema de órganos en particular para mejorar o superar los efectos adversos, si los hubiera, inducidos por la bioacumulación de una sustancia xenóbiótica.
En conclusión, este modelo hepático in vitro 3D tiene la capacidad de ser utilizado para evaluar una gama de escenarios de exposición realistas, proporcionando así un enfoque in vitro futuro para apoyar mejor tanto la evaluación de riesgos enemis como químicos de una manera rutinaria y de fácil acceso.
The authors have nothing to disclose.
Los autores quieren reconocer que esta investigación ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea para el proyecto PATROLS, en virtud del acuerdo de subvención Nº 760813
Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
Autoclave Tape | |||
BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
Cytology Metal Clips | |||
Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
Haemocytometer and Coverslip | |||
Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
Liquid Nitrogen | |||
Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
Microwave | |||
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
P1000 and P200 micropipettes | |||
P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
Pipette Boy | |||
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
Weighing Balance | |||
Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL or 100mL Glass Bottles | |||
50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |