Summary
מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.
Abstract
ליפופרוטאינים מפרוטאובקטריה משתנים לאחר תרגום על ידי חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים של הממברנה על ידי פעולה של שלושה אנזימי ממברנה אינטגרליים, וכתוצאה מכך חלבונים טריאצילטים. השלב הראשון במסלול שינוי ליפופרוטאין כרוך בהעברת קבוצת דיאצילגליצריל מפוספטידילגליצרול אל הפרוליפופרוטאין, וכתוצאה מכך דיאצילגליצריל פרוליפופרוטאין. בשלב השני, פפטיד האות של פרוליפופרוטאין נבקע, ויוצר אפוליפופרוטאין, אשר בתורו משתנה על ידי חומצת שומן שלישית הנגזרת מפוספוליפיד. שלב אחרון זה הוא זרז על ידי אפוליפופרוטאין N-acyltransferase (Lnt). מסלול שינוי הליפופרוטאין חיוני ברוב הפרוטאובקטריה γ, מה שהופך אותו למטרה פוטנציאלית לפיתוח חומרים אנטיבקטריאליים חדשים. המתוארת כאן היא בדיקה רגישה עבור Lnt התואמת להקרנה בתפוקה גבוהה של מולקולות מעכבות קטנות. האנזים והסובסטרטים הם מולקולות משובצות ממברנה; לכן, הפיתוח של בדיקת מבחנה אינו פשוט. זה כולל טיהור של האנזים הפעיל בנוכחות דטרגנט, את הזמינות של אלקין-פוספוליפידים וסובסטרטים פפטידים diacylglyceryl, ואת תנאי התגובה במיזלים מעורבים. יתר על כן, על מנת להשתמש במבחן הפעילות במערך סינון בתפוקה גבוהה (HTS), עדיפה קריאה ישירה של מוצר התגובה על פני תגובות אנזימטיות מצומדות. בבדיקת אנזים פלואורומטרית זו, תוצר הפפטיד האלקין-טריאצטילטי הופך לפלואורסצנטי באמצעות תגובת קליק-כימיה ומזוהה בפורמט של צלחת מרובת בתים. שיטה זו ישימה לאצילטרנספראזות אחרות המשתמשות במצעים המכילים חומצות שומן, כולל פוספוליפידים ואציל-CoA.
Introduction
ליפופרוטאינים חיידקיים מאופיינים בחומצות שומן הקשורות באופן קוולנטי באמינו-טרמיני שלהם, שדרכן הם מעוגנים לממברנות 1,2. החלק הבוגר של החלבון מגוון מאוד במבנה ובתפקוד, ובכך מסביר את תפקידם של ליפופרוטאינים בתהליכים ביולוגיים שונים במעטפת התא החיידקי.
ליפופרוטאינים משתנים על ידי חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים לאחר החדרתם לקרום הציטופלסמי. הפרוליפופרוטאינים מכילים מוטיב חתימה, הליפובוקס, המכיל שאריות ציסטאין אינווריאנטיות שהופכות לאצילציה וחומצת האמינו הראשונה בחלבון הבוגר. השלב הראשון של מסלול זה מזורז על ידי פרוליפופרוטאין פוספטידילגליצרול::d iacylglyceryl transferase (Lgt), אשר מעביר את קבוצת הדיאצילגליצריל מפוספטידילגליצרול אל הפרוליפופרוטאין באמצעות קישור תיואתר בין דיאצילגליצריל לציסטאין. אות פפטידאז II (Lsp) מבקע את פפטיד האות מדיאצילגליצריל פרוליפופרוטאין, והתוצאה היא אפוליפופרוטאין המעוגן לתוך הממברנה דרך הדיאצילגליצריל מואטי שלו. השלב השלישי והאחרון הוא זרז על ידי אפוליפופרוטאין N-acyltransferase (Lnt), אשר מוסיף חומצת שומן ממיקום sn-1 של פוספוליפיד על אפוליפופרוטאין, וכתוצאה מכך ליפופרוטאין בוגר טריאצילציה (איור 1)3. תגובת Lnt היא תגובת פינג-פונג דו-שלבית שבה נוצר אנזים תיואסטר אציל יציב. תוצר הלוואי של הליזופוספוליפידים משתחרר לפני האצילציה של מצע האפוליפופרוטאין בשלב השני של התגובה.
הספציפיות של המצע הפוספוליפידי נקבעת בבדיקת Lnt בהתבסס על תזוזת הניידות של N-אציל דיאצילגליצריל פפטיד על אחוז גבוה של Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. פוספוליפידים עם קבוצות ראש קוטביות קטנות, רוויים [sn-1] ולא רוויים [sn-2], היו מצעים מועדפים4. בדיקת הסטת הג'ל אינה מתאימה למחקרים קינטיים נרחבים של אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז וגם לא ל-HTS לזיהוי מולקולות מעכבות. כימיה של קליקים באמצעות חומצות שומן אלקין שימשה בהצלחה לחקר שינוי ליפופרוטאין בחיידקים5 ומטבוליזם של חומצות שומן באאוקריוטים6. לאחרונה דווח על בדיקה חוץ-גופית של Ras palmitoylation לזיהוי מעכבים7.
בשיטה המתוארת כאן, Lnt פעיל מטוהר בדטרגנט הוא דגירה עם מצעים ב micelles מעורבים כדי ליצור פפטיד alkyne-triacylated כי הוא זוהה לאחר מכן על ידי ספקטרומטריה פלואורסצנטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת אנזימים וסובסטרטים
- טיהור אנזים
- לייצר ולטהר את אנזים Lnt מממברנות מסיסות דטרגנט כפי שתואר קודם לכן 4,8. בקצרה, לגרום לביטוי של הגן lnt-strep, קידוד Lnt עם תג C-terminal Strep, ב OD 600 של 0.6 עם טטרציקלין נטול מים (200 ng / mL) ב 37 °C במשך 16 שעות.
- קצירת תאים על ידי צנטריפוגה בגודל 4,000 x גרם למשך 10 דקות והשלכת הסופרנטנט.
- השהה את כדור התא במאגר WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) ל-100 OD600 יחידות למ"ל.
- לשבור את התאים על ידי שני מעברים דרך לחץ תא לחץ צרפתי ב 10,000 psi.
- הסר תאים רציפים ופסולת על ידי צנטריפוגה בגודל 13,000 x g למשך 20 דקות. שמור את הסופרנטנט והשלך את הכדור.
- צנטריפוגה supernatant ב 120,000 x גרם במשך 60 דקות ולאסוף את שלפוחית הממברנה (גלולה בצבע חום שקוף). השליכו את הסופר-נטנט.
- יש לבודד את חלבוני הממברנה האינטגרליים מכדור הממברנה עם 1% (w/v) n-דודציל β-D-מלטוזיד (DDM) במאגר WA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). צנטריפוגה והסרה של חומר בלתי מבודד ב 120,000 x גרם למשך 30 דקות. השתמש בחלק העליון לטיהור.
- יש לטהר את Lnt-strep על עמודת כרומטוגרפיית זיקה (ראו טבלת חומרים) ועמודת סינון ג'ל S400 (ראו טבלת חומרים) כמתואר על ידי Nozeret et al.8.
- אחסנו את האנזים המטוהר ב-buffer WA המכיל 0.05% DDM ו-10% גליצרול בטמפרטורה של -80°C.
הערה: האנזים יציב למעלה מ-5 שנים.
- הכנת מצעי ליגנד מגרה אלקין-פוספוליפידים וביוטינילציה פיברובלסטים (FSL-1-ביוטין)
- Aliquot 100 μL של אלקין-POPE מסונתז בהתאמה אישית (1-הקסדק-15-ינואיל-2-אולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוטאנולמין, ראו טבלת חומרים) מסולסל בכלורופורם לצינורות 1.5 מ"ל.
- חודרים את הצינורות עם מזרק ומאדים את הכלורופורם במהירות ב-RT למשך שעתיים. יש לאחסן את דגימות הפוספוליפידים היבשים בטמפרטורה של -20°C.
- יש להמיס את האלקין-POPE ב-0.1% Triton X-100 ב-500 μM לפני השימוש. הוסף שלב סוניקציה של 3 דקות באמבט מים קולי ב- RT כדי לבודד אלקיין-POPE במידת הצורך.
- יש למרוח את FSL-1-ביוטין במים בעוצמה של 445 מיקרומטר.
הערה: ניתן לאחסן את שני הפתרונות בטמפרטורה של -20°C למשך חודשיים לפחות.
2. בדיקת צינור
הערה: ביום הראשון, הגדר את תגובת Lnt בצינורות 1.5 מ"ל (שלב 2.1) וצפה 96 צלחות באר עם סטרפטווידין (שלב 2.2).
- הכנת תערובת מגיבים ותגובה אנזימטית
- עבור בדיקת Lnt סטנדרטית, יש לערבב אלקין-POPE (50 μM סופיים ממלאי של 500 μM) ו-FSL-1-ביוטין (ריכוז סופי של 50 μM ממלאי של 445 μM) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 המכיל 1% BSA) בנפח סופי של 18 μL בצינורות 1.5 מ"ל. בצע את כל התנאים במשולש.
- סוניקו את תערובת המצע (מוכנה בשלב 2.1.1) במשך 3 דקות באמבט מים קולי ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני הוספת אנזים Lnt (שלב 2.1.3).
הערה: MTSES (נתרן (2-סולפונטואתיל)מתנאתיוסולפונט), מגיב ספציפי לתיול, מעכב Lnt8. הוסף 10 mM MTSES (תמיסת מלאי של 100 mM ב- 100% DMSO) לצינורות התגובה (שלב 2.1.1) כדי לשמש כדגימות בקרה שלילית. כוונן את עוצמת הקול של מאגר התגובה Lnt כך שהנפח הכולל יהיה 18 μL. - הוסף Lnt פעיל (1 ng/μL, המתאים ל-17.2 ננומטר) או לא פעיל Lnt (C387S) (2 μL מתוך מלאי של 10 ng/μL במאגר WA המכיל 0.05% DDM) וערבב עם המצעים (שלב 2.1.2) על-ידי צנרת למעלה ולמטה.
- לדגום את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות בתרמומיקסר עם מכסה מחומם.
- ציפוי סטרפטווידין של 96 לוחות באר
- הכינו תמיסת מלאי של סטרפטאבידין במינון של 2 מ"ג/מ"ל ב-H2O.
הערה: ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים. - מתמיסת המלאי יש להכין 10 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטאבידין במים כפתרון עובד. הוסף 100 μL של התמיסה לכל באר של צלחת 96 באר. קושרים סטרפטאבידין לצלחת על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ללא מכסה לייבוש האוויר של הבארות.
- הכינו תמיסת מלאי של סטרפטאבידין במינון של 2 מ"ג/מ"ל ב-H2O.
הערה: ביום 2 בצעו כימיה של קליקים (שלב 2.3), קשרו את תערובת התגובה Lnt ללוחות מצופים סטרפטאבידין (שלב 2.4), וזיהו פלואורסצנטיות ונתחו את התוצאות (שלב 2.5).
- תגובת קליק-כימיה
- הכן פתרונות מלאי של Azido-FAM (5 mM ב- DMSO), TCEP (טריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלוריד; 50 mM מוכן במים), TBTA (טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-yl)מתיל]אמין; 2 mM בטרט-בוטאנול:DMSO (4:1)), ו- CuSO4∙5H 2 O (50 mM מוכן טרי ב- H2O).
- בצינורות של 1.5 מ"ל המכילים את תערובת התגובה Lnt שהוכנה בשלב 2.1.4, בצע כימיה של קליקים על ידי הוספת הריאגנטים בסדר הבא: 0.2 μL של מלאי Azido-FAM (ריכוז סופי 50 μM), 0.4 μL של מלאי TCEP (ריכוז סופי 1 mM), 0.2 μL של מלאי TBTA (ריכוז סופי 0.02 mM).
- וורטקס הפתרון במשך 5 שניות. לאחר מכן להוסיף 0.4 μL של מלאי CuSO4 (ריכוז סופי 1 mM). וורטקס שוב במשך 5 שניות. דגרו את הדגימות בחושך ב-RT למשך שעה אחת.
- קשירת תערובת תגובת Lnt לצלחות מצופות סטרפטווידין
- לשטוף את הבארות של לוחות מצופה streptavidin לאחר הדגירה בלילה משלב 2.2.2 3x עם 200 μL של PBS-T1 (PBS המכיל 0.05% Tween-20).
הערה: ניתן להשתמש בצלחות סטרפטווידין באופן מיידי או לאחסן יבשות בטמפרטורה של 4°C. - העבר 18 μL מתערובת קליק-כימיה משלב 2.3.3 לבאר בצלחת מצופה סטרפטווידין 96 באר והוסף 100 μL של PBS-T1 כדי לקשור N-acyl-FSL-1-biotin-FAM המוצר ללוחות סטרפטאווידין.
- השתמש בביוטין-פלואורסצין (0.26 מיקרומטר ממלאי של 3.1 mM ב-DMSO) כבקרה חיובית עבור קשירת סטרפטאבידין וקריאת פלואורסצנציה.
- דגרו את הצלחות ב-RT במשך שעה אחת בחושך בתרמומיקסר, ורעדו ב-300 סל"ד.
- בצע שלבי שטיפה ידניים של 96 לוחות הבאר עם פיפטה אלקטרונית רב ערוצית כדלקמן: שש שטיפות עם 200 μL של PBS-T2 (PBS המכיל 1% Tween-20), שלוש שטיפות עם פיפטה, שלוש שטיפות עם 200 μL של PBS, שלוש שטיפות עם פיפטה.
- לשטוף את הבארות של לוחות מצופה streptavidin לאחר הדגירה בלילה משלב 2.2.2 3x עם 200 μL של PBS-T1 (PBS המכיל 0.05% Tween-20).
- זיהוי וניתוח פלואורסצנציה
- הוסף 200 μL של PBS ורשום את הפלואורסצנציה ב-520 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי. שמור תוצאות בתוכנת גיליון אלקטרוני.
הערה: ביוטין-פלואורסצין משמש כבקרה חיובית לקשירת סטרפטאבידין וזיהוי פלואורסצנטיות ב-520 ננומטר. קריאה ניתנת לשחזור של 30,000-40,000 A.U. עם 0.26 μM ביוטין-פלואורסצין צפויה. כל הדגימות מנותחות במשולש, כולל בקרות. - חשב את סטיית התקן עבור כל תגובה ואת חישוב ערכי P עבור בקרות שליליות ודגימות חיוביות באמצעות בדיקת t לא מותאמת באמצעות תוכנה סטטיסטית.
- הוסף 200 μL של PBS ורשום את הפלואורסצנציה ב-520 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי. שמור תוצאות בתוכנת גיליון אלקטרוני.
3. בדיקת צלחת מרובת בתים
הערה: ביום 1 הגדר את תגובת Lnt ב-384 צלחות באר (שלב 3.1) וצפה 384 צלחות באר עם סטרפטווידין (שלב 3.2).
- הכנת תערובת מגיבים ותגובה אנזימטית
הערה: כמות הריאגנטים והאנזים מופחתת בהשוואה לבדיקת הצינורית ותגובת Lnt מבוצעת ישירות ב-384 צלחות קידוח. זה מאפשר שימוש בפחות חומר והפחתת צעדים שניתן להפוך לאוטומטיים עוד יותר.- ערבבו את המצעים באופן הבא: אלקין-POPE (ריכוז סופי של 50 מיקרומטר ממלאי של 500 מיקרומטר) ו-FSL-1-ביוטין (50 מיקרומטר סופיים ממלאי של 500 מיקרומטר) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 המכיל 1% BSA) בנפח של 13.5 μL לכל תגובה לכל באר בפורמט של צלחת באר 384. בצע את כל התנאים במשולש. חשב את הכמות הכוללת של ריאגנטים הנדרשת למספר התגובות שיש לבצע (כלומר, 5,184 μL עבור צלחת קידוח אחת של 384).
- סוניקו את תערובת המצע במשך 3 דקות באמבט מים קולי.
- Aliquot 13.5 μL של תערובת המצע לכל באר בלוח באר 384.
הערה: כבקרה שלילית, ניתן להוסיף 10 mM של MTSES (תמיסת מלאי של 625 mM ב- 100% DMSO) לכל באר. התאם את עוצמת הקול של מאגר Lnt (שלב 3.1.1) כדי להגיע לנפח תגובה סופי של 13.5 μL. - דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני הוספת אנזים Lnt (שלב 3.1.5).
- הוסף 0.5 ng/μL (המקביל ל-8.6 ננומטר) אנזים Lnt פעיל, או גרסה לא פעילה (C387S) (1.5 μL ממלאי של 5 ng/μL במאגר WA המכיל 0.05% DDM) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% BSA) לכל באר המכילה את תערובת התגובה משלב 3.1.3. ערבבו ריאגנטים על ידי צנרת למעלה ולמטה. נפח התגובה הכולל הוא 15 μL.
- אטמו את הצלחת עם רדיד אלומיניום ללוחות מרובי-כלים.
- דגירה ב-37°C למשך 16 שעות בתרמומיקסר עם מכסה מחומם.
- ציפוי סטרפטאבידין 384 לוחות באר
- יש להשתמש ב-75 μL של סטרפטווידין (10 מיקרוגרם/מ"לב-H 2 O) משלב 2.2.2 כדי לצפות בארות של צלחת באר 384. תנו לסטרפטווידין להיקשר לצלחת על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ללא מכסה לייבוש האווירי של הבארות.
הערה: ביום 2 בצעו כימיה של קליקים (שלב 3.3), קשרו את תערובת התגובה Lnt ללוחות מצופים סטרפטאבידין (שלב 3.4), זיהו פלואורסצנטיות ונתחו את התוצאות (שלב 3.5).
- תגובת קליק-כימיה
- הכן תמיסות מלאי של אזידו-FAM (1.2 mM ב-DMSO), TCEP (טריס(2-קרבוקסיאתיל)פוספין הידרוכלוריד; 24 mM מוכן ב-H 2 O), TBTA (טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-yl)מתיל]אמין; 0.48 mM בטרט-בוטנול:DMSO (4:1)) ו-CuSO4∙5H 2 O (24 mM מוכן טרי ב-H2O).
- שלבו את שלושת הריאגנטים בכימיה של קליקים: תערובת של Azido-FAM (ריכוז סופי 50 μM), TCEP (1 mM סופי) ו-TBTA (0.02 mM סופי), כל אחד ב-0.75 μL בנפח סופי של 2.25 μL לכל באר. חשב את הנפח הנדרש לכל צלחת באר 384 (כלומר, השתמש ב- 864 μL כאשר נעשה שימוש בכל הבארות של צלחת הבאר 384). מערבבים במרץ.
- הוסף 2.25 μL של תמיסת הריאגנט לכל באר ישירות לתגובת Lnt שהושלמה בלוח הבאר 384 משלב 3.1.7.
- מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטה אלקטרונית רב ערוצית.
- הוסף CuSO4 (0.75 μL ממלאי של 24 mM לריכוז סופי של 1 mM) וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטה אלקטרונית רב-ערוצית.
- דגירה ב-RT למשך שעה אחת בחושך.
- קשירת תערובת תגובת Lnt ללוחות באר מצופים סטרפטווידין 384
- לשטוף את הבארות של לוחות מצופה streptavidin לאחר הדגירה בלילה משלב 3.2.1 1x עם 85 μL PBS-T1.
- העבר 11 μL של תגובת הקליק-כימיה מכל באר של לוחית הדגירה משלב 3.3.6 לצלחת המצופה סטרפטווידין משלב 3.4.1 כדי לקשור את המוצר N-acyl-FSL-1-biotin-FAM ללוחות הסטרפטאווידין.
- הוסף 64 μL של מאגר PBS-T1.
- כלול ביוטין-פלואורסצין (0.19 μM ממלאי של 3.1 mM ב-DMSO) כבקרה לקשירת בארות מצופות סטרפטאווידין.
- דגרו את 384 לוחות הקידוח ב-RT במשך שעה אחת בחושך בתרמומיקסר, רועדים ב-300 סל"ד.
- לשטוף את הצלחות באמצעות מכונת כביסה צלחת אוטומטית כדלקמן: 10 כביסות עם 85 μL PBS-T2, צלחות מזועזעות בין כביסות; 5 כביסות עם 85 μL PBS, צלחות מזועזעות בין הכביסה.
- זיהוי וניתוח פלואורסצנציה
- הוסף PBS (85 μL) ורשום פלואורסצנטיות בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות במהירות של 535 ננומטר.
- ניתוח נתונים כמתואר (שלב 2.5.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתגובת Lnt חומצת השומן sn-1 מפוספוליפידים מועברת לפפטיד דיאצילגליצריל, וכתוצאה מכך פפטיד טריאצילטי בוגר8. בדיקת Lnt במבחנה המתוארת כאן נועדה להשתמש בפוספוליפידים המכילים חומצת שומן אלקיין (אלקין-POPE) ו- FSL-1-ביוטין כמצעים, וכתוצאה מכך נוצרת אלקין-FSL-1-ביוטין. בתגובת קליק-כימיה עם אזידו-FAM, מוצר זה אמור להיות מסומן באופן פלואורסצנטי ומזוהה על-ידי ספקטרומטריית פלואורסצנציה (איור 2).
תנאי התגובה הותאמו לקריאה פלואורסצנטית מקסימלית ב-520 ננומטר בקורא צלחות. באנזים 1 ng/μL,נצפתה המרה מלאה של FSL-1-ביוטין 8 (איור 3). בקרות שליליות כללו תגובות ללא אנזים, עם גרסה לא פעילה של האנזים (מוטציה פעילה C387S), או עם MTSES מעכבים ספציפיים לתיול המביאים לזיהוי פלואורסצנטי נמוך. ביוטין-פלואורסצין נקשר ביעילות לצלחות מצופות סטרפטווידין ושימש כבקרה פנימית לאות פלואורסצנטי מרבי. כל הניסויים בוצעו בחישובי משולש וסטיית תקן וניתוח סטטיסטי הראה כי הבדיקה רגישה וניתנת לשחזור.
על מנת לפתח בדיקת HTS לסינון מעכבי מולקולות קטנות של Lnt, כמות הריאגנטים הופחתה, והתגובות בוצעו ישירות ב-384 לוחות באר. יתר על כן, שלבי הכביסה היו אוטומטיים באמצעות מכונת כביסה (ראו טבלת חומרים). באשר לבדיקת הצינורית, התגובה הייתה רגישה וניתנת לשחזור, עם הבדל משמעותי בין הבקרה השלילית (C387S) לבין האנזים הפעיל (Lnt) (איור 4). ב- HTS גורם Z' קובע אם תגובה בבדיקה גדולה מספיק למטרות סינון9 ומחושבת באמצעות המשוואה הבאה:
כאשר S הוא האות הממוצע, B הוא אות רקע, ו-σ הוא סטיית תקן.
פקטור Z' הממוצע היה >0.6 עבור בדיקת Lnt שבוצעה בפורמט HTS באמצעות 384 לוחות באר, מה שמרמז על כך שהבדיקה לסינון מולקולה קטנה לעיכוב Lnt הייתה יוצאת מן הכלל.
איור 1: תגובות אנזימטיות בשינוי פוסט-טרנסלציוני של ליפופרוטאין בפרוטאובקטריה. הצעדים הרציפים היו מזורזים על ידי Lgt10, Lsp 11 ו- Lnt12,13,14 בקרום הציטופלסמי. PGN: פפטידוגליקן, SP: פפטיד אותות, LB: ליפובוקס, מוטיב שמור המכיל Cys+1 ומעובד עם חומצות שומן וחומצת האמינו הראשונה בליפופרוטאין בוגר, PG: פוספטידיל-גליצרול, G-1-P: גליצרול-1-פוספט, PE: פוספטידיל-אתנולמין, lysoPE: lyso- פוספטידיל-אתנולמין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: סכמת של בדיקת האנזים הפלואורומטרי עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז (Lnt). הסובסטרטים FSL-1-ביוטין (צהוב) ואלקין-POPE (כחול) עורבבו עם אנזים Lnt מטוהר שעבר סילוק בחומרי ניקוי. התגובה בוצעה במיצלות מעורבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (שלב 1). המוצר אלקין-FSL-1-ביוטין סומן בפלואורסצין (כתום) על ידי קליק-כימיה (שלב 2) וזוהה בקורא לוחות פלואורסצנטיים לאחר קשירתו ללוחות מצופים סטרפטאווידין (שלב 3). האיור הוא גרסה שונה של איור 1B שפורסמה על ידי Nozeret et al.8 על פי רישיון Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: זיהוי פלואורסצנטי של פעילות Lnt בפורמט 96 באר. תגובות Lnt בוצעו בצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר תיוג פלואורסצנטי על ידי כימיה של קליקים וקשירה ללוחות מצופים סטרפטאווידין, פלואורסצנציה נמדדה על ידי ספקטרומטריית פלואורסצנציה. ביוטין-פלואורסצין (ביוטין-פלואו 0.26 מיקרומטר) שימש כבקרה על פלואורסצנציה. המאגר היה מאגר תגובה בלבד. דגימות המצביעות על אלקין-POPE (50 μM), FSL-1-ביוטין (50 μM) ומצעים (תערובת של אלקין-POPE ו-FSL-1-ביוטין, 50 μM כל אחד) לא הכילו אנזים. בקרות שליליות כללו עיכוב עם MTSES (10 mM) וגרסה לא פעילה של Lnt (C387S). אנזים Lnt נוסף ב-1 ng/μL. סטיות התקן חושבו עבור n = 3 ניסויים. ** ערך P < 0.005. עירור ב-494 ננומטר, רוחב פס 5 ננומטר ופליטה ב-520 ננומטר, רוחב פס 5 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: קריאה פלואורסצנטית של תגובת Lnt בצלחת 384 התואמת היטב ל-HTS. תגובות Lnt אנזימטיות בוצעו ב 384 לוחות באר ב 37 מעלות צלזיוס. ביוטין-פלואורסצין (ביוטין-פלואו 0.19 מיקרומטר) שימש כבקרה על פלואורסצנציה. Buffer היה חיץ תגובה המכיל DMSO. בקרות שליליות כללו עיכוב עם MTSES (10 mM) וגרסה לא פעילה של Lnt (C387S). אנזים Lnt נוסף ב-0.5 ננוגרם/μL. סטיות התקן חושבו עבור n = 3 ניסויים. ערך P < 0.0005. עירור ב-485 ננומטר, רוחב פס 20 ננומטר ופליטה ב-535 ננומטר, רוחב פס 25 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול של בדיקת Lnt המתואר כאן, המבוסס על זיהוי פלואורסצנטי של המוצר הטריאצילי, הוא רגיש וניתן לשחזור. ההיקשרות הספציפית והיעילה של ביוטין לסטרפטווידין היא מרכיב מרכזי בבדיקה. מצע Alkyne-POPE שנותר לאחר השלמת תגובת Lnt מסומן גם הוא באופן פלואורסצנטי עם FAM אך מוסר ביעילות לאחר קשירת לוחות הסטרפטווידין על ידי שלבי שטיפה מרובים. יתר על כן, הוספת DMSO אינה משפיעה על פעילות Lnt ואין לה השפעה על הבדיקה. גם הסובסטרט וגם האנזים הם מאוד ליפופיליים ודורשים תנאי תגובה במיקסים מעורבים. טכניקות התלויות באנזימים ומצעים מסיסים לזיהוי מוצרים, כולל קיטוב פלואורסצנטי, אינן ישימות8. המגבלה היחידה של הבדיקה היא התאימות של האנזים עם סובסטרט אלקין, מכיוון שתגובת הקליק-כימיה תלויה בקבוצה כימית זו.
מבחני הסטת ג'ל דווחו במחקרים קודמים כדי לנתח את פעילות Lnt ולקבוע את ספציפיות המצע4. עם הפרוטוקול הנוכחי, ובמקביל לספקטרומטריה פלואורסצנטית, ניתן להשתמש בזיהוי פלואורסצנטי בג'ל כדי לפקח על פעילות Lnt8, אם כי פורמט זה אינו מתאים ל- HTS. בדיקת הצינור מעניינת במיוחד למחקרים קינטיים והשוואתיים של מוטציות Lnt. ניתן לטפל בספציפיות של מצע פוספוליפידים באמצעות אלקין-פוספוליפידים המתקבלים על ידי תיוג מטבולי של חיידקים עם חומצות שומן אלקין המורכבות מאורכי שרשרת שונים ומידת רוויה כמתואר8.
פורמט צלחת הבאר 384 תואם למחקרי HTS מכיוון שנצפה הבדל משמעותי בין אנזים פעיל לבין בקרת סובסטרט בלבד. פקטור Z' ממוצע של >0.6 חושב עם התנאים הממוטבים שהוצגו כאן. יכולת השחזור הגבוהה של הבדיקה תורמת לגורם ה-Z הגבוה. עבור HTS מוצלח גורם Z' מעל 0.6 מומלץ9. שלבי הכביסה יעילים עם שימוש במכונת כביסה אוטומטית. צעדים אחרים יכולים להיות מותאמים עוד יותר, כולל pipetting של ריאגנטים, אשר יאפשר סינון של ספריות גדולות של מולקולות קטנות.
הפרוטוקול חל על אצילטרנספראזות אחרות המשתמשות במצעים המכילים חומצות שומן אם קבוצות אלקין תואמות לזיהוי מצע על ידי האנזים. מחקר שנערך לאחרונה על זיהוי מעכבים ספציפיים של פלמיטואיל אציל טרנספראז אאוקריוטי (PAT) מתאר שימוש באנזים הקשור לממברנה ואלקין-אציל-CoA כסובסטרט7. פלמיטוילציה של פפטיד ראס קטן שעבר ביוטינילציה נצפתה על ידי זיהוי פלואורוגני בכימיה של קליקים. מסך פיילוט בפורמט צלחת באר 384 של בדיקה זו זיהה מעכבים ספציפיים של PAT, מה שמרמז על כך שמצעים המורכבים מקבוצת חומצות שומן אלקיין בשילוב עם כימיה של קליקים וזיהוי פלואורסצנטי רגיש הם שיטה מבטיחה ל- HTS מבוסס מטרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לפבריס אגו ואליקס בוצ'רלט מפלטפורמת הסינון הכימוגנומית והביולוגית, המרכז למשאבים טכנולוגיים ומחקר (C2RT) במכון פסטר פריז על הצעות מועילות לפרוטוקול, לכל חברי יחידת BGPB לתמיכה ודיונים מדעיים, ולסיימון לגוד על קריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה מומנה על ידי יוזמות טיפול גלובליות של המכון קרנו מחלות זיהומיות והמכון קרנו מיקרובים ובריאות (15 CARN 0017-01 ו 16 CARN 0023-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L.
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
