Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61146
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Summary

يظهر هنا مقايسة مضان حساسة لمراقبة نشاط البروتين الشحمي N-acyltransferase باستخدام ببتيد ثنائي أسيل جليسريل وألكاين فوسفوليبيدات كركائز مع كيمياء النقر.

Abstract

يتم تعديل البروتينات الدهنية من البكتيريا البروتينية بعد الترجمة بواسطة الأحماض الدهنية المشتقة من الدهون الفوسفاتية الغشائية عن طريق عمل ثلاثة إنزيمات غشائية متكاملة ، مما ينتج عنه بروتينات ثلاثية الأسيلات. تتضمن الخطوة الأولى في مسار تعديل البروتين الدهني نقل مجموعة دياسيل جليسريل من فوسفاتيديل جليسرول إلى البروتين البروتيني ، مما ينتج عنه بروتين بروليبوبروتين ثنائي الغليسيريل. في الخطوة الثانية ، يتم شق ببتيد إشارة البروتين البروتيني ، مكونا بروتين شحمي ، والذي بدوره يتم تعديله بواسطة حمض دهني ثالث مشتق من الفوسفوليبيد. يتم تحفيز هذه الخطوة الأخيرة بواسطة صميم البروتين الشحمي N-acyltransferase (Lnt). يعد مسار تعديل البروتين الدهني ضروريا في معظم البكتيريا البروتينية γ ، مما يجعله هدفا محتملا لتطوير عوامل مضادة للبكتيريا جديدة. الموصوف هنا هو اختبار حساس ل Lnt متوافق مع الفحص عالي الإنتاجية للجزيئات المثبطة الصغيرة. الإنزيم والركائز هي جزيئات مدمجة في الغشاء. لذلك ، فإن تطوير اختبار في المختبر ليس بالأمر السهل. وهذا يشمل تنقية الإنزيم النشط في وجود المنظفات ، وتوافر الألكاين الفوسفوليبيد وركائز الببتيد ثنائي الغليسيريل ، وظروف التفاعل في المذيلات المختلطة. علاوة على ذلك ، من أجل استخدام اختبار النشاط في إعداد فحص عالي الإنتاجية (HTS) ، تفضل القراءة المباشرة لمنتج التفاعل على التفاعلات الأنزيمية المقترنة. في مقايسة الإنزيم الفلورومترية هذه ، يتم تحويل منتج الببتيد ثلاثي الكيلات إلى الفلورسنت من خلال تفاعل كيمياء النقر ويتم اكتشافه في شكل لوحة متعددة الآبار. تنطبق هذه الطريقة على أسيلترانسفيراز الأخرى التي تستخدم ركائز تحتوي على الأحماض الدهنية ، بما في ذلك الدهون الفوسفاتية وأسيل-CoA.

Introduction

تتميز البروتينات الدهنية البكتيرية بالأحماض الدهنية المرتبطة تساهميا في أمينو تيرميني والتي يتم من خلالها تثبيتها في الأغشية 1,2. الجزء الناضج من البروتين متنوع للغاية في البنية والوظيفة ، مما يفسر دور البروتينات الدهنية في العمليات البيولوجية المختلفة في غلاف الخلية البكتيرية.

يتم تعديل البروتينات الدهنية بواسطة الأحماض الدهنية المشتقة من الفوسفوليبيد بعد إدخالها في الغشاء السيتوبلازمي. تحتوي البروتينات البروليبوبروتينية على شكل مميز ، وهو lipobox ، والذي يحتوي على بقايا سيستين ثابتة تصبح أسيلية وأول حمض أميني في البروتين الناضج. يتم تحفيز الخطوة الأولى من هذا المسار بواسطة البروتين البروليبوبروتين فوسفاتيديل جليسرول: :d iacylglyceryl transferase (Lgt) ، الذي ينقل مجموعة diacylglyceryl من phosphatidylglycerol إلى البروتين البروليبوبروتين عبر رابط ثيوثير بين دياسيل جليسريل والسيستين. إشارة الببتيداز II (Lsp) تشق ببتيد الإشارة من البروتين البروليبوبروتين ثنائي الأسيل غليسيريل ، مما ينتج عنه بروتين شحمي مثبت في الغشاء من خلال مجموعة دياسيل جليسيريل. يتم تحفيز الخطوة الثالثة والأخيرة بواسطة صميم البروتين الشحمي N-acyltransferase (Lnt) ، والذي يضيف حمضا دهنيا من موضع sn-1 من الفوسفوليبيد على صميم البروتين الشحمي ، مما ينتج عنه بروتين دهني ناضج ثلاثي الأضلاع (الشكل 1) 3. تفاعل Lnt هو تفاعل بينج بونج من خطوتين حيث يتم تكوين وسيط إنزيم أسيل ثيوستر مستقر. يتحرر الناتج الثانوي لليسوفوفوسفوليبيد قبل تسيل ركيزة البروتين الشحمي في الخطوة الثانية من التفاعل.

يتم تحديد خصوصية ركيزة الفوسفوليبيد في مقايسة Lnt بناء على التحول الحركي لببتيد N-acyl diacylglyceryl على نسبة عالية من Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. كانت الفوسفوليبيدات ذات مجموعات الرأس القطبية الصغيرة ، المشبعة [sn-1] وغير المشبعة [sn-2] ، ركائز مفضلة 4. مقايسة إزاحة الهلام ليست مناسبة للدراسات الحركية المكثفة للبروتين الشحمي N-acyltransferase ولا ل HTS لتحديد الجزيئات المثبطة. تم استخدام كيمياء النقر باستخدام أحماض الألكين الدهنية بنجاح لدراسة تعديل البروتين الدهني في البكتيريا5 واستقلاب الأحماض الدهنية في حقيقيات النوى6. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن مقايسة في المختبر من رأس palmitoylation لتحديد مثبطات7.

في الطريقة الموضحة هنا ، يتم تحضين Lnt النشط المنقى في المنظفات مع ركائز في مذيلات مختلطة لتشكيل الببتيد ثلاثي الأسيل الألكاين الذي يتم اكتشافه لاحقا بواسطة مطياف التألق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الانزيم والركيزة

  1. تنقية الانزيم
    1. إنتاج وتنقية إنزيم Lnt من الأغشية القابلة للذوبان في المنظفات كما هو موضح سابقا 4,8. باختصار ، حث التعبير عن جين lnt-strep ، وترميز Lnt بعلامة Strep C-terminal ، عند OD600 من 0.6 مع التتراسيكلين اللامائي (200 نانوغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4000 × غرام لمدة 10 دقائق والتخلص من المادة الطافية.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت WA (20 mM Tris-HCl pH 8 ، 150 mM NaCl ، 0.5 mM EDTA) إلى 100 OD600 وحدة لكل مل.
    4. كسر الخلايا عن طريق ممرين من خلال مكبس خلية الضغط الفرنسية عند 10000 رطل / بوصة مربعة.
    5. قم بإزالة الخلايا غير المنقطعة والحطام عن طريق الطرد المركزي بمعدل 13000 × جم لمدة 20 دقيقة. الحفاظ على طافت وتجاهل بيليه.
    6. جهاز طرد مركزي للطافي بسرعة 120000 × جم لمدة 60 دقيقة وجمع الحويصلات الغشائية (حبيبات بنية شفافة اللون). تخلص من المادة الطافية.
    7. إذابة البروتينات الغشائية المتكاملة من الحبيبات الغشائية باستخدام 1٪ (وزن / حجم) n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) في المخزن المؤقت WA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). أجهزة الطرد المركزي وإزالة المواد غير القابلة للذوبان بمعدل 120000 × جم لمدة 30 دقيقة. استخدم الجزء الطافي للتنقية.
    8. تنقية Lnt-strep على عمود كروماتوغرافيا التقارب (انظر جدول المواد) وعمود ترشيح هلام S400 (انظر جدول المواد) كما هو موضح من قبل Nozeret et al.8.
    9. قم بتخزين الإنزيم المنقى في محلول WA يحتوي على 0.05٪ DDM و 10٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: الإنزيم مستقر لأكثر من 5 سنوات.
  2. تحضير ركائز ألكاين فوسفوليبيد وليجند تحفيز الخلايا الليفية البيوتينية (FSL-1-biotin)
    1. القسمة 100 ميكرولتر من ألكاين-بوب المركب حسب الطلب (1-هيكساديك-15-ينويل-2-أوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين، انظر جدول المواد) قابل للذوبان في الكلوروفورم في أنابيب 1.5 مل.
    2. اخترق الأنابيب بحقنة وتبخر الكلوروفورم في فراغ سريع في RT لمدة 2 ساعة. قم بتخزين عينات الفوسفوليبيد الجافة في -20 درجة مئوية.
    3. قم بإذابة الألكاين-بوب في 0.1٪ Triton X-100 عند 500 ميكرومتر قبل الاستخدام. أضف خطوة صوتنة لمدة 3 دقائق في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية في RT لإذابة الألكاين-بوب إذا لزم الأمر.
    4. إعادة تعليق FSL-1-البيوتين في الماء عند 445 ميكرومتر.
      ملاحظة: يمكن تخزين كلا الحلين في -20 درجة مئوية لمدة شهرين على الأقل.

2. فحص الأنبوب

ملاحظة: في اليوم الأول ، قم بإعداد تفاعل Lnt في أنابيب سعة 1.5 مل (الخطوة 2.1) وقم بتغطية 96 لوحة بئر بالستربتافيدين (الخطوة 2.2).

  1. تحضير خليط الكاشف والتفاعل الأنزيمي
    1. للحصول على اختبار Lnt قياسي ، امزج alkyne-POPE (نهائي 50 ميكرومتر من مخزون 500 ميكرومتر) و FSL-1-biotin (التركيز النهائي 50 ميكرومتر من مخزون 445 ميكرومتر) في مخزن تفاعل Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2 ، 150 mM NaCl ، 0.1٪ Triton X-100 يحتوي على 1٪ BSA) بحجم نهائي يبلغ 18 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل. أداء جميع الشروط في ثلاث نسخ.
    2. قم بتسخين خليط الركيزة (المحضر في الخطوة 2.1.1) لمدة 3 دقائق في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل إضافة إنزيم Lnt (الخطوة 2.1.3).
      ملاحظة: MTSES (الصوديوم (2-سلفوناتو إيثيل) ميثانيثيوسلفونات) ، كاشف خاص بالثيول ، يثبط Lnt8. أضف 10 mM MTSES (محلول مخزون 100 mM في DMSO 100٪) إلى أنابيب التفاعل (الخطوة 2.1.1) لاستخدامها كعينات تحكم سلبية. اضبط حجم المخزن المؤقت لتفاعل Lnt بحيث يكون الحجم الكلي 18 ميكرولتر.
    3. أضف نشطا (1 نانوغرام / ميكرولتر ، الموافق 17.2 نانومتر) أو غير نشط Lnt (C387S) (2 ميكرولتر من مخزون 10 نانوغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت WA الذي يحتوي على 0.05٪ DDM) واخلطه مع الركائز (الخطوة 2.1.2) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
    4. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في خلاط حراري بغطاء ساخن.
  2. طلاء ستربتافيدين من 96 لوحة بئر
    1. تحضير محلول مخزون من الستربتافيدين عند 2 ملغم / مل في H2O.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. من محلول المخزون ، قم بإعداد 10 ميكروغرام / مل من الستربتافيدين في الماء كمحلول عملي. أضف 100 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر من لوحة البئر 96. اربط الستربتافيدين بالطبق عن طريق التحضين عند 37 درجة مئوية طوال الليل بدون غطاء لتجفيف الآبار بالهواء.

ملاحظة: في اليوم الثاني ، قم بإجراء كيمياء النقر (الخطوة 2.3) ، واربط خليط تفاعل Lnt بألواح مغلفة بالستربتافيدين (الخطوة 2.4) ، واكتشف التألق وحلل النتائج (الخطوة 2.5).

  1. تفاعل كيمياء النقر
    1. تحضير محاليل مخزون من Azido-FAM (5 mM في DMSO) ، TCEP (Tris (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد ؛ 50 mM محضر في الماء) ، TBTA (Tris [(1-benzyl-1H-1،2،3-triazol-4-yl) methyl] أمين ؛ 2 mM في ثلاثي البيوتانول: DMSO (4: 1)) ، و CuSO4∙5H 2 O (50 mM طازجا في H2O).
    2. في الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على خليط تفاعل Lnt المحضر في الخطوة 2.1.4 ، قم بإجراء كيمياء النقر عن طريق إضافة الكواشف بالترتيب التالي: 0.2 ميكرولتر من المخزون Azido-FAM (التركيز النهائي 50 ميكرومتر) ، 0.4 ميكرولتر من المخزون TCEP (التركيز النهائي 1 mM) ، 0.2 ميكرولتر من المخزون TBTA (التركيز النهائي 0.02 mM).
    3. دوامة الحل لمدة 5 ثوان. ثم أضف 0.4 ميكرولتر من المخزون CuSO4 (التركيز النهائي 1 mM). دوامة مرة أخرى لمدة 5 ثوان. احتضان العينات في الظلام في RT لمدة 1 ساعة.
  2. ربط خليط تفاعل Lnt بألواح مغلفة بالستربتافيدين
    1. اغسل آبار الألواح المطلية بالستربتافيدين بعد الحضانة الليلية من الخطوة 2.2.2 3x مع 200 ميكرولتر من PBS-T1 (PBS يحتوي على 0.05٪ Tween-20).
      ملاحظة: يمكن استخدام ألواح الستربتافيدين على الفور أو تخزينها جافة عند 4 درجات مئوية.
    2. انقل 18 ميكرولتر من خليط كيمياء النقر من الخطوة 2.3.3 إلى بئر في صفيحة 96 بئر مطلية بالستربتافيدين وأضف 100 ميكرولتر من PBS-T1 لربط منتج N-acyl-FSL-1-biotin-FAM بألواح الستربتافيدين.
    3. استخدم البيوتين-فلوريسئين (0.26 ميكرومتر من مخزون 3.1 مللي مول في DMSO) كعنصر تحكم إيجابي لربط الستربتافيدين وقراءات مضانة.
    4. احتضان الألواح في RT لمدة 1 ساعة في الظلام في خلاط حراري ، يهتز عند 300 دورة في الدقيقة.
    5. قم بإجراء خطوات غسيل يدوية لألواح البئر ال 96 باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات على النحو التالي: ست غسلات مع 200 ميكرولتر من PBS-T2 (PBS تحتوي على 1٪ Tween-20) ، وثلاث هبات مع ماصة ، وثلاث غسلات مع 200 ميكرولتر من PBS ، وثلاث هبات مع ماصة.
  3. الكشف عن التألق وتحليله
    1. أضف 200 ميكرولتر من PBS وسجل التألق عند 520 نانومتر في قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية. حفظ النتائج في برنامج جداول البيانات.
      ملاحظة: يستخدم البيوتين-فلوريسئين كعنصر تحكم إيجابي لربط الستربتافيدين والكشف عن التألق عند 520 نانومتر. من المتوقع قراءة قابلة للتكرار من 30,000-40,000 A.U. مع 0.26 ميكرومتر من البيوتين فلوريسين. يتم تحليل جميع العينات في ثلاث نسخ ، بما في ذلك الضوابط.
    2. احسب الانحراف المعياري لكل تفاعل وحساب قيم P للعناصر الضابطة السلبية والعينات الإيجابية باستخدام اختبار t غير المزاوج باستخدام برنامج إحصائي.

3. فحص لوحة متعددة الآبار

ملاحظة: في اليوم الأول ، قم بإعداد تفاعل Lnt في 384 لوحة بئر (الخطوة 3.1) وتغطية 384 لوحة بئر بالستربتافيدين (الخطوة 3.2).

  1. تحضير خليط الكاشف والتفاعل الأنزيمي
    ملاحظة: يتم تقليل كمية الكواشف والإنزيم مقارنة بمقايسة الأنبوب ويتم إجراء تفاعل Lnt مباشرة في 384 لوحة بئر. هذا يسمح باستخدام مواد أقل وتقليل الخطوات التي يمكن أن تكون أكثر آلية.
    1. امزج الركائز على النحو التالي: ألكين-بوب (التركيز النهائي 50 ميكرومتر من مخزون 500 ميكرومتر) و FSL-1-biotin (50 ميكرومتر نهائي من مخزون 500 ميكرومتر) في مخزن تفاعل Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2 ، 150 mM NaCl ، 0.1٪ Triton X-100 يحتوي على 1٪ BSA) بحجم 13.5 ميكرولتر لكل تفاعل لكل بئر في شكل لوحة بئر 384. أداء جميع الشروط في ثلاث نسخ. احسب الكمية الإجمالية للكواشف المطلوبة لعدد التفاعلات التي سيتم إجراؤها (أي 5184 ميكرولتر للوحة بئر واحدة 384).
    2. سونيك خليط الركيزة لمدة 3 دقائق في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية.
    3. حصة 13.5 ميكرولتر من خليط الركيزة لكل بئر في لوحة بئر 384.
      ملاحظة: كعنصر تحكم سلبي ، يمكن إضافة 10 مللي متر من MTSES (محلول مخزون 625 مللي متر في DMSO بنسبة 100٪) لكل بئر. اضبط حجم المخزن المؤقت Lnt (الخطوة 3.1.1) للوصول إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 13.5 ميكرولتر.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل إضافة إنزيم Lnt (الخطوة 3.1.5).
    5. أضف 0.5 نانوغرام / ميكرولتر (الموافق 8.6 نانومتر) إنزيم Lnt نشط ، أو متغير غير نشط (C387S) (1.5 ميكرولتر من مخزون 5 نانوغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت WA الذي يحتوي على 0.05٪ DDM) في مخزن تفاعل Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2 ، 150 mM NaCl ، 0.1٪ Triton X-100 ، 1٪ BSA) إلى كل بئر يحتوي على خليط التفاعل من الخطوة 3.1.3. خلط الكواشف عن طريق ماصة لأعلى ولأسفل. إجمالي حجم التفاعل هو 15 ميكرولتر.
    6. ختم اللوحة بورق بلاستيكي لألواح متعددة الآبار.
    7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في خلاط حراري بغطاء ساخن.
  2. ستربتافيدين طلاء 384 لوحة بئر
    1. استخدم 75 ميكرولتر من الستربتافيدين (10 ميكروغرام / مل في H 2 O) من الخطوة2.2.2 لطلاء الآبار من لوحة بئر 384. دع الستربتافيدين يلتصق بالطبق عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية طوال الليل دون غطاء لتجفيف الآبار بالهواء.

ملاحظة: في اليوم 2 ، قم بإجراء كيمياء النقر (الخطوة 3.3) ، واربط خليط تفاعل Lnt بألواح مغلفة بالستربتافيدين (الخطوة 3.4) ، واكتشف التألق ، وحلل النتائج (الخطوة 3.5).

  1. تفاعل كيمياء النقر
    1. تحضير محاليل مخزون من Azido-FAM (1.2 mM في DMSO) ، TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريد ؛ 24 مللي مول محضر في H 2 O) ، TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1،2،3-triazol-4-yl) methyl] أمين ؛ 0.48 mM في ثلاثي البيوتانول: DMSO (4: 1)) و CuSO4∙5H 2 O (24 mM طازجا في H2O).
    2. اجمع بين الكواشف الثلاثة لكيمياء النقر: خليط من Azido-FAM (التركيز النهائي 50 ميكرومتر) ، TCEP (1 mM النهائي) ، و TBTA (0.02 mM النهائي) ، كل منها عند 0.75 ميكرولتر في الحجم النهائي 2.25 ميكرولتر لكل بئر. احسب الحجم المطلوب لكل 384 لوحة بئر (أي استخدم 864 ميكرولتر عند استخدام جميع آبار لوحة البئر 384). تخلط بقوة.
    3. أضف 2.25 ميكرولتر من محلول الكاشف لكل بئر مباشرة إلى تفاعل Lnt المكتمل في لوحة البئر 384 من الخطوة 3.1.7.
    4. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات.
    5. أضف CuSO4 (0.75 ميكرولتر من مخزون 24 مللي مول لتركيز نهائي 1 مللي مول) واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات.
    6. احتضان في RT لمدة 1 ساعة في الظلام.
  2. ربط خليط تفاعل Lnt بألواح البئر 384 المطلية بالستربتافيدين
    1. اغسل آبار الألواح المطلية بالستربتافيدين بعد الحضانة الليلية من الخطوة 3.2.1 1x مع 85 ميكرولتر PBS-T1.
    2. نقل 11 ميكرولتر من تفاعل كيمياء النقر من كل بئر من صفيحة الحضانة من الخطوة 3.3.6 إلى الصفيحة المطلية بالستربتافيدين من الخطوة 3.4.1 لربط منتج N-acyl-FSL-1-biotin-FAM بألواح الستربتافيدين .
    3. أضف 64 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS-T1.
    4. قم بتضمين البيوتين فلوريسئين (0.19 ميكرومتر من مخزون 3.1 mM في DMSO) كعنصر تحكم للارتباط بالآبار المغلفة بالستربتافيدين.
    5. احتضان 384 لوحة بئر في RT لمدة 1 ساعة في الظلام في خلاط حراري ، يهتز عند 300 دورة في الدقيقة.
    6. اغسل الألواح باستخدام غسالة الألواح الآلية على النحو التالي: 10 غسلات مع 85 ميكرولتر PBS-T2 ، تهتز الألواح بين الغسالات ؛ 5 يغسل مع 85 ميكرولتر PBS ، تهتز لوحات بين يغسل.
  3. الكشف عن التألق وتحليله
    1. أضف PBS (85 ميكرولتر) وسجل التألق في قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية عند 535 نانومتر.
    2. تحليل البيانات كما هو موضح (الخطوة 2.5.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في تفاعل Lnt ، يتم نقل الأحماض الدهنية sn-1 من الدهون الفوسفاتية إلى ببتيد ثنائي الغليسيريل ، مما ينتج عنه ببتيد ثلاثي الأسيلناضج 8. تم تصميم مقايسة Lnt في المختبر الموصوفة هنا لاستخدام الدهون الفوسفاتية التي تحتوي على حمض دهني ألكين (ألكين-POPE) و FSL-1-بيوتين كركائز ، مما يؤدي إلى تكوين ألكين-FSL-1-بيوتين. عند تفاعل كيمياء النقر مع azido-FAM ، يجب أن يصبح هذا المنتج موسوما بالفلورسنت ويتم اكتشافه بواسطة قياس الطيف الفلوري (الشكل 2).

تم تحسين ظروف التفاعل للحصول على أقصى قراءة مضان عند 520 نانومتر في قارئ اللوحة. عند إنزيم 1 نانوغرام / ميكرولتر ، لوحظ التحويل الكامل ل FSL-1-biotin8 (الشكل 3). تضمنت الضوابط السلبية تفاعلات بدون إنزيم ، مع متغير غير نشط من الإنزيم (موقع نشط الطافر C387S) ، أو مع مثبط MTSES الخاص بالثيول الذي يؤدي إلى اكتشاف مضان منخفض. يرتبط البيوتين-فلوريسئين بكفاءة بالألواح المطلية بالستربتافيدين ويستخدم كعنصر تحكم داخلي لأقصى إشارة مضانة. تم إجراء جميع التجارب في حسابات ثلاثية وحسابات الانحراف المعياري وأظهر التحليل الإحصائي أن الفحص كان حساسا وقابلا للتكرار.

من أجل تطوير اختبار HTS لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة ل Lnt ، تم تقليل كمية الكواشف ، وتم إجراء التفاعلات مباشرة في 384 لوحة بئر. علاوة على ذلك ، تم أتمتة خطوات الغسيل باستخدام غسالة الألواح (انظر جدول المواد). أما بالنسبة لفحص الأنبوب ، فقد كان التفاعل حساسا وقابلا للتكرار ، مع وجود فرق كبير بين التحكم السلبي (C387S) والإنزيم النشط (Lnt) (الشكل 4). في HTS ، يحدد عامل Z ما إذا كانت الاستجابة في الفحص كبيرة بما يكفي لأغراض الفحص9 ويتم حسابها باستخدام المعادلة التالية:

Equation 1

حيث S هي الإشارة المتوسطة ، B هي إشارة الخلفية ، σ هي الانحراف المعياري.

كان متوسط عامل Z >0.6 لمقايسة Lnt التي تم إجراؤها بتنسيق HTS باستخدام 384 لوحة بئر ، مما يشير إلى أن اختبار فحص الجزيء الصغير لتثبيط Lnt كان رائعا.

Figure 1
الشكل 1: التفاعلات الأنزيمية في التعديل اللاحق للترجمة للبروتين الدهني في البكتيريا البروتينية. تم تحفيز الخطوات المتسلسلة بواسطة Lgt10 و Lsp11 و Lnt 12،13،14 في الغشاء السيتوبلازمي. PGN: الببتيدوغليكان ، SP: إشارة الببتيد ، LB: lipobox ، عزر محفوظ يحتوي على Cys + 1 ومعدل بالأحماض الدهنية وأول حمض أميني في البروتين الدهني الناضج ، PG: فوسفاتيديل جليسرول ، G-1-P: جلسرين -1-فوسفات ، PE: فوسفاتيديل إيثانولامين ، ليزوPE: ليسو- فوسفاتيديل إيثانولامين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: رسم تخطيطي لمقايسة الإنزيم الفلورومتري لبروتين شحمي N-acyltransferase (Lnt). تم خلط الركائز FSL-1-biotin (الأصفر) والألكاين-POPE (الأزرق) مع إنزيم Lnt المنقى المذاب في المنظفات. تم إجراء التفاعل في مذيلات مختلطة عند 37 درجة مئوية (الخطوة 1). تم تمييز منتج alkyne-FSL-1-biotin بالفلوريسئين (برتقالي) بواسطة كيمياء النقر (الخطوة 2) وتم اكتشافه في قارئ لوحة مضان عند الارتباط بألواح مغلفة بالستربتافيدين (الخطوة 3). الشكل هو نسخة معدلة من الشكل 1B الذي نشرته Nozeret et al.8 وفقا لترخيص المشاع الإبداعي (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: الكشف عن مضان نشاط Lnt في شكل بئر 96. تم إجراء تفاعلات Lnt في أنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بعد وضع العلامات الفلورية عن طريق كيمياء النقر والارتباط بالألواح المطلية بالستربتافيدين ، تم قياس التألق بواسطة مطياف التألق. تم استخدام البيوتين-فلوريسئين (البيوتين-فلو 0.26 ميكرومتر) كعنصر تحكم في التألق. كان المخزن المؤقت هو المخزن المؤقت للتفاعل فقط. العينات التي تشير إلى ألكين-بوب (50 ميكرومتر) ، FSL-1-بيوتين (50 ميكرومتر) ، وركائز (مزيج من ألكين-بوب و FSL-1-بيوتين ، 50 ميكرومتر لكل منهما) لم تحتوي على إنزيم. تضمنت الضوابط السلبية تثبيط MTSES (10 mM) ومتغير غير نشط من Lnt (C387S). تمت إضافة إنزيم Lnt عند 1 نانوغرام / ميكرولتر. تم حساب الانحرافات المعيارية ل n = 3 تجارب. ** القيمة الاحتمالية < 0.005. الإثارة عند 494 نانومتر ، عرض النطاق الترددي 5 نانومتر والانبعاث عند 520 نانومتر ، عرض النطاق الترددي 5 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: قراءة مضان لتفاعل Lnt في 384 لوحة بئر متوافقة مع HTS. تم إجراء تفاعلات Lnt الأنزيمية في 384 لوحة بئر عند 37 درجة مئوية. تم استخدام البيوتين-فلوريسئين (البيوتين-فلو 0.19 ميكرومتر) كعنصر تحكم في التألق. كان المخزن المؤقت عبارة عن مخزن مؤقت للتفاعل يحتوي على DMSO. تضمنت الضوابط السلبية تثبيط MTSES (10 mM) ومتغير غير نشط من Lnt (C387S). تمت إضافة إنزيم Lnt عند 0.5 نانوغرام / ميكرولتر. تم حساب الانحرافات المعيارية ل n = 3 تجارب. قيمة P < 0.0005. الإثارة عند 485 نانومتر ، عرض النطاق الترددي 20 نانومتر والانبعاث عند 535 نانومتر ، عرض النطاق الترددي 25 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول اختبار Lnt الموصوف هنا ، بناء على الكشف عن مضان المنتج ثلاثي الأسيل ، حساس وقابل للتكرار. يعد الارتباط المحدد والفعال للبيوتين بالستربتافيدين عنصرا أساسيا في الفحص. يتم أيضا تمييز ركيزة Alkyne-POPE المتبقية بعد الانتهاء من تفاعل Lnt بالفلورسنت باستخدام FAM ولكن يتم إزالتها بكفاءة بعد الارتباط بألواح الستربتافيدين بخطوات غسيل متعددة. علاوة على ذلك ، لا تؤثر إضافة DMSO على نشاط Lnt وليس لها أي تأثير على الفحص. كل من الركيزة والإنزيم محبة للدهون بدرجة عالية وتتطلب ظروف تفاعل في المذيلات المختلطة. التقنيات التي تعتمد على الإنزيمات القابلة للذوبان والركائز للكشف عن المنتج ، بما في ذلك الاستقطاب الفلوري ، غير قابلة للتطبيق8. القيد الوحيد للفحص هو توافق الإنزيم مع ركيزة الألكين ، لأن تفاعل كيمياء النقر يعتمد على هذه المجموعة الكيميائية.

تم الإبلاغ عن مقايسات إزاحة الهلام في الدراسات السابقة لتحليل نشاط Lnt وتحديد خصوصية الركيزة4. مع البروتوكول الحالي ، وبالتوازي مع مطياف التألق ، يمكن استخدام الكشف عن مضان الهلام لمراقبة نشاط Lnt8 ، على الرغم من أن هذا التنسيق غير مناسب ل HTS. مقايسة الأنبوب مثيرة للاهتمام بشكل خاص للدراسات الحركية والمقارنة لمتحولات Lnt. يمكن معالجة خصوصية ركيزة الفوسفوليبيد باستخدام الألكاين-الفوسفوليبيدات التي تم الحصول عليها عن طريق وضع العلامات الأيضية للبكتيريا مع أحماض الألكاين الدهنية المكونة من أطوال سلسلة مختلفة ودرجة التشبع كما هو موضح8.

يتوافق تنسيق لوحة البئر 384 مع دراسات HTS لأنه لوحظ اختلاف كبير بين الإنزيم النشط والتحكم في الركيزة فقط. تم حساب متوسط عامل Z البالغ >0.6 مع الظروف المثلى المعروضة هنا. تساهم قابلية التكرار العالية للفحص في ارتفاع عامل Z. لنجاح HTS ، يوصى باستخدام عامل Z أعلى من 0.69. خطوات الغسيل فعالة مع استخدام غسالة الألواح الآلية. ويمكن زيادة تحسين الخطوات الأخرى، بما في ذلك سحب الكواشف، مما يسمح بفحص مكتبات كبيرة من الجزيئات الصغيرة.

ينطبق البروتوكول على أسيلترانسفيراز الأخرى التي تستخدم ركائز تحتوي على الأحماض الدهنية إذا كانت مجموعات الألكاين متوافقة مع التعرف على الركيزة بواسطة الإنزيم. تصف دراسة حديثة حول تحديد مثبطات محددة لبالميتويل أسيل ترانسفيراز حقيقي النواة (PAT) استخدام الإنزيم المرتبط بالغشاء والألكاين-أسيل-CoA كركيزة7. لوحظ بالميتويل لببتيد رأس صغير بيوتينيل عن طريق الكشف عن الفلوروجين بكيمياء النقر. حددت شاشة تجريبية في شكل لوحة بئر 384 لهذا الفحص مثبطات محددة ل PAT ، مما يشير إلى أن الركائز المكونة من مجموعة الأحماض الدهنية الألكاين جنبا إلى جنب مع كيمياء النقر والكشف عن التألق الحساس هي طريقة واعدة ل HTS القائم على الهدف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر فابريس أغو وأليكس بوشارلات من منصة الفحص الكيميائي والبيولوجي ، مركز الموارد التكنولوجية والبحوث (C2RT) في معهد باستور باريس على الاقتراحات المفيدة حول البروتوكول ، وجميع أعضاء وحدة BGPB على الدعم والمناقشات العلمية ، وسيمون ليجود على القراءة النقدية للمخطوطة. تم تمويل العمل من قبل مبادرات الرعاية العالمية لمعهد كارنو للأمراض المعدية ومعهد كارنو للميكروبات والصحة (15 CARN 0017-01 و 16 CARN 0023-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 159 ، البروتين الشحمي الغشائي المتكامل N-acyltransferase ، ببتيد ثنائي الجلسرين ، ألكاين فوسفوليبيد ، مذيلات مختلطة ، كيمياء النقر ، مضان
الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nozeret, K., Pernin, A.,… More

Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter