Summary
여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.
Abstract
프로테오박테리아의 지단백질은 3개의 통합 막 효소의 작용에 의해 막 인지질에서 파생된 지방산에 의해 번역 후 변형되어 트리아실화 단백질을 생성합니다. 지단백질 변형 경로의 첫 번째 단계는 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴기를 전달하여 디아실글리세릴 프롤리포단백질을 생성하는 것입니다. 두 번째 단계에서, 프롤리포 단백질의 신호 펩티드는 절단되어 아포지 단백질을 형성하고, 이는 차례로 인지질로부터 유래 된 제 3 지방산에 의해 변형된다. 이 마지막 단계는 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제 (Lnt)에 의해 촉매됩니다. 지단백질 변형 경로는 대부분의 γ-프로테오박테리아에서 필수적이므로 새로운 항균제 개발을 위한 잠재적인 표적이 됩니다. 여기에 설명된 것은 작은 억제 분자의 고처리량 스크리닝과 호환되는 Lnt에 대한 민감한 분석입니다. 효소와 기질은 막에 매립된 분자입니다. 따라서 체외 테스트의 개발은 간단하지 않습니다. 여기에는 세제의 존재 하에서 활성 효소의 정제, 알킨-인지질 및 디아실글리세릴 펩티드 기질의 가용성, 혼합 미셀에서의 반응 조건이 포함됩니다. 또한, 고처리량 스크리닝(HTS) 설정에서 활성 테스트를 사용하려면 결합 효소 반응보다 반응 생성물의 직접 판독이 선호됩니다. 이 형광 효소 분석에서 알킨-트리아실화 펩타이드 생성물은 클릭-화학 반응을 통해 형광으로 렌더링되고 멀티웰 플레이트 형식으로 검출됩니다. 이 방법은 인지질 및 아실 -CoA를 포함한 지방산 함유 기질을 사용하는 다른 아실 트랜스퍼 라제에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
박테리아 지단백질은 아미노 말단에서 공유 결합 지방산이 특징이며,이를 통해 막 1,2에 고정됩니다. 단백질의 성숙한 부분은 구조와 기능이 매우 다양하여 박테리아 세포 외피의 다양한 생물학적 과정에서 지단백질의 역할을 설명합니다.
지단백질은 세포질 막에 삽입 된 후 인지질 유래 지방산에 의해 변형됩니다. 프로리포단백질은 시그니처 모티프인 리포박스(lipobox)를 함유하고 있으며, 리포박스는 아실화되는 불변 시스테인 잔기와 성숙 단백질의 첫 번째 아미노산을 포함합니다. 이 경로의 첫 번째 단계는 프로리포단백질 포스파티딜글리세롤::d이아실글리세릴 트랜스퍼라제(Lgt)에 의해 촉매되며, 이는 디아실글리세릴과 시스테인 사이의 티오에테르 연결을 통해 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴 그룹을 전달합니다. 신호 펩티다아제 II(Lsp)는 디아실글리세릴 프로리포단백질로부터 신호 펩티드를 절단하여, 디아실글리세릴 부분을 통해 막에 고정된 아포지단타인을 생성한다. 세 번째이자 마지막 단계는 인지질의 sn-1 위치에서 지방산을 아포지단백질에 추가하여 삼아실화된 성숙한 지단백질을 생성하는 아포지단백 N-아실트랜스퍼라제(Lnt)에 의해 촉매됩니다(그림 1)3. Lnt 반응은 안정한 티오에스테르 아실 효소 중간체가 형성되는 2단계 탁구 반응입니다. 리소포지질 부산물은 반응의 제2 단계에서 아포지단백질 기질의 아실화 전에 방출된다.
인지질 기질 특이성은 높은 비율의 트리스-트리신 우레아 SDS-PAGE4에 대한 N-아실 디아실글리세릴 펩티드의 이동성 이동에 기초한 Lnt 분석에서 결정된다. 포화 [sn-1] 및 불포화 [sn-2]의 작은 극성 헤드 그룹을 갖는 인지질이 바람직한 기질4이었다. 겔 이동 분석은 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제의 광범위한 동역학 연구 나 HTS가 억제 분자를 식별하는 데 적합하지 않습니다. 알킨 지방산을 사용한 클릭 화학은 박테리아5 의 지단백질 변형과 진핵 생물6의 지방산 대사를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 최근에, 라스 팔미토일화의 시험관내 분석이 억제제7을 확인하기 위해 보고되었다.
여기에 설명된 방법에서, 세제 중 정제된 활성 Lnt는 혼합 미셀 내의 기질과 함께 인큐베이션되어 알킨-트리아실화된 펩티드를 형성하고, 이 펩타이드는 후속적으로 형광 분광법에 의해 검출된다.
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Protocol
1. 효소 및 기질 준비
- 효소의 정제
- 앞서 설명한 대로 세제 가용화된 막으로부터 Lnt 효소를 생산하고 정제합니다 4,8. 간단히 말해서, 37°C에서 16시간 동안 무수 테트라사이클린(200ng/mL)으로 0.6의 OD600에서 C-말단 스트렙 태그로 Lnt를 암호화하는 lnt-연쇄상 구균 유전자의 발현을 유도합니다.
- 4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 상청액을 버린다.
- 세포 펠렛을 mL당 100 OD600 유닛으로 완충액 WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) 중에 재현탁시킨다.
- 10,000 psi에서 프렌치 압력 셀 프레스를 통해 2계대로 세포를 분해한다.
- 13,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 끊어지지 않은 세포와 파편을 제거합니다. 상청액을 보관하고 펠릿을 폐기하십시오.
- 상청액을 120,000 x g 에서 60분 동안 원심분리하고 막 소포(반투명 갈색 컬러 펠릿)를 수집한다. 상청액을 폐기하십시오.
- 막 펠릿의 통합 막 단백질을 완충액 WA의 1%(w/v) n-도데실 β-D-말토사이드(DDM)로 실온(RT)에서 30분 동안 가용화합니다. 원심분리하고 불용화된 물질을 120,000 x g 에서 30분 동안 제거합니다. 정제를 위해 상청액 분획을 사용하십시오.
- Nozeret et al.8에 설명된 대로 친화성 크로마토그래피 컬럼(재료 표 참조) 및 S400 겔 여과 컬럼(재료 표 참조)에서 Lnt-연쇄상 구균을 정제합니다.
- 정제된 효소를 -80°C에서 0.05% DDM 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액 WA에 저장한다.
알림: 효소는 5 년 이상 안정적입니다.
- 알킨-인지질 및 비오티닐화 섬유아세포 자극 리간드(FSL-1-비오틴) 기질의 제조
- 100 μL의 맞춤 합성 알킨-POPE (1- 헥사 덱 -15- 이노일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 재료 표 참조)를 클로로포름에 1.5mL 튜브에 가용화했습니다.
- 주사기로 튜브를 관통하고 RT에서 2 시간 동안 속도 진공에서 클로로포름을 증발시킵니다. 건조 인지질 샘플을 -20°C에서 보관한다.
- 사용하기 전에 500 μM에서 0.1% 트리톤 X-100에 알킨-POPE를 용해시킵니다. 필요한 경우 알킨-POPE를 가용화하기 위해 RT의 초음파 수조에서 3분 초음파 처리 단계를 추가합니다.
- FSL-1-비오틴을 445μM의 물에 재현탁합니다.
알림: 두 용액 모두 -20°C에서 최소 2개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 튜브 분석
참고: 1일째에 Lnt 반응을 1.5mL 튜브에 설정하고(2.1단계) 96웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅합니다(2.2단계).
- 시약 혼합물의 제조 및 효소 반응
- 표준 Lnt 분석의 경우, Lnt 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% BSA를 함유하는 0.1% 트리톤 X-100)에 알킨-POPE (50 μM 스톡으로부터 최종 50 μM) 및 FSL-1-비오틴 (445 μM 스톡으로부터 50 μM의 최종 농도)을 1.5 mL 튜브에서 18 μL의 최종 부피로 혼합한다. 모든 조건을 세 번 수행하십시오.
- 기질 혼합물 (단계 2.1.1에서 제조)을 초음파 수조에서 3 분 동안 초음파 처리하고 Lnt 효소 (단계 2.1.3)를 첨가하기 전에 37 °C에서 5 분 동안 배양한다.
참고: 티올 특이적 시약인 MTSES(나트륨(2-설포나토에틸)메탄티오설포네이트)는 Lnt8을 억제합니다. 음성 대조군 샘플로 사용할 반응 튜브(단계 2.1.1)에 10mM MTSE(100% DMSO 중 100mM 스톡 용액)를 추가합니다. 총 부피가 18 μL가 되도록 Lnt 반응 완충액의 부피를 조정합니다. - 활성(1ng/μL, 17.2nM에 해당) 또는 비활성 Lnt(C387S)(0.05% DDM을 포함하는 버퍼 WA에 10ng/μL 스톡 2μL)를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 기질과 혼합합니다(단계 2.1.2).
- 반응물을 가열된 뚜껑이 있는 써모믹서에서 16시간 동안 37°C에서 인큐베이션합니다.
- 96웰 플레이트의 스트렙타비딘 코팅
- H2O에서 2 mg / mL의 스트렙 타비딘 저장 용액을 준비하십시오.
알림: 이 용액은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. - 스톡 용액에서 작업 용액으로 물에 10μg/mL 스트렙타비딘을 준비합니다. 100 μL의 용액을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 스트렙타비딘을 뚜껑 없이 밤새 37°C에서 인큐베이션하여 플레이트에 결합시켜 웰을 공기 건조시켰다.
- H2O에서 2 mg / mL의 스트렙 타비딘 저장 용액을 준비하십시오.
참고: 2일째에 클릭 화학(2.3단계)을 수행하고 Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합하고(2.4단계) 형광을 검출하고 결과를 분석합니다(단계 2.5).
- 클릭-화학 반응
- 아지도-FAM (DMSO 중 5 mM), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; 물에서 제조된 50 mM), TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민; 2 mM 중 tert-부탄올:DMSO (4:1)), 및 CuSO4∙5H2O (H2O에서 신선하게 제조된50mM)의 원액을 준비한다.
- 단계 2.1.4에서 제조된 Lnt 반응 혼합물을 포함하는 1.5 mL 튜브에, 다음 순서로 시약을 첨가하여 클릭 화학을 수행한다: 0.2 μL 스톡 아지도-FAM (최종 농도 50 μM), 0.4 μL 스톡 TCEP (최종 농도 1 mM), 0.2 μL 스톡 TBTA (최종 농도 0.02 mM).
- 용액을 5 초 동안 소용돌이. 이어서 0.4 μL의 스톡CuSO4 (최종 농도 1 mM)를 첨가한다. 5 초 동안 다시 소용돌이. 샘플을 RT의 어둠 속에서 1 시간 동안 배양합니다.
- Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합
- 2.2.2 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 200 μL의 PBS-T1(0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS)로 3x 세척한다.
알림: 스트렙타비딘 플레이트는 즉시 사용하거나 4°C에서 건조한 상태로 보관할 수 있습니다. - 단계 2.3.3의 클릭 화학 혼합물에서 18μL를 96웰 스트렙타비딘 코팅 플레이트의 웰로 옮기고 100μL의 PBS-T1을 추가하여 N-아실-FSL-1-비오틴-FAM 생성물을 스트렙타비딘 플레이트에 결합시킵니다.
- 비오틴-플루오레세인(DMSO의 3.1mM 스톡에서 0.26μM)을 스트렙타비딘 결합 및 형광 판독을 위한 양성 대조군으로 사용합니다.
- 플레이트를 RT에서 열혼합기의 어둠 속에서 1시간 동안 배양하고 300rpm으로 흔들어줍니다.
- 다음과 같이 다채널 전동 피펫으로 96웰 플레이트의 수동 세척 단계를 수행합니다: 200μL의 PBS-T2(1% Tween-20을 포함하는 PBS)로 6회 세척, 피펫으로 3회 세척, 200μL의 PBS로 3회 세척, 피펫으로 3회 세척.
- 2.2.2 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 200 μL의 PBS-T1(0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS)로 3x 세척한다.
- 형광 검출 및 분석
- 200 μL의 PBS를 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더에서 520 nm에서의 형광을 기록하였다. 스프레드시트 소프트웨어에 결과를 저장합니다.
참고: 비오틴-플루오레세인은 520nm에서 스트렙타비딘 결합 및 형광 검출을 위한 양성 대조군으로 사용됩니다. 0.26 μM 비오틴-플루오레세인으로 30,000–40,000 AU의 재현 가능한 판독값이 예상됩니다. 모든 샘플은 대조군을 포함하여 삼중으로 분석됩니다. - 각 반응에 대한 표준 편차를 계산하고 통계 소프트웨어를 사용하여 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 음성 대조군과 양성 표본에 대한 P-값을 계산합니다.
- 200 μL의 PBS를 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더에서 520 nm에서의 형광을 기록하였다. 스프레드시트 소프트웨어에 결과를 저장합니다.
3. 멀티웰 플레이트 분석
참고: 1일째에 384웰 플레이트(단계 3.1)에서 Lnt 반응을 설정하고 384웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅합니다(단계 3.2).
- 시약 혼합물의 제조 및 효소 반응
참고: 시약과 효소의 양은 튜브 분석에 비해 감소하고 Lnt 반응은 384웰 플레이트에서 직접 수행됩니다. 이를 통해 재료를 덜 사용하고 추가로 자동화 할 수있는 단계를 줄일 수 있습니다.- 기질을 다음과 같이 혼합한다: Lnt 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% BSA를 함유하는 0.1% 트리톤 X-100) 중 알킨-POPE (500 μM 스톡으로부터 최종 농도 50 μM) 및 FSL-1-비오틴 (500 μM 스톡으로부터 최종 50 μM) 및 384 웰 플레이트 형식으로 웰당 반응당 13.5 μL의 부피로. 모든 조건을 세 번 수행하십시오. 수행할 반응 수에 필요한 시약의 총량을 계산합니다(즉, 384웰 플레이트 1개에 대해 5,184μL).
- 초음파 수조에서 3 분 동안 기질 혼합물을 초음파 처리하십시오.
- 384 웰 플레이트에서 웰당 기질 혼합물의 13.5 μL를 분취한다.
참고: 음성 대조군으로 웰당 10mM의 MTSES(100% DMSO 중 625mM 스톡 용액)를 추가할 수 있습니다. Lnt 완충액의 부피(단계 3.1.1)를 조정하여 최종 반응 부피 13.5μL에 도달합니다. - Lnt 효소를 첨가하기 전에 37°C에서 5분 동안 배양한다(단계 3.1.5).
- Lnt 반응 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% BSA)에 0.5ng/μL(8.6nM에 해당) 활성 Lnt 효소 또는 불활성 변이체(C387S)(0.05% DDM을 포함하는 완충액 WA의 5ng/μL 재고에서 1.5μL)를 단계 3.1.3의 반응 혼합물을 포함하는 각 웰에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 시약을 혼합합니다. 총 반응 부피는 15 μL이다.
- 멀티웰 플레이트용 플라스틱 호일로 플레이트를 밀봉합니다.
- 가열된 뚜껑이 있는 써모믹서에서 37°C에서 16시간 동안 배양합니다.
- 스트렙타비딘 코팅 384웰 플레이트
- 2.2.2단계의 스트렙타비딘 75μL(H2O중 10μg/mL)를 사용하여 384웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 스트렙타비딘을 뚜껑 없이 밤새 37°C에서 배양하여 플레이트에 결합시켜 웰을 자연 건조시킨다.
참고: 2일째에 클릭 화학(3.3단계)을 수행하고 Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합하고(3.4단계), 형광을 감지하고 결과를 분석합니다(단계 3.5).
- 클릭-화학 반응
- 아지도-FAM (DMSO 중 1.2 mM), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; H2O에서 제조된 24 mM), TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민; 3급-부탄올에서 0.48 mM:DMSO (4:1)) 및 CuSO4∙5H2O (H2O에서 신선하게 제조된 24mM)의 스톡 용액을 준비한다.
- Azido-FAM(최종 농도 50μM), TCEP(최종 1mM) 및 TBTA(최종 0.02mM)의 혼합물인 Azido-FAM(최종 농도 50μM), 웰당 최종 부피 2.25μL에서 각각 0.75μL의 혼합물의 세 가지 클릭 화학 시약을 결합합니다. 384 웰 플레이트 당 필요한 부피를 계산합니다 (즉, 384 웰 플레이트의 모든 웰이 사용되는 경우 864 μL 사용). 격렬하게 섞는다.
- 웰당 2.25 μL의 시약 용액을 3.1.7 단계에서 완료된 384 웰 플레이트의 Lnt 반응에 직접 추가합니다.
- 멀티채널 전동 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
- CuSO4(1mM 최종 농도에 대해 24mM 스톡에서 0.75μL)를 추가하고 멀티채널 전동 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
- 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅된 384웰 플레이트에 결합
- 1x 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 85 μL PBS-T1로 1x 세척한다.
- 11μL의 클릭-화학 반응을 단계 3.3.6의 인큐베이션 플레이트의 각 웰로부터 단계 3.4.1로부터의 스트렙타비딘-코팅된 플레이트로 옮겨 N-아실-FSL-1-비오틴-FAM 생성물을 스트렙타비딘 플레이트에 결합시킨다.
- 64 μL의 버퍼 PBS-T1을 추가합니다.
- 스트렙타비딘-코팅된 웰에 결합하기 위한 대조군으로서 비오틴-플루오레세인(DMSO 내의 3.1 mM 스톡으로부터 0.19 μM)을 포함한다.
- 384웰 플레이트를 RT에서 1시간 동안 열혼합기에서 300rpm으로 진탕하면서 배양합니다.
- 다음과 같이 자동 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척하십시오 : 85 μL PBS-T2로 10 회 세척, 세척 사이에 플레이트를 흔들어줍니다. 85 μL PBS로 5회 세척하고, 세척 사이에 플레이트를 진탕한다.
- 형광 검출 및 분석
- PBS(85μL)를 추가하고 535nm의 형광 마이크로플레이트 리더에 형광을 기록합니다.
- 설명된 대로 데이터를 분석합니다(2.5.2단계).
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Representative Results
Lnt 반응에서 인지질의 sn-1 지방산은 디아실글리세릴 펩티드로 옮겨져 성숙한 트리아실화 펩티드8을 생성합니다. 여기에 설명된 시험관 내 Lnt 분석은 알킨 지방산(알킨-POPE) 및 FSL-1-비오틴을 기질로 함유하는 인지질을 사용하여 알킨-FSL-1-비오틴을 형성하도록 설계되었습니다. azido-FAM과의 클릭 화학 반응 시 이 제품은 형광 표지를 거쳐 형광 분광법으로 검출되어야 합니다(그림 2).
반응 조건은 플레이트 리더에서 520nm에서 최대 형광 판독을 위해 최적화되었습니다. 1 ng / μL 효소에서 FSL-1- 비오틴의 완전한 전환이 관찰되었습니다(그림 3). 음성 대조군에는 효소가 없는 반응, 효소의 비활성 변이체(활성 부위 돌연변이 C387S) 또는 낮은 형광 검출을 초래하는 티올 특이적 억제제 MTSES와의 반응이 포함되었습니다. 비오틴-플루오레세인은 스트렙타비딘-코팅된 플레이트에 효율적으로 결합하고 최대 형광 신호를 위한 내부 대조군으로 사용되었다. 모든 실험은 삼중 및 표준 편차 계산으로 수행되었으며 통계 분석은 분석이 민감하고 재현 가능하다는 것을 보여주었습니다.
Lnt의 소분자 억제제를 스크리닝하기 위한 HTS 분석을 개발하기 위해, 시약의 양을 줄이고, 반응을 384웰 플레이트에서 직접 수행하였다. 또한 세척 단계는 플레이트 와셔를 사용하여 자동화되었습니다( 재료 표 참조). 튜브 분석의 경우 반응은 민감하고 재현 가능했으며 음성 대조군(C387S)과 활성 효소(Lnt) 간에 상당한 차이가 있었습니다(그림 4). HTS에서 Z' 인자는 분석의 반응이 스크리닝 목적9 에 충분히 큰지 여부를 결정하며 다음 방정식을 사용하여 계산됩니다.
여기서 S는 평균 신호, B는 배경 신호, σ는 표준 편차입니다.
384웰 플레이트를 사용하여 HTS 형식으로 수행된 Lnt 분석에 대한 평균 Z' 계수는 >0.6이었으며, 이는 Lnt 억제를 위한 소분자 스크리닝을 위한 분석이 탁월함을 시사합니다.
그림 1: 프로테오박테리아에서 지단백질의 번역 후 변형에서의 효소 반응. 순차적 단계는 세포질 막에서 Lgt10, Lsp 11 및 Lnt12,13,14에 의해 촉매되었다. PGN : 펩티도 글리 칸, SP : 신호 펩티드, LB : 리포 박스, Cys + 1을 함유하고 지방산 및 성숙한 지단백질의 첫 번째 아미노산으로 변형 된 보존 모티프, PG : 포스파티딜 글리세롤, G-1-P : 글리세롤 -1- 포스페이트, PE : 포스파티딜 에탄올 아민, lysoPE : 리소 포스파티딜 에탄올 아민. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제(Lnt)에 대한 형광 효소 분석의 개략도. 기질 FSL-1-비오틴(황색) 및 알킨-POPE(청색)를 세제에 가용화된 정제된 Lnt 효소와 혼합하였다. 반응은 37°C에서 혼합 마이셀에서 수행하였다(단계 1). 알킨-FSL-1-비오틴 생성물을 클릭 화학(단계 2)에 의해 플루오레세인(오렌지)으로 표지하고, 스트렙타비딘-코팅된 플레이트에 결합할 때 형광 플레이트 판독기에서 검출하였다(단계 3). 이 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이선스(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에 따라 Nozeret et al.8에 의해 출판된 그림 1B의 수정된 버전입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 96웰 형식에서 Lnt 활성의 형광 검출. Lnt 반응은 37°C에서 16시간 동안 튜브에서 수행되었다. 클릭 화학에 의한 형광 표지 및 스트렙타비딘-코팅된 플레이트에 결합한 후, 형광 분광분석법에 의해 형광을 측정하였다. 비오틴-플루오레세인(비오틴-플루오0.26 μM)을 형광에 대한 대조군으로 사용하였다. 완충액은 반응 완충액만이었다. 알킨-POPE (50 μM), FSL-1-비오틴 (50 μM), 및 기질 (알킨-POPE 및 FSL-1-비오틴의 혼합, 각각 50 μM)을 나타내는 샘플은 효소를 함유하지 않았다. 음성 대조군에는 MTSES (10 mM)와 Lnt (C387S)의 비활성 변이체를 사용한 억제가 포함되었다. Lnt 효소를 1 ng/μL로 첨가하였다. n=3 실험에 대해 표준편차를 계산하였다. ** p-값은 0.005<. 494nm에서의 여기, 대역폭 5nm에서의 방출 및 520nm에서의 방출, 대역폭 5nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HTS와 호환되는 384웰 플레이트에서 Lnt 반응의 형광 판독값. 효소적 Lnt 반응은 37°C에서 384 웰 플레이트에서 수행되었다. 비오틴-플루오레세인(비오틴-플루오0.19 μM)을 형광에 대한 대조군으로 사용하였다. 완충액은 DMSO를 포함하는 반응 완충액이었다. 음성 대조군에는 MTSES (10 mM)와 Lnt (C387S)의 비활성 변이체를 사용한 억제가 포함되었다. Lnt 효소를 0.5 ng/μL로 첨가하였다. n=3 실험에 대해 표준 편차를 계산하였다. p-값은 0.0005<. 485nm에서의 여기, 대역폭 20nm에서의 여기 및 535nm에서의 방출, 대역폭 25nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 Lnt 분석을 위한 프로토콜은 트리아실화된 생성물의 형광 검출을 기반으로 민감하고 재현 가능합니다. 비오틴과 스트렙타비딘의 특이적이고 효율적인 결합은 분석의 핵심 요소입니다. Lnt 반응 완료 후 남은 알킨-POPE 기질은 또한 FAM으로 형광 표지되지만 여러 세척 단계에 의해 스트렙타비딘 플레이트 상에 결합한 후 효율적으로 제거된다. 또한, DMSO의 첨가는 Lnt 활성에 영향을 미치지 않으며, 분석에 영향을 미치지 않는다. 기질과 효소는 모두 친유성이 높으며 혼합 미셀에서 반응 조건이 필요합니다. 형광 분극을 포함하여 생성물 검출을 위해 가용성 효소 및 기질에 의존하는 기술은 적용되지 않습니다8. 분석의 유일한 한계는 효소와 알킨 기질의 상용성인데, 이는 클릭-화학 반응이이 화학 그룹에 의존하기 때문입니다.
겔 이동 분석은 Lnt 활성을 분석하고 기질 특이성을 결정하기 위해 이전 연구에서보고되었습니다4. 현재 프로토콜을 사용하고 형광 분광법과 병행하여 겔 내 형광 검출을 사용하여 Lnt 활성8을 모니터링할 수 있지만 이 형식은 HTS에 적합하지 않습니다. 튜브 분석은 Lnt 돌연변이의 운동 및 비교 연구에 특히 흥미 롭습니다. 인지질 기질 특이성은8에 기재된 바와 같이 다양한 사슬 길이 및 포화도로 구성된 알킨 지방산으로 박테리아의 대사 표지에 의해 얻어진 알킨-인지질을 사용하여 해결할 수 있다.
384웰 플레이트 형식은 활성 효소와 기질 전용 대조군 간에 상당한 차이가 관찰되기 때문에 HTS 연구와 호환됩니다. >0.6의 평균 Z' 계수는 여기에 제시된 최적화된 조건으로 계산되었습니다. 분석의 높은 재현성은 높은 Z' 계수에 기여합니다. 성공적인 HTS의 경우 0.6 이상의 Z' 계수가 권장됩니다9. 세척 단계는 자동 플레이트 와셔를 사용하여 효율적입니다. 시약의 피펫팅을 포함한 다른 단계를 더욱 최적화할 수 있으며, 이를 통해 작은 분자의 큰 라이브러리를 스크리닝할 수 있습니다.
이 프로토콜은 알킨기가 효소에 의한 기질 인식과 호환되는 경우 지방산 함유 기질을 사용하는 다른 아실 트랜스퍼 라제에 적용 할 수 있습니다. 진핵 생물 팔미 토일 아실 트랜스퍼 라제 (PAT)의 특정 억제제 확인에 관한 최근 연구는 막 결합 효소와 알킨-아실 -CoA를 기질7로 사용하는 것을 설명합니다. 작은 비오티닐화된 Ras 펩티드의 팔미토일화는 플루오로클릭 검출에 의해 관찰되었다. 이 분석의 384웰 플레이트 형식의 파일럿 스크린은 PAT의 특정 억제제를 식별했으며, 이는 클릭 화학 및 민감한 형광 검출과 결합된 알킨 지방산 그룹으로 구성된 기질이 표적 기반 HTS에 대한 유망한 방법임을 시사합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
파리시 파스퇴르 연구소의 기술 자원 및 연구 센터(C2RT)의 화학유전체 및 생물학적 스크리닝 플랫폼의 Fabrice Agou와 Alix Boucharlat에게 프로토콜에 대한 유용한 제안, 지원 및 과학적 토론을 위한 BGPB 부서의 모든 구성원, 원고를 비판적으로 읽어준 Simon Legood에게 감사드립니다. 작업은 Carnot 전염병 연구소와 Carnot 미생물 및 건강 연구소의 Global Care Initiatives (15 CARN 0017-01 및 16 CARN 0023-01)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
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