Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

एंजाइम लक्षण वर्णन से उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग तक एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61146
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Summary

यहां प्रस्तुत एक संवेदनशील प्रतिदीप्ति परख है जो क्लिक-रसायन विज्ञान के साथ सब्सट्रेट के रूप में डायसिलग्लिसेरिल पेप्टाइड और एल्केन-फॉस्फोलिपिड्स का उपयोग करके एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ गतिविधि की निगरानी करता है।

Abstract

प्रोटियोबैक्टीरिया से लिपोप्रोटीन को तीन अभिन्न झिल्ली एंजाइमों की कार्रवाई द्वारा झिल्ली फॉस्फोलिपिड्स से प्राप्त फैटी एसिड द्वारा पोस्टट्रांसलेशनल रूप से संशोधित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्राईसिलेटेड प्रोटीन होते हैं। लिपोप्रोटीन संशोधन मार्ग में पहले चरण में फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल से प्रोलिपोप्रोटीन पर एक डायसिलेग्लिसरिल समूह का हस्तांतरण शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप डायसिलेग्लिसरील प्रोलिपोप्रोटीन होता है। दूसरे चरण में, प्रोलिपोप्रोटीन के सिग्नल पेप्टाइड को एक एपोलिपोप्रोटीन बनाता है, जो बदले में फॉस्फोलिपिड से प्राप्त तीसरे फैटी एसिड द्वारा संशोधित होता है। यह अंतिम चरण एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ (एलएनटी) द्वारा उत्प्रेरित है। अधिकांश γ-प्रोटियोबैक्टीरिया में लिपोप्रोटीन संशोधन मार्ग आवश्यक है, जिससे यह नए जीवाणुरोधी एजेंटों के विकास के लिए एक संभावित लक्ष्य बन जाता है। यहां वर्णित एलएनटी के लिए एक संवेदनशील परख है जो छोटे निरोधात्मक अणुओं की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के साथ संगत है। एंजाइम और सब्सट्रेट झिल्ली-एम्बेडेड अणु हैं; इसलिए, इन विट्रो परीक्षण का विकास सीधा नहीं है। इसमें डिटर्जेंट की उपस्थिति में सक्रिय एंजाइम का शुद्धिकरण, एल्केन-फॉस्फोलिपिड्स और डायसिलग्लिसेरिल पेप्टाइड सब्सट्रेट्स की उपलब्धता और मिश्रित मिसेल में प्रतिक्रिया की स्थिति शामिल है। इसके अलावा, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) सेटअप में गतिविधि परीक्षण का उपयोग करने के लिए, युग्मित एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं पर प्रतिक्रिया उत्पाद का सीधा रीडआउट पसंद किया जाता है। इस फ्लोरोमेट्रिक एंजाइम परख में, एल्केन-ट्राईसिलेटेड पेप्टाइड उत्पाद को एक क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया के माध्यम से फ्लोरोसेंट प्रदान किया जाता है और एक मल्टीवेल प्लेट प्रारूप में पता लगाया जाता है। यह विधि अन्य एसाइलट्रांसफेरेज़ पर लागू होती है जो फैटी एसिड युक्त सब्सट्रेट्स का उपयोग करते हैं, जिसमें फॉस्फोलिपिड्स और एसाइल-सीओए शामिल हैं।

Introduction

बैक्टीरियल लिपोप्रोटीन को उनके अमीनो-टर्मिनी में सहसंयोजक रूप से बंधे फैटी एसिड की विशेषता होती है जिसके माध्यम से उन्हें झिल्ली 1,2 में लंगर डाला जाता है। प्रोटीन का परिपक्व हिस्सा संरचना और कार्य में अत्यधिक विविध है, जिससे जीवाणु कोशिका लिफाफे में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में लिपोप्रोटीन की भूमिका की व्याख्या की जाती है।

लिपोप्रोटीन को साइटोप्लाज्मिक झिल्ली में सम्मिलन के बाद फॉस्फोलिपिड-व्युत्पन्न फैटी एसिड द्वारा संशोधित किया जाता है। प्रोलिपोप्रोटीन में एक हस्ताक्षर आकृति, लिपोबॉक्स होता है, जिसमें एक अपरिवर्तनीय सिस्टीन अवशेष होता है जो एसाइलेटेड हो जाता है और परिपक्व प्रोटीन में पहला एमिनो एसिड होता है। इस मार्ग का पहला चरण प्रोलिपोप्रोटीन फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल द्वारा उत्प्रेरित होता है: :d आसिलेग्लिसरिल ट्रांसफेरेज़ (एलजीटी), जो डायसिलेग्लिसरिल और सिस्टीन के बीच एक थियोथर लिंक के माध्यम से प्रोलिपोप्रोटीन पर फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल से डायसिलग्लिसरिल समूह को स्थानांतरित करता है। सिग्नल पेप्टिडेस II (एलएसपी) डायसिलेग्लिसेरिल प्रोलिपोप्रोटीन से सिग्नल पेप्टाइड को छोड़ देता है, जिसके परिणामस्वरूप एक एपोलिपोप्रोटीन होता है जो इसके डायसिलग्लिसरील मोइटी के माध्यम से झिल्ली में लंगर डाला जाता है। तीसरा और अंतिम चरण एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ (एलएनटी) द्वारा उत्प्रेरित होता है, जो एपोलिपोप्रोटीन पर फॉस्फोलिपिड की एसएन -1 स्थिति से फैटी एसिड जोड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप ट्राइसिलेटेड परिपक्व लिपोप्रोटीन (चित्रा 1)3) होता है। एलएनटी प्रतिक्रिया एक दो-चरण पिंग-पोंग प्रतिक्रिया है जहां एक स्थिर थियोएस्टर एसाइल एंजाइम मध्यवर्ती बनता है। प्रतिक्रिया के दूसरे चरण में एपोलिपोप्रोटीन सब्सट्रेट के एसाइलेशन से पहले लाइसोफॉस्फोलिपिड बायप्रोडक्ट जारी किया जाता है।

फॉस्फोलिपिड सब्सट्रेट विशिष्टता को एक उच्च प्रतिशत ट्राइस-ट्राइसिन यूरिया एसडीएस-पेज4 पर एन-एसाइल डायसिलेग्लिसरिल पेप्टाइड की गतिशीलता बदलाव के आधार पर एलएनटी परख में निर्धारित किया जाता है। छोटे ध्रुवीय हेडग्रुप, संतृप्त [एसएन -1] और नॉनसैचुरेटेड [एसएन -2] के साथ फॉस्फोलिपिड्स पसंदीदा सब्सट्रेट4 थे। जेल शिफ्ट परख एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ के व्यापक गतिज अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है और न ही एचटीएस के लिए निरोधात्मक अणुओं की पहचान करने के लिए उपयुक्त है। एल्काइन फैटी एसिड का उपयोग करके क्लिक-रसायन विज्ञान का सफलतापूर्वक बैक्टीरिया5 में लिपोप्रोटीन संशोधन और यूकेरियोट्स 6 में फैटी एसिड चयापचय का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गयाहै। हाल ही में, इनहिबिटर7 की पहचान करने के लिए रास पामिटोलेशन की एक इन विट्रो परख की सूचना दी गई थी।

यहां वर्णित विधि में, डिटर्जेंट में शुद्ध सक्रिय एलएनटी को मिश्रित मिसेल में सब्सट्रेट्स के साथ इनक्यूबेट किया जाता है ताकि एल्काइन-ट्राईसिलेटेड पेप्टाइड बनाया जा सके जो बाद में फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. एंजाइम और सब्सट्रेट तैयारी

  1. एंजाइम का शुद्धिकरण
    1. डिटर्जेंट घुलनशील झिल्ली से एलएनटी एंजाइम का उत्पादन और शुद्धिकरण जैसा कि पहलेवर्णित है 4,8. संक्षेप में, एलएनटी-स्ट्रेप जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करें, एलएनटी को सी-टर्मिनल स्ट्रेप टैग के साथ एन्कोडिंग करें,16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर निर्जल टेट्रासाइक्लिन (200 एनजी / एमएल) के साथ 0.6 के ओडी 600 पर।
    2. 10 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को काटें और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
    3. सेल पेलेट को बफर डब्ल्यूए (20 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 8, 150 एमएम एनएसीएल, 0.5 एमएम ईडीटीए) में 100 ओडी600 यूनिट प्रति एमएल तक पुन: निलंबित करें।
    4. 10,000 पीएसआई पर एक फ्रांसीसी दबाव सेल प्रेस के माध्यम से कोशिकाओं को दो मार्गों से तोड़ें।
    5. 20 मिनट के लिए 13,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अटूट कोशिकाओं और मलबे को हटा दें। सतह पर तैरने वाला रखें और गोली को छोड़ दें।
    6. 60 मिनट के लिए 120,000 x g पर सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें और झिल्ली पुटिकाओं (पारभासी भूरे रंग के गोली) को इकट्ठा करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    7. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए बफर डब्ल्यूए में 1% (डब्ल्यू / वी) एन-डोडेसिल β-डी-माल्टोसाइड (डीडीएम) के साथ झिल्ली गोली से अभिन्न झिल्ली प्रोटीन को घुलनशील करें। सेंट्रीफ्यूज करें और 30 मिनट के लिए 120,000 x g पर असंगत सामग्री को हटा दें। शुद्धिकरण के लिए सतह पर तैरने वाले अंश का उपयोग करें।
    8. नोज़ेरेट एट अल.8 द्वारा वर्णित एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम (सामग्री की तालिका देखें) और एक एस 400 जेल निस्पंदन कॉलम (सामग्री की तालिका देखें) पर एलएनटी-स्ट्रेप को शुद्ध करें।
    9. शुद्ध एंजाइम को बफर डब्ल्यूए में स्टोर करें जिसमें 0.05% डीडीएम और 10% ग्लिसरॉल -80 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
      नोट: एंजाइम 5 से अधिक वर्षों के लिए स्थिर है।
  2. एल्केन-फॉस्फोलिपिड और बायोटिनिलेटेड फाइब्रोब्लास्ट उत्तेजक लिगैंड (एफएसएल -1-बायोटिन) सब्सट्रेट्स की तैयारी
    1. कस्टम-संश्लेषित एल्काइन-पोप (1-हेक्साडेक-15-यिनोइल-2-ओलियोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोएथेनॉलमाइन, सामग्री की तालिका देखें) के एलिकोट 100 μL को क्लोरोफॉर्म में 1.5 एमएल ट्यूबों में घुलनशील किया गया।
    2. ट्यूबों को सिरिंज से छेदें और क्लोरोफॉर्म को 2 घंटे के लिए आरटी पर स्पीड-वैक में वाष्पित करें। सूखे फॉस्फोलिपिड नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. उपयोग से पहले 500 μM पर 0.1% ट्राइटन X-100 में एल्काइन-पोप को भंग करें। यदि आवश्यक हो तो एल्केन-पोप को घुलनशील बनाने के लिए आरटी में अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में 3 मिनट का सोनिकेशन चरण जोड़ें।
    4. एफएसएल -1-बायोटिन को 445 μM पर पानी में पुन: निलंबित करें।
      नोट: दोनों समाधानों को कम से कम 2 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. ट्यूब परख

नोट: दिन 1 पर, 1.5 एमएल ट्यूबों (चरण 2.1) में एलएनटी प्रतिक्रिया स्थापित करें और स्ट्रेप्टाविडिन (चरण 2.2) के साथ 96 अच्छी प्लेटों को कोट करें।

  1. अभिकर्मक मिश्रण और एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की तैयारी
    1. एक मानक एलएनटी परख के लिए, एलएनटी प्रतिक्रिया बफर (50 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 7.2, 150 एमएम एनएसीएल, 0.1% ट्राइस-एचसीएल पीएच 7.2, 150 एमएम एनएसीएल, 0.1% ट्राइटन एक्स -100 युक्त 18 100 1% बीएसए युक्त) में एल्केन-पोप (500 μM स्टॉक से अंतिम 50 μM) और FSL-1-बायोटिन (445 μM स्टॉक से अंतिम 50 μM) को मिलाएं। सभी शर्तों को तीन प्रतियों में निष्पादित करें।
    2. सब्सट्रेट मिश्रण (चरण 2.1.1 में तैयार) को अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में 3 मिनट के लिए रखें और एलएनटी एंजाइम (चरण 2.1.3) को जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: एमटीएसईएस (सोडियम (2-सल्फोनाटोथिल) मीथेनथियोसल्फोनेट), एक थिओल-विशिष्ट अभिकर्मक, एलएनटी8 को रोकता है। नकारात्मक नियंत्रण नमूने के रूप में उपयोग किए जाने वाले प्रतिक्रिया ट्यूबों (चरण 2.1.1) में 10 एमएम एमटीएसईएस (100% डीएमएसओ में 100 एमएम स्टॉक समाधान) जोड़ें। एलएनटी प्रतिक्रिया बफर की मात्रा को समायोजित करें ताकि कुल मात्रा 18 μL हो।
    3. 0.05% डीडीएम वाले बफर डब्ल्यूए में सक्रिय (1 ng/μL, 17.2 nM के अनुरूप) या निष्क्रिय LNT (C387S) (10 ng/μL स्टॉक का 2 μL) जोड़ें और सब्सट्रेट्स (चरण 2.1.2) के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
    4. गर्म ढक्कन के साथ थर्मोमिक्सर में 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
  2. 96 वेल प्लेटों की स्ट्रेप्टाविडिन कोटिंग
    1. H2O में 2 mg/mL पर स्ट्रेप्टाविडिन का स्टॉक घोल तैयार करें।
      नोट: इस समाधान को 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. स्टॉक समाधान से एक कामकाजी समाधान के रूप में पानी में 10 μg / mL स्ट्रेप्टाविडिन तैयार करें। 96 वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में घोल का 100 μL जोड़ें। कुओं को हवा से सुखाने के लिए ढक्कन के बिना रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके प्लेट में स्ट्रेप्टाविडिन बांधें।

नोट: दिन 2 पर क्लिक-रसायन विज्ञान (चरण 2.3) करें, एलएनटी प्रतिक्रिया मिश्रण को स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों (चरण 2.4) से बांधें, और प्रतिदीप्ति का पता लगाएं और परिणामों का विश्लेषण करें (चरण 2.5)।

  1. क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया
    1. अज़िडो-एफएएम (डीएमएसओ में 5 एमएम), टीसीईपी (ट्राइस (2-कार्बोक्सीथिल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड; पानी में तैयार 50 एमएम), टीबीटीए (ट्राइस [(1-बेंजाइल-1एच-1,2,3-ट्रायज़ोल-4-वाईएल)मिथाइल]एमाइन; टर्ट-बुटानोल में 2 एमएम: डीएमएसओ (4: 1)), और क्यूसो4-5 एच2ओ (50 एमएम) के स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. चरण 2.1.4 में तैयार एलएनटी प्रतिक्रिया मिश्रण वाले 1.5 एमएल ट्यूबों में, अभिकर्मकों को निम्नलिखित क्रम में जोड़कर क्लिक-रसायन विज्ञान करें: स्टॉक अज़िडो-एफएएम का 0.2 μL (अंतिम एकाग्रता 50 μM), स्टॉक TCEP का 0.4 μL (अंतिम एकाग्रता 1 mM), स्टॉक TBTA का 0.2 μL स्टॉक TBTA (अंतिम एकाग्रता 0.02 mM)।
    3. भंवर 5 सेकंड के लिए समाधान है। फिर स्टॉक CuSO 4 (अंतिम एकाग्रता 1 mM) का0.4 μL जोड़ें। 5 सेकंड के लिए फिर से भंवर। 1 घंटे के लिए आरटी पर अंधेरे में नमूने इनक्यूबेट करें।
  2. स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों के लिए एलएनटी प्रतिक्रिया मिश्रण का बंधन
    1. रात भर के इनक्यूबेशन के बाद स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों के कुओं को चरण 2.2.2 3x से पीबीएस-टी 1 (पीबीएस युक्त 0.05% ट्वीन -20) के 200 μL से धो लें।
      नोट: स्ट्रेप्टाविडिन प्लेटों का उपयोग तुरंत किया जा सकता है या 4 डिग्री सेल्सियस पर सूखा संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. चरण 2.3.3 से क्लिक-रसायन मिश्रण से 18 μL को 96 अच्छी तरह से स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेट में एक कुएं में स्थानांतरित करें और N-एसाइल-FSL-1-बायोटिन-FAM उत्पाद को स्ट्रेप्टाविडिन प्लेटों में बांधने के लिए PBS-T1 का 100 μL जोड़ें।
    3. स्ट्रेप्टाविडिन बाइंडिंग और फ्लोरेसेंस रीडआउट के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में बायोटिन-फ्लोरेसिन (डीएमएसओ में 3.1 एमएम स्टॉक से 0.26 μM) का उपयोग करें।
    4. थर्मोमिक्सर में अंधेरे में 1 घंटे के लिए आरटी पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें, 300 आरपीएम पर हिलें।
    5. मल्टीचैनल इलेक्ट्रॉनिक पिपेट के साथ 96 वेल प्लेटों के मैनुअल वॉश स्टेप्स निम्नानुसार करें: छह 200 μL PBS-T2 (PBS जिसमें 1% ट्वीन -20 होता है), तीन फ्लश एक पिपेट के साथ, तीन 200 μL PBS के साथ धोए जाते हैं, तीन फ्लश एक पिपेट के साथ।
  3. प्रतिदीप्ति का पता लगाना और विश्लेषण
    1. पीबीएस के 200 μL जोड़ें और प्रतिदीप्ति माइक्रोप्लेट रीडर में 520 एनएम पर प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड करें। स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में परिणाम सहेजें.
      नोट: बायोटिन-फ्लोरेसिन का उपयोग 520 एनएम पर स्ट्रेप्टाविडिन बाइंडिंग और फ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। 0.26 μM बायोटिन-फ्लोरेसिन के साथ 30,000-40,000 A.U. का प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रीडआउट की उम्मीद है। नियंत्रण सहित सभी नमूनों का तीन प्रतियों में विश्लेषण किया जाता है।
    2. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए मानक विचलन की गणना करें और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग करके नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नमूनों के लिए पी-मानों की गणना करें।

3. मल्टीवेल प्लेट परख

नोट: दिन 1 पर 384 वेल प्लेटों (चरण 3.1) में एलएनटी प्रतिक्रिया स्थापित करें और स्ट्रेप्टाविडिन (चरण 3.2) के साथ 384 अच्छी प्लेटों को कोट करें।

  1. अभिकर्मक मिश्रण और एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की तैयारी
    नोट: ट्यूब परख की तुलना में अभिकर्मकों और एंजाइम की मात्रा कम हो जाती है और एलएनटी प्रतिक्रिया सीधे 384 वेल प्लेटों में की जाती है। यह कम सामग्री के उपयोग और चरणों में कमी की अनुमति देता है जिन्हें आगे स्वचालित किया जा सकता है।
    1. सब्सट्रेट्स को निम्नानुसार मिलाएं: एल्केन-पोप (अंतिम एकाग्रता 500 μM स्टॉक से 50 μM) और FSL-1-बायोटिन (500 μM स्टॉक से अंतिम 50 μM) Lnt प्रतिक्रिया बफर (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 जिसमें 1% BSA होता है) 13.5 μL प्रति प्रतिक्रिया प्रति अच्छी तरह से 384 वेल प्लेट प्रारूप में। सभी शर्तों को तीन प्रतियों में निष्पादित करें। प्रदर्शन की जाने वाली प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की कुल मात्रा की गणना करें (यानी, एक 384 वेल प्लेट के लिए 5,184 μL)।
    2. अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में 3 मिनट के लिए सब्सट्रेट मिश्रण को सोनिकेट करें।
    3. 384 वेल प्लेट में प्रति कुएं सब्सट्रेट मिश्रण का एलिकोट 13.5 μL।
      नोट: एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एमटीएसईएस के 10 एमएम (100% डीएमएसओ में 625 एमएम स्टॉक समाधान) को प्रति अच्छी तरह से जोड़ा जा सकता है। 13.5 μL की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा तक पहुंचने के लिए Lnt बफर (चरण 3.1.1) की मात्रा समायोजित करें।
    4. एलएनटी एंजाइम (चरण 3.1.5) को जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. चरण 3.1.3 से प्रतिक्रिया मिश्रण वाले प्रत्येक कुएं में 0.5 एनजी/1एल (8.6 एनएम के अनुरूप) सक्रिय एलएनटी एंजाइम, या निष्क्रिय संस्करण (सी387एस) (0.05% डीडीएम युक्त बफर डब्ल्यूए में 5 एनजी/एसएल स्टॉक से 1.5 μL) जोड़ें (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% BSA)। अभिकर्मकों को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। कुल प्रतिक्रिया मात्रा 15 μL है।
    6. मल्टीवेल प्लेटों के लिए प्लास्टिक पन्नी के साथ प्लेट को सील करें।
    7. गर्म ढक्कन के साथ थर्मोमिक्सर में 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. स्ट्रेप्टाविडिन कोटिंग 384 वेल प्लेट्स
    1. चरण2.2.2से स्ट्रेप्टाविडिन (H2 O में 10 μg/mL) के 75 μL का उपयोग 384 वेल प्लेट के कुओं को कोट करने के लिए करें। स्ट्रेप्टाविडिन को कुओं को हवा से सुखाने के लिए ढक्कन के बिना रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके प्लेट से बांधने दें।

नोट: दिन 2 पर क्लिक-रसायन विज्ञान (चरण 3.3) करें, एलएनटी प्रतिक्रिया मिश्रण को स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों (चरण 3.4) से बांधें, प्रतिदीप्ति का पता लगाएं, और परिणामों का विश्लेषण करें (चरण 3.5)।

  1. क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया
    1. अज़िडो-एफएएम (डीएमएसओ में 1.2 एमएम), टीसीईपी (ट्राइस (2-कार्बोक्सीथिल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड; एच 2 ओ में तैयार24एमएम), टीबीटीए (ट्राइस [(1-बेंजाइल-1एच-1,2,3-ट्रायज़ोल-4-वाईएल)मिथाइल]एमाइन; टर्ट-बुटानोल में 0.48 एमएम: डीएमएसओ (4:1)) और क्यूसो4-5 एच (24एम एम) के स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. तीन क्लिक-रसायन विज्ञान अभिकर्मकों को मिलाएं: अज़िडो-एफएएम (अंतिम एकाग्रता 50 μM), TCEP (1 mM फाइनल), और TBTA (0.02 mM फाइनल) का मिश्रण, प्रत्येक 2.25 μL प्रति कुएं की अंतिम मात्रा में 0.75 μL पर। प्रति 384 वेल प्लेट में आवश्यक मात्रा की गणना करें (यानी, 384 वेल प्लेट के सभी कुओं का उपयोग करते समय 864 μL का उपयोग करें)। जोर से मिलाएं।
    3. चरण 3.1.7 से 384 वेल प्लेट में पूर्ण एलएनटी प्रतिक्रिया के लिए सीधे अभिकर्मक समाधान के 2.25 μL जोड़ें।
    4. मल्टीचैनल इलेक्ट्रॉनिक पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
    5. CuSO4 (1 mM अंतिम सांद्रता के लिए 24 mM स्टॉक से 0.75 μL) जोड़ें और मल्टीचैनल इलेक्ट्रॉनिक पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
    6. अंधेरे में 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  2. स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित 384 वेल प्लेटों के लिए एलएनटी प्रतिक्रिया मिश्रण का बंधन
    1. रात भर की इनक्यूबेशन के बाद स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों के कुओं को चरण 3.2.1 1x से 85 μL PBS-T1 के साथ धो लें।
    2. एन-एसाइल-एफएसएल-1-बायोटिन-एफएएम उत्पाद को स्ट्रेप्टाविडिन प्लेटों में बांधने के लिए चरण 3.3.6 से चरण 3.3.6 से स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेट तक इनक्यूबेशन प्लेट के प्रत्येक कुएं से क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया के 11 μL को स्थानांतरित करें।
    3. बफर पीबीएस-टी 1 के 64 μL जोड़ें।
    4. स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित कुओं को बांधने के लिए एक नियंत्रण के रूप में बायोटिन-फ्लोरेसिन (डीएमएसओ में 3.1 एमएम स्टॉक से 0.19 μM) शामिल करें।
    5. आरटी पर 384 वेल प्लेटों को 300 आरपीएम पर हिलाते हुए अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग करके प्लेटों को निम्नानुसार धोएं: 85 μL PBS-T2 के साथ 10 वॉश, प्लेटों को धोने के बीच हिलाया जाता है; 5 85 μL पीबीएस के साथ धोते हैं, प्लेटों को धोने के बीच हिलाया जाता है।
  3. प्रतिदीप्ति का पता लगाना और विश्लेषण
    1. पीबीएस (85 μL) जोड़ें और 535 एनएम पर प्रतिदीप्ति माइक्रोप्लेट रीडर में प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड करें।
    2. वर्णित के रूप में डेटा का विश्लेषण करें (चरण 2.5.2)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एलएनटी प्रतिक्रिया में फॉस्फोलिपिड्स से एसएन -1 फैटी एसिड को डायसिलेग्लिसरिल पेप्टाइड पर स्थानांतरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप परिपक्व ट्राईसिलेटेड पेप्टाइड8 होता है। यहां वर्णित इन विट्रो एलएनटी परख को सब्सट्रेट के रूप में एक एल्काइन फैटी एसिड (एल्काइन-पोप) और एफएसएल -1-बायोटिन युक्त फॉस्फोलिपिड्स का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप एल्केन-एफएसएल -1-बायोटिन का गठन होता है। एज़िडो-एफएएम के साथ एक क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया पर, इस उत्पाद को फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाना चाहिए और फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोमेट्री (चित्रा 2) द्वारा पता लगाया जाना चाहिए।

प्रतिक्रिया की स्थिति को प्लेट रीडर में 520 एनएम पर अधिकतम प्रतिदीप्ति रीडआउट के लिए अनुकूलित किया गया था। 1 ng/μL एंजाइम पर, FSL-1-बायोटिन का पूर्ण रूपांतरण देखा गयाथा (चित्र 3)। नकारात्मक नियंत्रणों में एंजाइम के बिना प्रतिक्रियाएं शामिल थीं, एंजाइम के एक निष्क्रिय संस्करण (सक्रिय साइट उत्परिवर्ती सी 387 एस), या थिओल-विशिष्ट अवरोधक एमटीएसईएस के साथ जिसके परिणामस्वरूप कम फ्लोरेसेंस का पता चलता है। बायोटिन-फ्लोरेसिन कुशलता से स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों से बंधा हुआ था और अधिकतम प्रतिदीप्ति संकेत के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। सभी प्रयोगों को तीन प्रतियों में किया गया था और मानक विचलन गणना और सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला कि परख संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थी।

एलएनटी के छोटे अणु अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए एचटीएस परख विकसित करने के लिए, अभिकर्मकों की मात्रा कम हो गई थी, और प्रतिक्रियाओं को सीधे 384 अच्छी प्लेटों में किया गया था। इसके अलावा, प्लेट वॉशर का उपयोग करके धोने के चरण स्वचालित थे ( सामग्री की तालिका देखें)। ट्यूब परख के लिए, प्रतिक्रिया संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थी, जिसमें नकारात्मक नियंत्रण (सी 387 एस) और सक्रिय एंजाइम (एलएनटी) (चित्रा 4) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था। एचटीएस में जेड 'कारक यह निर्धारित करता है कि क्या परख में प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए पर्याप्त बड़ी है9 और निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके गणना की जाती है:

Equation 1

जहां एस औसत संकेत है, बी पृष्ठभूमि संकेत है, और σ मानक विचलन है।

384 अच्छी प्लेटों का उपयोग करके एचटीएस प्रारूप में किए गए एलएनटी परख के लिए औसत जेड 'कारक >0.6 था, यह सुझाव देते हुए कि एलएनटी निषेध के लिए छोटे अणु की स्क्रीनिंग के लिए परख उत्कृष्ट थी।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटियोबैक्टीरिया में लिपोप्रोटीन के पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन में एंजाइमैटिक प्रतिक्रियाएं। अनुक्रमिक चरणों को साइटोप्लाज्मिक झिल्ली में एलजीटी10, एलएसपी11 और एलएनटी12,13,14 द्वारा उत्प्रेरित किया गया था। पीजीएन: पेप्टिडोग्लाइकन, एसपी: सिग्नल पेप्टाइड, एलबी: लिपोबॉक्स, संरक्षित आकृति जिसमें साइस + 1 होता है और फैटी एसिड के साथ संशोधित होता है और परिपक्व लिपोप्रोटीन में पहला एमिनो एसिड होता है, पीजी: फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल, जी -1-पी: ग्लिसरॉल -1-फॉस्फेट, पीई: फॉस्फेटिडिलथेनॉलमाइन, पीई: फॉस्फेटिडिलथेनॉलमाइन, लाइसोपे: लाइसो-फॉस्फेटिडिलेथेनॉलमाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ (एलएनटी) के लिए फ्लोरोमेट्रिक एंजाइम परख का योजनाबद्ध। सब्सट्रेट एफएसएल -1-बायोटिन (पीला) और एल्केन-पोप (नीला) को डिटर्जेंट में शुद्ध एलएनटी एंजाइम घुलनशील के साथ मिलाया गया था। प्रतिक्रिया 37 डिग्री सेल्सियस (चरण 1) पर मिश्रित मिसेल में की गई थी। एल्केन-एफएसएल-1-बायोटिन उत्पाद को क्लिक-केमिस्ट्री (चरण 2) द्वारा फ्लोरेसिन (नारंगी) के साथ लेबल किया गया था और स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों (चरण 3) से जुड़ने पर फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर में पता लगाया गया था। यह आंकड़ा क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) के अनुसार Nozeret et al.8 द्वारा प्रकाशित चित्रा 1B का एक संशोधित संस्करण है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: 96 वेल प्रारूप में एलएनटी गतिविधि की प्रतिदीप्ति पहचान। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों में एलएनटी प्रतिक्रियाएं की गईं। क्लिक-रसायन विज्ञान द्वारा फ्लोरोसेंट लेबलिंग और स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों से जुड़ने के बाद, प्रतिदीप्ति को प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मापा गया था। बायोटिन-फ्लोरेसिन (बायोटिन-फ्लूओ 0.26 μM) का उपयोग प्रतिदीप्ति के लिए नियंत्रण के रूप में किया गया था। बफर केवल प्रतिक्रिया बफर था। एल्काइन-पोप (50 μM), FSL-1-बायोटिन (50 μM), और सब्सट्रेट्स (एल्काइन-पोप और FSL-1-बायोटिन का मिश्रण, प्रत्येक 50 μM) को इंगित करने वाले नमूनों में एंजाइम नहीं था। नकारात्मक नियंत्रण में एमटीएसईएस (10 एमएम) और एलएनटी (सी 387 एस) के एक निष्क्रिय संस्करण के साथ अवरोध शामिल था। एलएनटी एंजाइम को 1 एनजी / μL पर जोड़ा गया था। मानक विचलन की गणना एन = 3 प्रयोगों के लिए की गई थी। ** पी-मान 0.005 <। 494 एनएम पर उत्तेजना, बैंडविड्थ 5 एनएम और उत्सर्जन 520 एनएम, बैंडविड्थ 5 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एचटीएस के साथ संगत 384 वेल प्लेट में एलएनटी प्रतिक्रिया का फ्लोरेसेंस रीडआउट। एंजाइमैटिक एलएनटी प्रतिक्रियाएं 37 डिग्री सेल्सियस पर 384 अच्छी प्लेटों में की गईं। बायोटिन-फ्लोरेसिन (बायोटिन-फ्लूओ 0.19 μM) का उपयोग प्रतिदीप्ति के लिए नियंत्रण के रूप में किया गया था। बफर प्रतिक्रिया बफर था जिसमें डीएमएसओ होता था। नकारात्मक नियंत्रण में एमटीएसईएस (10 एमएम) और एलएनटी (सी 387 एस) के एक निष्क्रिय संस्करण के साथ अवरोध शामिल था। Lnt एंजाइम को 0.5 ng/μL पर जोड़ा गया था। n = 3 प्रयोगों के लिए मानक विचलन की गणना की गई थी। P-मान 0.0005 <। 485 एनएम पर उत्तेजना, बैंडविड्थ 20 एनएम और उत्सर्जन 535 एनएम, बैंडविड्थ 25 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां वर्णित एलएनटी परख के लिए प्रोटोकॉल, ट्राईसिलेटेड उत्पाद की प्रतिदीप्ति पहचान के आधार पर, संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। स्ट्रेप्टाविडिन के लिए बायोटिन का विशिष्ट और कुशल बंधन परख में एक महत्वपूर्ण तत्व है। एलएनटी प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद छोड़े गए एल्काइन-पोप सब्सट्रेट को भी एफएएम के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है, लेकिन कई धोने के चरणों द्वारा स्ट्रेप्टाविडिन प्लेटों पर बांधने के बाद कुशलता से हटा दिया जाता है। इसके अलावा, डीएमएसओ के अलावा एलएनटी गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है और परख पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। सब्सट्रेट और एंजाइम दोनों अत्यधिक लिपोफिलिक हैं और मिश्रित मिसेल में प्रतिक्रिया की स्थिति की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण सहित उत्पाद का पता लगाने के लिए घुलनशील एंजाइमों और सब्सट्रेट्स पर निर्भर तकनीकें लागू नहींहोती हैं। परख की एकमात्र सीमा एल्केन सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की संगतता है, क्योंकि क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया इस रासायनिक समूह पर निर्भर है।

एलएनटी गतिविधि का विश्लेषण करने और सब्सट्रेट विशिष्टता 4 निर्धारित करने के लिए पिछले अध्ययनों में जेल शिफ्ट परख की सूचना दी गईहै। वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, और फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोमेट्री के समानांतर, इन-जेल फ्लोरेसेंस डिटेक्शन का उपयोग एलएनटी गतिविधि8 की निगरानी के लिए किया जा सकता है, हालांकि यह प्रारूप एचटीएस के लिए उपयुक्त नहीं है। ट्यूब परख एलएनटी उत्परिवर्ती के गतिज और तुलनात्मक अध्ययन के लिए विशेष रूप से दिलचस्प है। फॉस्फोलिपिड सब्सट्रेट विशिष्टता को विभिन्न श्रृंखला लंबाई और संतृप्ति की डिग्री से बने एल्काइन फैटी एसिड के साथ बैक्टीरिया के चयापचय लेबलिंग द्वारा प्राप्त एल्केन-फॉस्फोलिपिड्स का उपयोग करके संबोधित किया जा सकताहै।

384 वेल प्लेट प्रारूप एचटीएस अध्ययनों के साथ संगत है क्योंकि सक्रिय एंजाइम और सब्सट्रेट केवल नियंत्रण के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर देखा जाता है। >0.6 के औसत जेड' कारक की गणना यहां प्रस्तुत अनुकूलित स्थितियों के साथ की गई थी। परख की उच्च प्रजनन क्षमता उच्च जेड कारक में योगदान देती है। सफल एचटीएस के लिए 0.6 से ऊपर एक जेड 'कारक की सिफारिश की जाती है। वॉश स्टेप्स एक स्वचालित प्लेट वॉशर के उपयोग के साथ कुशल हैं। अन्य चरणों को और अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें अभिकर्मकों की पाइपिंग शामिल है, जो छोटे अणुओं के बड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग की अनुमति देगा।

प्रोटोकॉल अन्य एसाइलट्रांसफेरेज़ पर लागू होता है जो फैटी एसिड युक्त सब्सट्रेट का उपयोग करते हैं यदि एल्काइन समूह एंजाइम द्वारा सब्सट्रेट मान्यता के साथ संगत हैं। यूकेरियोटिक पाल्मिटोयल एसाइल ट्रांसफेरेज़ (पीएटी) के विशिष्ट अवरोधकों की पहचान पर एक हालिया अध्ययन सब्सट्रेट 7 के रूप में झिल्ली-बाध्य एंजाइम और एल्केन-एसाइल-सीओए का उपयोग करने का वर्णन करताहै। क्लिक-केमिस्ट्री फ्लोरोजेनिक डिटेक्शन द्वारा एक छोटे बायोटिनाइलेटेड रास पेप्टाइड के पाल्मिटोलेशन को देखा गया था। इस परख के 384 वेल प्लेट प्रारूप में एक पायलट स्क्रीन ने पीएटी के विशिष्ट अवरोधकों की पहचान की, यह सुझाव देते हुए कि क्लिक-रसायन विज्ञान और संवेदनशील प्रतिदीप्ति पहचान के साथ संयुक्त एल्केन फैटी एसिड समूह से बने सब्सट्रेट लक्ष्य-आधारित एचटीएस के लिए एक आशाजनक विधि है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल पर उपयोगी सुझावों के लिए इंस्टीट्यूट पाश्चर पेरिस में केमोजीनोमिक एंड बायोलॉजिकल स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म, सेंटर फॉर टेक्नोलॉजिकल रिसोर्सेज एंड रिसर्च (सी 2आरटी) से फैब्रिस अगोउ और एलिक्स बूचरलैट को धन्यवाद देते हैं, समर्थन और वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए बीजीपीबी यूनिट के सभी सदस्य, और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए साइमन लेगुड। काम को इंस्टीट्यूट कार्नोट संक्रामक रोगों और इंस्टीट्यूट कार्नोट माइक्रोब्स एंड हेल्थ (15 सीएआरएन 0017-01 और 16 सीएआरएन 0023-01) की वैश्विक देखभाल पहल द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).

Tags

जैव रसायन अंक 159 अभिन्न झिल्ली एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ डायसिलेग्लिसरील पेप्टाइड एल्केन-फॉस्फोलिपिड मिश्रित मिसेल क्लिक-रसायन विज्ञान प्रतिदीप्ति
एंजाइम लक्षण वर्णन से उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग तक एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nozeret, K., Pernin, A.,… More

Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter