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Biochemistry

Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61146
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Summary

Présenté ici est un test de fluorescence sensible pour surveiller l’activité de l’apolipoprotéine N-acyltransférase en utilisant le peptide diacylglycéryle et les alcyne-phospholipides comme substrats avec la chimie click.

Abstract

Les lipoprotéines des protéobactéries sont modifiées post-traductionnellement par des acides gras dérivés des phospholipides membranaires par l’action de trois enzymes membranaires intégrales, ce qui donne des protéines triacylées. La première étape de la voie de modification des lipoprotéines implique le transfert d’un groupe diacylglycéryle du phosphatidylglycérol à la prolipoprotéine, ce qui entraîne la prolipoprotéine diacylglycéryle. Dans la deuxième étape, le peptide signal de la prolipoprotéine est clivé, formant une apolipoprotéine, qui à son tour est modifiée par un troisième acide gras dérivé d’un phospholipide. Cette dernière étape est catalysée par l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt). La voie de modification des lipoprotéines est essentielle dans la plupart des γ-protéobactéries, ce qui en fait une cible potentielle pour le développement de nouveaux agents antibactériens. Décrit ici est un test sensible pour le Lnt qui est compatible avec le criblage à haut débit de petites molécules inhibitrices. L’enzyme et les substrats sont des molécules enfouies dans la membrane; Par conséquent, le développement d’un test in vitro n’est pas simple. Cela comprend la purification de l’enzyme active en présence de détergent, la disponibilité d’alcynes-phospholipides et de substrats peptidiques diacylglycéryliques, et les conditions de réaction dans des micelles mixtes. De plus, afin d’utiliser le test d’activité dans une configuration de criblage à haut débit (HTS), la lecture directe du produit de réaction est préférable aux réactions enzymatiques couplées. Dans ce dosage enzymatique fluorométrique, le produit peptidique alcyne-triacylé est rendu fluorescent par une réaction de chimie de clic et détecté dans un format de plaque multipuits. Cette méthode est applicable à d’autres acyltransférases qui utilisent des substrats contenant des acides gras, y compris les phospholipides et l’acyl-CoA.

Introduction

Les lipoprotéines bactériennes sont caractérisées par des acides gras liés par covalence au niveau de leurs amino-terminus à travers lesquels elles sont ancrées dans les membranes 1,2. La partie mature de la protéine est très diversifiée dans sa structure et sa fonction, ce qui explique le rôle des lipoprotéines dans divers processus biologiques dans l’enveloppe cellulaire bactérienne.

Les lipoprotéines sont modifiées par les acides gras dérivés des phospholipides après insertion dans la membrane cytoplasmique. Les prolipoprotéines contiennent un motif de signature, la lipobox, qui contient un résidu de cystéine invariant qui devient acylé et le premier acide aminé dans la protéine mature. La première étape de cette voie est catalysée par la prolipoprotéine phosphatidylglycérol::d iacylglycéryl transférase (Lgt), qui transfère le groupe diacylglycéryle du phosphatidylglycérol à la prolipoprotéine via un lien thioéther entre le diacylglycéryle et la cystéine. La peptidase signal II (Lsp) clive le peptide signal de la prolipoprotéine diacylglycéryle, ce qui donne une apolipoprotéine qui est ancrée dans la membrane par sa fraction diacylglycéryle. La troisième et dernière étape est catalysée par l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt), qui ajoute un acide gras de la position sn-1 du phospholipide sur l’apolipoprotéine, ce qui donne des lipoprotéines matures triacylées (Figure 1)3. La réaction Lnt est une réaction de ping-pong en deux étapes où un intermédiaire de l’enzyme acyle thioester stable est formé. Le sous-produit lysophospholipide est libéré avant l’acylation du substrat de l’apolipoprotéine dans la deuxième étape de la réaction.

La spécificité du substrat phospholipide est déterminée dans un test Lnt basé sur le décalage de mobilité du peptide N-acyl diacylglycéryle sur un pourcentage élevé de tris-tricine urée SDS-PAGE4. Les phospholipides avec de petits groupes de tête polaires, saturés [sn-1] et non saturés [sn-2], étaient des substrats préférés 4. Le test de décalage de gel n’est pas approprié pour des études cinétiques approfondies de l’apolipoprotéine N-acyltransférase ni pour que HTS identifie des molécules inhibitrices. La chimie du clic utilisant des acides gras alcynes a été utilisée avec succès pour étudier la modification des lipoprotéines chez les bactéries5 et le métabolisme des acides gras chez les eucaryotes6. Récemment, un essai in vitro de Ras palmitoylation a été signalé pour identifier les inhibiteurs7.

Dans la méthode décrite ici, le Lnt actif purifié dans le détergent est incubé avec des substrats dans des micelles mixtes pour former un peptide alcyne-triacylé qui est ensuite détecté par spectrométrie de fluorescence.

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Protocol

1. Préparation d’enzymes et de substrats

  1. Purification de l’enzyme
    1. Produire et purifier l’enzyme Lnt à partir de membranes solubilisées détergentes comme décrit précédemment 4,8. Brièvement, induire l’expression du gène lnt-streptocoque, codant pour Lnt avec un marqueur streptococcique C-terminal, à OD 600 de 0,6 avec de la tétracycline anhydre (200 ng/mL) à 37 °C pendant 16 h.
    2. Récolter les cellules par centrifugation à 4 000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.
    3. Resuspendre la pastille de cellule dans le tampon WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) à 100 OD600 unités par mL.
    4. Casser les cellules par deux passages à travers une presse à cellule de pression française à 10 000 psi.
    5. Enlevez les cellules intactes et les débris par centrifugation à 13 000 x g pendant 20 min. Conserver le surnageant et jeter la pastille.
    6. Centrifuger le surnageant à 120 000 x g pendant 60 min et recueillir les vésicules membranaires (pastille de couleur brune translucide). Jetez le surnageant.
    7. Solubiliser les protéines membranaires intégrales de la pastille membranaire avec 1% (p/v) de n-dodécyl β-D-maltoside (DDM) dans le tampon WA pendant 30 min à température ambiante (RT). Centrifuger et éliminer les matières insolubilisées à 120 000 x g pendant 30 min. Utilisez la fraction surnageante pour la purification.
    8. Purifier le streptocoque Lnt sur une colonne de chromatographie d’affinité (voir le tableau des matériaux) et une colonne de filtration sur gel S400 (voir le tableau des matériaux) comme décrit par Nozeret et coll.8.
    9. Conserver l’enzyme purifiée dans un tampon WA contenant 0,05 % de DDM et 10 % de glycérol à -80 °C.
      NOTE: L’enzyme est stable pendant plus de 5 ans.
  2. Préparation de substrats d’alcyne-phospholipides et de ligands stimulant les fibroblastes biotinylés (FSL-1-biotine)
    1. Aliquote 100 μL d’alcyne-POPE synthétisé sur mesure (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, voir le tableau des matières) solubilisé dans le chloroforme en tubes de 1,5 mL.
    2. Percer les tubes avec une seringue et évaporer le chloroforme dans un speed-vac à TA pendant 2 h. Conserver les échantillons secs de phospholipides à -20 °C.
    3. Dissoudre l’alcyne-POPE dans du Triton X-100 à 0,1 % à 500 μM avant utilisation. Ajouter une étape de sonication de 3 minutes dans un bain-marie à ultrasons à RT pour solubiliser l’alcyne-POPE si nécessaire.
    4. Resuspendre le FSL-1-biotine dans l’eau à 445 μM.
      REMARQUE: Les deux solutions peuvent être conservées à -20 ° C pendant au moins 2 mois.

2. Essai en tube

REMARQUE : Le jour 1, mettre en place la réaction Lnt dans des tubes de 1,5 mL (étape 2.1) et enduire 96 plaques de puits de streptavidine (étape 2.2).

  1. Préparation du mélange de réactifs et réaction enzymatique
    1. Pour un test Lnt standard, mélanger l’alcyne-POPE (50 μM final à partir d’un stock de 500 μM) et la biotine FSL-1 (concentration finale de 50 μM à partir d’un stock de 445 μM) dans un tampon de réaction Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contenant 1% BSA) à un volume final de 18 μL dans des tubes de 1,5 mL. Effectuez toutes les conditions en trois exemplaires.
    2. Soniquer le mélange de substrat (préparé à l’étape 2.1.1) pendant 3 min dans un bain-marie à ultrasons et incuber à 37 °C pendant 5 min avant l’ajout de l’enzyme Lnt (étape 2.1.3).
      REMARQUE: MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate), un réactif spécifique du thiol, inhibe le Lnt8. Ajouter 10 mM de MTSES (solution mère de 100 mM dans du DMSO à 100 %) dans les tubes de réaction (étape 2.1.1) pour être utilisés comme échantillons témoins négatifs. Ajustez le volume du tampon de réaction Lnt de sorte que le volume total soit de 18 μL.
    3. Ajouter du Lnt actif (1 ng/μL, correspondant à 17,2 nM) ou inactif (C387S) (2 μL de 10 ng/μL de stock dans un tampon WA contenant 0,05 % de DDM) et mélanger avec les substrats (étape 2.1.2) en pipetant de haut en bas.
    4. Incuber la réaction à 37 °C pendant 16 h dans un thermomélangeur avec couvercle chauffant.
  2. Revêtement de streptavidine de 96 plaques de puits
    1. Préparer une solution mère de streptavidine à 2 mg/mL dansH2O.
      REMARQUE: Cette solution peut être conservée à -20 °C jusqu’à 6 mois.
    2. À partir de la solution mère, préparer 10 μg/mL de streptavidine dans de l’eau comme solution de travail. Ajouter 100 μL de la solution à chaque puits de la plaque de 96 puits. Lier la streptavidine à la plaque en incubant à 37 °C pendant une nuit sans couvercle pour sécher les puits à l’air.

REMARQUE: Le jour 2, effectuez la chimie de clic (étape 2.3), liez le mélange réactionnel Lnt aux plaques recouvertes de streptavidine (étape 2.4), détectez la fluorescence et analysez les résultats (étape 2.5).

  1. Réaction de chimie de clic
    1. Préparer des solutions mères d’Azido-FAM (5 mM dans du DMSO), de TCEP (chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine; 50 mM préparé dans l’eau), de TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl]amine; 2 mM dans du tert-butanol:DMSO (4:1)), et de CuSO4∙5H2O(50 mM fraîchement préparé dansH2O).
    2. Dans les tubes de 1,5 mL contenant le mélange réactionnel Lnt préparé à l’étape 2.1.4, effectuer la chimie par clic en ajoutant les réactifs dans l’ordre suivant : 0,2 μL d’Azido-FAM brut (concentration finale 50 μM), 0,4 μL de TCEP mère (concentration finale 1 mM), 0,2 μL de TBTA mère (concentration finale 0,02 mM).
    3. Vortex la solution pendant 5 s. Ajouter ensuite 0,4 μL de CuSO4 mère (concentration finale 1 mM). Vortex à nouveau pendant 5 s. Incuber les échantillons dans l’obscurité à TA pendant 1 h.
  2. Liaison du mélange réactionnel Lnt à des plaques recouvertes de streptavidine
    1. Laver les puits des plaques recouvertes de streptavidine après l’incubation nocturne de l’étape 2.2.2 3x avec 200 μL de PBS-T1 (PBS contenant 0,05 % de Tween-20).
      NOTE: Les plaques de streptavidine peuvent être utilisées immédiatement ou stockées au sec à 4 ° C.
    2. Transférer 18 μL du mélange click-chimie de l’étape 2.3.3 vers un puits dans une plaque recouverte de streptavidine à 96 puits et ajouter 100 μL de PBS-T1 pour lier le produit N-acyl-FSL-1-biotine-FAM aux plaques de streptavidine.
    3. Utiliser la biotine-fluorescéine (0,26 μM à partir d’un stock de 3,1 mM dans le DMSO) comme témoin positif pour la liaison à la streptavidine et la lecture de la fluorescence.
    4. Incuber les plaques à TA pendant 1 h dans l’obscurité dans un thermomélangeur, en agitant à 300 tr / min.
    5. Effectuer les étapes de lavage manuel des 96 plaques de puits avec une pipette électronique multicanal comme suit : six lavages avec 200 μL de PBS-T2 (PBS contenant 1% de Tween-20), trois rinçages avec une pipette, trois lavages avec 200 μL de PBS, trois rinçages avec une pipette.
  3. Détection et analyse de fluorescence
    1. Ajouter 200 μL de PBS et enregistrer la fluorescence à 520 nm dans un lecteur de microplaques à fluorescence. Enregistrez les résultats dans un tableur.
      REMARQUE: La biotine-fluorescéine est utilisée comme témoin positif pour la liaison à la streptavidine et la détection de fluorescence à 520 nm. Une lecture reproductible de 30 000 à 40 000 U.A. avec 0,26 μM de biotine-fluorescéine est attendue. Tous les échantillons sont analysés en trois exemplaires, y compris les témoins.
    2. Calculer l’écart-type pour chaque réaction et calculer les valeurs P pour les témoins négatifs et les échantillons positifs à l’aide du test t non apparié à l’aide d’un logiciel statistique.

3. Dosage sur plaque multipuits

REMARQUE : Le jour 1, mettre en place la réaction Lnt dans 384 plaques de puits (étape 3.1) et enduire 384 plaques de puits de streptavidine (étape 3.2).

  1. Préparation du mélange de réactifs et réaction enzymatique
    NOTE: La quantité de réactifs et d’enzymes est réduite par rapport au test en tube et la réaction Lnt est effectuée directement dans 384 plaques de puits. Cela permet d’utiliser moins de matériel et une réduction des étapes qui peuvent être davantage automatisées.
    1. Mélanger les substrats comme suit : alcyne-POPE (concentration finale de 50 μM à partir d’un stock de 500 μM) et FSL-1-biotine (50 μM final à partir de 500 μM stock) dans un tampon réactionnel Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contenant 1% BSA) à un volume de 13,5 μL par réaction par puits dans un format de plaque de 384 puits. Effectuez toutes les conditions en trois exemplaires. Calculer la quantité totale de réactifs requis pour le nombre de réactions à effectuer (c.-à-d. 5 184 μL pour une plaque de 384 puits).
    2. Soniquer le mélange de substrat pendant 3 min dans un bain-marie à ultrasons.
    3. Aliquote 13,5 μL du mélange de substrat par puits dans une plaque de 384 puits.
      REMARQUE: En tant que témoin négatif, 10 mM de MTSES (solution mère de 625 mM dans 100% DMSO) peuvent être ajoutés par puits. Ajuster le volume du tampon Lnt (étape 3.1.1) pour atteindre un volume de réaction final de 13,5 μL.
    4. Incuber à 37 °C pendant 5 minutes avant l’ajout de l’enzyme Lnt (étape 3.1.5).
    5. Ajouter 0,5 ng/μL (correspondant à 8,6 nM) d’enzyme Lnt active, ou variante inactive (C387S) (1,5 μL à partir d’un stock de 5 ng/μL dans un tampon WA contenant 0,05 % de DDM) dans un tampon réactionnel Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 % BSA) à chaque puits contenant le mélange réactionnel de l’étape 3.1.3. Mélanger les réactifs en les pipetant de haut en bas. Le volume total de réaction est de 15 μL.
    6. Scellez la plaque avec une feuille de plastique pour les plaques multipuits.
    7. Incuber à 37 °C pendant 16 h dans un thermomélangeur avec couvercle chauffant.
  2. Revêtement de streptavidine 384 plaques de puits
    1. Utiliser 75 μL de streptavidine (10 μg/mL dansH2O) de l’étape 2.2.2 pour enduire les puits d’une plaque de 384 puits. Laisser la streptavidine se lier à la plaque en incubant à 37 °C pendant la nuit sans couvercle pour sécher les puits à l’air.

REMARQUE: Le jour 2, effectuez la chimie de clic (étape 3.3), liez le mélange réactionnel Lnt aux plaques recouvertes de streptavidine (étape 3.4), détectez la fluorescence et analysez les résultats (étape 3.5).

  1. Réaction de chimie de clic
    1. Préparer des solutions mères d’Azido-FAM (1,2 mM dans du DMSO), de TCEP (chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine ; 24 mM préparé dans H2O), de TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl]amine ; 0,48 mM dans du tert-butanol:DMSO (4:1)) et de CuSO4∙5H2O(24 mM fraîchement préparé dansH2O).
    2. Combinez les trois réactifs de chimie de clic : un mélange d’Azido-FAM (concentration finale de 50 μM), de TCEP (1 mM final) et de TBTA (0,02 mM final), chacun à 0,75 μL dans un volume final de 2,25 μL par puits. Calculer le volume requis par plaque de 384 puits (c.-à-d. utiliser 864 μL lorsque tous les puits de la plaque de 384 puits sont utilisés). Mélanger vigoureusement.
    3. Ajouter 2,25 μL de la solution de réactif par puits directement à la réaction Lnt terminée dans la plaque de 384 puits de l’étape 3.1.7.
    4. Mélanger en pipetant de haut en bas avec une pipette électronique multicanal.
    5. Ajouter CuSO4 (0,75 μL à partir d’un stock de 24 mM pour une concentration finale de 1 mM) et mélanger en pipetant de haut en bas avec une pipette électronique multicanal.
    6. Incuber à TA pendant 1 h dans l’obscurité.
  2. Liaison du mélange réactionnel Lnt à 384 plaques de puits recouvertes de streptavidine
    1. Laver les puits des plaques recouvertes de streptavidine après l’incubation nocturne de l’étape 3.2.1 1x avec 85 μL PBS-T1.
    2. Transférer 11 μL de la réaction de chimie de clic de chaque puits de la plaque d’incubation de l’étape 3.3.6 à la plaque recouverte de streptavidine de l’étape 3.4.1 pour lier le produit N-acyl-FSL-1-biotine-FAM aux plaques de streptavidine.
    3. Ajouter 64 μL de tampon PBS-T1.
    4. Inclure la biotine-fluorescéine (0,19 μM à partir d’un stock de 3,1 mM dans le DMSO) comme témoin de la liaison aux puits recouverts de streptavidine.
    5. Incuber les 384 plaques de puits à TA pendant 1 h dans l’obscurité dans un thermomélangeur, en agitant à 300 tr/min.
    6. Lavez les assiettes à l’aide d’un laveur de plaques automatisé comme suit : 10 lavages avec 85 μL de PBS-T2, les plaques sont agitées entre les lavages; 5 lavages avec 85 μL PBS, les plaques sont agitées entre les lavages.
  3. Détection et analyse de fluorescence
    1. Ajouter du PBS (85 μL) et enregistrer la fluorescence dans un lecteur de microplaques à fluorescence à 535 nm.
    2. Analyser les données comme décrit (étape 2.5.2).

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Representative Results

Dans la réaction Lnt, l’acide gras sn-1 des phospholipides est transféré sur un peptide diacylglycéryle, ce qui donne un peptide triacylé8 mature. Le test Lnt in vitro décrit ici est conçu pour utiliser des phospholipides contenant un acide gras alcyne (alcyne-POPE) et FSL-1-biotine comme substrats, entraînant la formation d’alcyne-FSL-1-biotine. Lors d’une réaction de chimie de clic avec l’azido-FAM, ce produit doit être marqué par fluorescence et détecté par spectrométrie de fluorescence (Figure 2).

Les conditions de réaction ont été optimisées pour une lecture de fluorescence maximale à 520 nm dans un lecteur de plaques. À 1 ng/μL d’enzyme, une conversion complète de la FSL-1-biotine a été observée8 (Figure 3). Les témoins négatifs comprenaient des réactions sans enzyme, avec une variante inactive de l’enzyme (site actif mutant C387S), ou avec un inhibiteur spécifique du thiol MTSES qui entraînent une faible détection de fluorescence. La biotine-fluorescéine s’est liée efficacement aux plaques recouvertes de streptavidine et a été utilisée comme contrôle interne pour un signal de fluorescence maximal. Toutes les expériences ont été réalisées en triple exemplaire et en écart-type et l’analyse statistique a montré que le test était sensible et reproductible.

Afin de développer un test HTS pour dépister les inhibiteurs de petites molécules de Lnt, la quantité de réactifs a été réduite et les réactions ont été effectuées directement dans 384 plaques de puits. De plus, les étapes de lavage ont été automatisées à l’aide d’une laveuse de plaques (voir le tableau des matériaux). En ce qui concerne le test en tube, la réaction était sensible et reproductible, avec une différence significative entre le témoin négatif (C387S) et l’enzyme active (Lnt) (Figure 4). Dans HTS, le facteur Z' détermine si une réponse dans un essai est suffisamment importante pour être dépistée9 et est calculé à l’aide de l’équation suivante :

Equation 1

Où S est le signal moyen, B est le signal de fond et σ est l’écart-type.

Le facteur Z' moyen était de >0,6 pour le test Lnt effectué au format HTS en utilisant 384 plaques de puits, ce qui suggère que le test de criblage de petites molécules pour l’inhibition du Lnt était exceptionnel.

Figure 1
Figure 1 : Réactions enzymatiques dans la modification post-traductionnelle des lipoprotéines chez les protéobactéries. Les étapes séquentielles ont été catalysées par Lgt 10, Lsp11 et Lnt12,13,14 dans la membrane cytoplasmique. PGN : peptidoglycane, SP : peptide signal, LB : lipobox, motif conservé contenant Cys+1 et modifié avec des acides gras et le premier acide aminé dans les lipoprotéines matures, PG : phosphatidylglycérol, G-1-P : glycérol-1-phosphate, PE : phosphatidyléthanolamine, lysoPE : lyso- phosphatidyléthanolamine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma du dosage enzymatique fluorométrique de l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt). Les substrats FSL-1-biotine (jaune) et alcyne-POPE (bleu) ont été mélangés avec de l’enzyme Lnt purifiée solubilisée dans un détergent. La réaction a été réalisée dans des micelles mixtes à 37 °C (étape 1). Le produit alcyne-FSL-1-biotine a été marqué avec de la fluorescéine (orange) par clic-chimie (étape 2) et détecté dans un lecteur de plaque de fluorescence lors de la liaison à des plaques enrobées de streptavidine (étape 3). La figure est une version modifiée de la figure 1B publiée par Nozeret et al.8 selon la licence Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Détection par fluorescence de l’activité du Lnt dans le format 96 puits. Les réactions Lnt ont été effectuées dans des tubes à 37 °C pendant 16 h. Après marquage fluorescent par chimie de clic et liaison à des plaques recouvertes de streptavidine, la fluorescence a été mesurée par spectrométrie de fluorescence. La biotine-fluorescéine (biotine-fluo 0,26 μM) a été utilisée comme témoin de la fluorescence. Buffer était un tampon de réaction uniquement. Les échantillons indiquant que l’alcyne-POPE (50 μM), le FSL-1-biotine (50 μM) et les substrats (mélange d’alcyne-POPE et de FSL-1-biotine, 50 μM chacun) ne contenaient pas d’enzyme. Les témoins négatifs comprenaient l’inhibition avec MTSES (10 mM) et une variante inactive de Lnt (C387S). L’enzyme Lnt a été ajoutée à 1 ng/μL. Les écarts-types ont été calculés pour n = 3 expériences. ** La valeur de p < 0,005. Excitation à 494 nm, bande passante 5 nm et émission à 520 nm, bande passante 5 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Lecture de fluorescence de la réaction Lnt dans une plaque de puits 384 compatible avec HTS. Des réactions enzymatiques de Lnt ont été réalisées dans 384 plaques de puits à 37 °C. La biotine-fluorescéine (biotine-fluo 0,19 μM) a été utilisée comme témoin de la fluorescence. Buffer était un tampon de réaction contenant du DMSO. Les témoins négatifs comprenaient l’inhibition avec MTSES (10 mM) et une variante inactive de Lnt (C387S). L’enzyme Lnt a été ajoutée à 0,5 ng/μL. Des écarts-types ont été calculés pour n = 3 expériences. La valeur de p < 0,0005. Excitation à 485 nm, bande passante 20 nm et émission à 535 nm, bande passante 25 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole du test Lnt décrit ici, basé sur la détection par fluorescence du produit triacylé, est sensible et reproductible. La liaison spécifique et efficace de la biotine à la streptavidine est un élément clé du test. Le substrat alcyne-POPE laissé après l’achèvement de la réaction Lnt est également marqué par fluorescence avec FAM, mais est efficacement éliminé après s’être lié aux plaques de streptavidine par plusieurs étapes de lavage. De plus, l’ajout de DMSO n’affecte pas l’activité du Lnt et n’a aucun impact sur le test. Le substrat et l’enzyme sont hautement lipophiles et nécessitent des conditions de réaction dans des micelles mixtes. Les techniques qui dépendent d’enzymes solubles et de substrats pour la détection des produits, y compris la polarisation de fluorescence, ne sont pas applicables8. La seule limitation du test est la compatibilité de l’enzyme avec le substrat alcyne, car la réaction de chimie du clic dépend de ce groupe chimique.

Des tests de décalage de gel ont été rapportés dans des études antérieures pour analyser l’activité du Lnt et déterminer la spécificité du substrat4. Avec le protocole actuel, et parallèlement à la spectrométrie de fluorescence, la détection de fluorescence en gel peut être utilisée pour surveiller l’activité Lnt8, bien que ce format ne soit pas adapté au HTS. Le test en tube est particulièrement intéressant pour les études cinétiques et comparatives des mutants Lnt. La spécificité du substrat phospholipide peut être traitée à l’aide d’alcynes-phospholipides obtenus par marquage métabolique de bactéries avec des acides gras alcynes composés de différentes longueurs de chaîne et degrés de saturation comme décrit8.

Le format de plaque à 384 puits est compatible avec les études HTS car une différence significative est observée entre l’enzyme active et un témoin sur substrat seul. Un facteur Z' moyen de >0,6 a été calculé avec les conditions optimisées présentées ici. La reproductibilité élevée du test contribue au facteur Z' élevé. Pour un HTS réussi, un facteur Z' supérieur à 0,6 est recommandé9. Les étapes de lavage sont efficaces avec l’utilisation d’une laveuse de plaques automatisée. D’autres étapes peuvent être optimisées davantage, notamment le pipetage des réactifs, ce qui permettrait de cribler de grandes banques de petites molécules.

Le protocole est applicable à d’autres acyltransférases qui utilisent des substrats contenant des acides gras si les groupes alcynes sont compatibles avec la reconnaissance du substrat par l’enzyme. Une étude récente sur l’identification d’inhibiteurs spécifiques de la palmitoyl transférase eucaryote (PAT) décrit l’utilisation de l’enzyme liée à la membrane et de l’alcyne-acyl-CoA comme substrat7. La palmitoylation d’un petit peptide Ras biotinylé a été observée par détection fluorogénique de chimie click. Un criblage pilote dans le format 384 plaques de puits de ce test a identifié des inhibiteurs spécifiques de la PAT, suggérant que les substrats composés d’un groupe d’acides gras alcynes combinés à la chimie du clic et à la détection sensible de la fluorescence constituent une méthode prometteuse pour le HTS basé sur la cible.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Fabrice Agou et Alix Boucharlat de la Plateforme de Criblage Chimiogénomique et Biologique du Centre de Ressources Technologiques et de Recherche (C2RT) de l’Institut Pasteur Paris pour leurs suggestions utiles sur le protocole, tous les membres de l’Unité BGPB pour le soutien et les discussions scientifiques, et Simon Legood pour la lecture critique du manuscrit. Les travaux ont été financés par Global Care Initiatives de l’Institut Carnot Maladies infectieuses et de l’Institut Carnot Microbes et Santé (15 CARN 0017-01 et 16 CARN 0023-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

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References

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Biochimie numéro 159 apolipoprotéine N-acyltransférase membranaire intégrale peptide diacylglycéryle alcyne-phospholipide micelles mixtes chimie du clic fluorescence
Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit
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Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

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