Summary
Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.
Abstract
Proteobakterilerden lipoproteinler, üç integral membran enziminin etkisiyle membran fosfolipitlerinden türetilen yağ asitleri tarafından posttranslasyonel olarak modifiye edilir ve triasile proteinlerle sonuçlanır. Lipoprotein modifikasyon yolundaki ilk adım, bir diasilgliseril grubunun fosfatidilgliserolden prolipoproteine transferini içerir ve bu da diasilgliseril prolipoprotein ile sonuçlanır. İkinci adımda, prolipoproteinin sinyal peptidi bölünür ve bir fosfolipitten türetilen üçüncü bir yağ asidi tarafından modifiye edilen bir apolipoprotein oluşturulur. Bu son adım apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir. Lipoprotein modifikasyon yolu, çoğu γ-proteobakteride esastır ve bu da onu yeni antibakteriyel ajanların gelişimi için potansiyel bir hedef haline getirir. Burada açıklanan, küçük inhibitör moleküllerin yüksek verimli taraması ile uyumlu olan Lnt için hassas bir testtir. Enzim ve substratlar membrana gömülü moleküllerdir; bu nedenle, in vitro bir testin geliştirilmesi kolay değildir. Bu, aktif enzimin deterjan varlığında saflaştırılmasını, alkin-fosfolipitlerin ve diasilgliseril peptid substratlarının mevcudiyetini ve karışık misellerdeki reaksiyon koşullarını içerir. Ayrıca, aktivite testini yüksek verimli bir tarama (HTS) kurulumunda kullanmak için, reaksiyon ürününün doğrudan okunması, birleştirilmiş enzimatik reaksiyonlara göre tercih edilir. Bu florometrik enzim testinde, alkin-triasile peptid ürünü, bir tıklama-kimya reaksiyonu yoluyla floresan haline getirilir ve çok kuyulu bir plaka formatında tespit edilir. Bu yöntem, fosfolipitler ve açil-CoA dahil olmak üzere yağ asidi içeren substratlar kullanan diğer asiltransferazlar için geçerlidir.
Introduction
Bakteriyel lipoproteinler, amino terminlerinde kovalent olarak bağlanmış yağ asitleri ile karakterize edilir ve bu asitler 1,2 membranlarına sabitlenir. Proteinin olgun kısmı yapı ve işlev bakımından oldukça çeşitlidir, böylece lipoproteinlerin bakteriyel hücre zarfındaki çeşitli biyolojik süreçlerdeki rolünü açıklar.
Lipoproteinler, sitoplazmik membrana yerleştirildikten sonra fosfolipid kaynaklı yağ asitleri tarafından modifiye edilir. Prolipoproteinler, asillenmiş hale gelen değişmez bir sistein kalıntısı ve olgun proteindeki ilk amino asit içeren bir imza motifi olan lipobox içerir. Bu yolun ilk adımı, diasilgliseril grubunu fosfatidilgliserolden prolipoproteine diyasilgliseril ve sistein arasındaki bir tiyoeter bağlantısı yoluyla prolipoproteine aktaran prolipoprotein fosfatidilgliserol::d iasilgliseril transferaz (Lgt) tarafından katalize edilir. Sinyal peptidaz II (Lsp), sinyal peptidini diasilgliseril prolipoproteinden ayırır ve diasilgliserl moiety yoluyla membrana demirlenen bir apolipoprotein ile sonuçlanır. Üçüncü ve son adım, fosfolipitin sn-1 pozisyonundan apolipoprotein üzerine bir yağ asidi ekleyen ve triasile olgun lipoprotein ile sonuçlanan apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir (Şekil 1)3. Lnt reaksiyonu, kararlı bir tiyoester açil enzim ara ürününün oluştuğu iki aşamalı bir pinpon reaksiyonudur. Lizofosfolipid yan ürünü, reaksiyonun ikinci adımında apolipoprotein substratının asilasyonundan önce salınır.
Fosfolipid substrat özgüllüğü, yüksek oranda Tris-Trisin Üre SDS-PAGE4 üzerinde N-açil diasilgliseril peptidin hareketlilik kaymasına dayanan bir Lnt testinde belirlenir. Küçük polar kafa gruplarına sahip, doymuş [sn-1] ve doymamış [sn-2] fosfolipitler tercih edilen substratlar4'tür. Jel kayma testi, apolipoprotein N-asiltransferazın kapsamlı kinetik çalışmaları veya HTS'nin inhibitör molekülleri tanımlaması için uygun değildir. Alkinli yağ asitlerini kullanan tıklama kimyası, bakteri5'te lipoprotein modifikasyonunu ve ökaryotlarda yağ asidi metabolizmasını incelemek için başarıyla kullanılmıştır6. Son zamanlarda, inhibitörleri7 tanımlamak için Ras palmitoylasyonunun in vitro bir testinin bildirildiği bildirilmiştir.
Burada açıklanan yöntemde, deterjandaki saflaştırılmış aktif Lnt, daha sonra floresan spektrometrisi ile tespit edilen alkin-triasile peptid oluşturmak için karışık misellerdeki substratlarla inkübe edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Enzim ve substrat hazırlama
- Enzimin saflaştırılması
- Lnt enzimini daha önce tarif edildiği gibi deterjanda çözünür membranlardan üretin ve saflaştırın 4,8. Kısaca, Lnt-strep geninin ekspresyonunu indükleyin, Lnt'yi bir C-terminal Strep etiketi ile kodlayın, OD600'de 0.6'da 16 saat boyunca 37 ° C'de susuz tetrasiklin (200 ng / mL) ile.
- Hücreleri 10 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.
- Hücre peletini tampon WA'da (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) mL başına 100 OD600 birime kadar yeniden askıya alın.
- Hücreleri, 10.000 psi'de bir Fransız basınçlı hücre presinden iki geçitle kırın.
- Kırılmamış hücreleri ve kalıntıları 20 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüjleme ile temizleyin. Süpernatantı saklayın ve peleti atın.
- Süpernatantı 60 dakika boyunca 120.000 x g'de santrifüj yapın ve membran veziküllerini (yarı saydam kahverengi renkli pelet) toplayın. Süper natantı atın.
- Membran peletinden integral membran proteinlerini, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca tampon WA'da% 1 (w/v) n-Dodesil β-D-maltosid (DDM) ile çözündürün. Çözünmeyen malzemeyi 120.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın ve çıkarın. Saflaştırma için süpernatant fraksiyonu kullanın.
- Lnt-strep'i Nozeret ve ark.8 tarafından açıklandığı gibi bir afinite kromatografisi sütununda (bkz. Malzeme Tablosu) ve bir S400 jel filtrasyon sütununda (bkz.
- Saflaştırılmış enzimi, -80 °C'de% 0.05 DDM ve% 10 gliserol içeren tampon WA'da saklayın.
NOT: Enzim 5 yıldan fazla bir süredir stabildir.
- Alkin-fosfolipid ve biyotinile Fibroblast Uyarıcı Ligand (FSL-1-biotin) substratlarının hazırlanması
- Aliquot 100 μL özel sentezlenmiş alkin-POPE (1-hekzade-15-ynoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, bakınız Malzeme Tablosu) kloroformda 1.5 mL tüplere çözünür.
- Tüpleri bir şırınga ile delin ve kloroformu RT'de 2 saat boyunca bir hız boşluğunda buharlaştırın. Kuru fosfolipit örneklerini -20 °C'de saklayın.
- Kullanmadan önce alkin-PAPE'yi 500 μM'de% 0.1 Triton X-100'de çözün. Gerekirse alkin-POPE'yi çözündürmek için RT'de ultrasonik su banyosuna 3 dakikalık bir sonikasyon adımı ekleyin.
- FSL-1-biyotin'i suda 445 μM'de yeniden askıya alın.
NOT: Her iki çözelti de -20 °C'de en az 2 ay saklanabilir.
2. Tüp testi
NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 1,5 mL tüplerde ayarlayın (adım 2.1) ve 96 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 2.2).
- Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon
- Standart bir Lnt testi için, 1,5 mL tüplerde 18 μL'lik son hacimde alkin-POPE (500 μM stoktan son 50 μM) ve FSL-1-biyotin (445 μM stoktan 50 μM nihai konsantrasyon) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %1 BSA içeren %0.1 Triton X-100) karıştırın. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin.
- Substrat karışımını (adım 2.1.1'de hazırlanan) ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin ve Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 2.1.3).
NOT: MTSES (sodyum (2-sülfonatoetil)metanetiosülfonat), tiol-spesifik bir reaktif, Lnt8'i inhibe eder. Negatif kontrol numuneleri olarak kullanılmak üzere reaksiyon tüplerine (adım 2.1.1) 10 mM MTSES (% 100 DMSO'da 100 mM stok çözeltisi) ekleyin. Lnt reaksiyon tamponunun ses seviyesini toplam hacim 18 μL olacak şekilde ayarlayın. - Aktif (1 ng/μL, 17,2 nM'ye karşılık gelir) veya inaktif Lnt (C387S) (%0,05 DDM içeren tampon WA'da 10 ng/μL'lik 2 μL) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetle indirerek substratlarla (adım 2.1.2) karıştırın.
- Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyonu inkübe edin.
- 96 kuyu plakasının Streptavidin kaplaması
- H2O'da 2 mg / mL'de bir streptavidin stok çözeltisi hazırlayın.
NOT: Bu çözelti -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir. - Stok çözeltisinden, çalışma çözeltisi olarak suda 10 μg / mL streptavidin hazırlayın. 96 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna 100 μL çözelti ekleyin. Kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 °C'de inkübe ederek streptavidin'i plakaya bağlayın.
- H2O'da 2 mg / mL'de bir streptavidin stok çözeltisi hazırlayın.
NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 2.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 2.4) ve floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 2.5).
- Klik-kimya reaksiyonu
- Azido-FAM (DMSO'da 5 mM), TCEP (Tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; suda hazırlanan 50 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 2 mM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H2O (H2O'da taze hazırlanmış 50 mM) stok çözeltileri hazırlayın.
- Adım 2.1.4'te hazırlanan Lnt reaksiyon karışımını içeren 1,5 mL'lik tüplerde, reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyerek klik-kimyası gerçekleştirin: 0,2 μL stok Azido-FAM (nihai konsantrasyon 50 μM), 0,4 μL stok TCEP (nihai konsantrasyon 1 mM), 0,2 μL stok TBTA (nihai konsantrasyon 0,02 mM).
- Vorteks 5 s için çözüm. Daha sonra 0,4 μL stok CuSO4 (son konsantrasyon 1 mM) ekleyin. 5 s için tekrar vorteks. Örnekleri karanlıkta RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı plakalara bağlanması
- Streptavidin kaplı plakaların kuyucuklarını, 2.2.2 3x adımından bir gecede inkübasyondan sonra 200 μL PBS-T1 (% 0.05 Ara-20 içeren PBS) ile yıkayın.
NOT: Streptavidin plakalar hemen kullanılabilir veya 4 °C'de kuru olarak saklanabilir. - Klik-kimya karışımından 18 μL'yi adım 2.3.3'ten 96 kuyu streptavidin kaplı bir plakadaki bir kuyuya aktarın ve N-açil-FSL-1-biyotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için 100 μL PBS-T1 ekleyin.
- Streptavidin bağlama ve floresan okuması için pozitif kontrol olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3.1 m'lik bir stoktan 0.26 μM) kullanın.
- RT'deki plakaları karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde inkübe edin, 300 rpm'de sallayın.
- 96 kuyucuk plakasının manuel yıkama adımlarını çok kanallı elektronik pipetle aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 200 μL PBS-T2 ile altı yıkama (%1 Ara-20 içeren PBS), pipetle üç yıkama, 200 μL PBS ile üç yıkama, pipetle üç yıkama.
- Streptavidin kaplı plakaların kuyucuklarını, 2.2.2 3x adımından bir gecede inkübasyondan sonra 200 μL PBS-T1 (% 0.05 Ara-20 içeren PBS) ile yıkayın.
- Floresan algılama ve analizi
- 200 μL PBS ekleyin ve floresanı bir floresan mikroplaka okuyucusuna 520 nm'de kaydedin. Sonuçları e-tablo yazılımına kaydedin.
NOT: Biotin-floresein, streptavidin bağlama ve 520 nm'de floresan tespiti için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. 0.26 μM biyotin-floresein ile 30.000-40.000 A.U.'nun tekrarlanabilir bir okuması beklenmektedir. Tüm numuneler, kontroller de dahil olmak üzere üçlü olarak analiz edilir. - İstatistiksel bir yazılım kullanarak eşleşmemiş t-testini kullanarak her reaksiyon için standart sapmayı ve negatif kontroller ve pozitif numuneler için P-değerlerini hesaplayın.
- 200 μL PBS ekleyin ve floresanı bir floresan mikroplaka okuyucusuna 520 nm'de kaydedin. Sonuçları e-tablo yazılımına kaydedin.
3. Çok kuyulu plaka testi
NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 384 kuyu plakasında (adım 3.1) ayarlayın ve 384 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 3.2).
- Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon
NOT: Reaktiflerin ve enzimin miktarı, tüp testine kıyasla azaltılır ve Lnt reaksiyonu doğrudan 384 kuyu plakasında gerçekleştirilir. Bu, daha az malzeme kullanılmasına ve daha da otomatikleştirilebilecek adımların azaltılmasına izin verir.- Substratları aşağıdaki gibi karıştırın: alkin-POPE (500 μM stoktan son konsantrasyon 50 μM) ve FSL-1-biyotin (500 μM stoktan son 50 μM) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl,% 1 BSA içeren% 0.1 Triton X-100) 384 kuyu plakası formatında kuyu başına reaksiyon başına 13.5 μL hacimde. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin. Gerçekleştirilecek reaksiyon sayısı için gereken toplam reaktif miktarını hesaplayın (yani, bir 384 kuyu plakası için 5.184 μL).
- Substrat karışımını ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin.
- 384 kuyucuklu bir plakada kuyu başına substrat karışımının Aliquot 13.5 μL'si.
NOT: Negatif kontrol olarak, kuyu başına 10 mM MTSES (%100 DMSO'da 625 mM stok çözeltisi) eklenebilir. 13,5 μL'lik bir nihai reaksiyon hacmine ulaşmak için Lnt tamponunun ses seviyesini (adım 3.1.1) ayarlayın. - Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 3.1.5).
- 3.1.3. adımdan itibaren reaksiyon karışımını içeren her bir kuyucuğa Lnt reaksiyon tamponuna (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %0.1 Triton X-100, %1 BSA) 0,5 ng/μL (8,6 nM'ye karşılık gelen) aktif Lnt enzimi veya inaktif varyant (C387S) (% 0,05 DDM içeren tampon WA'daki 5 ng/μL stoktan 1,5 μL) ekleyin. Reaktifleri yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırın. Toplam reaksiyon hacmi 15 μL'dir.
- Çok kuyulu plakalar için plakayı plastik folyo ile kapatın.
- Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Streptavidin kaplama 384 kuyu plakaları
- 384 kuyu plakasının kuyularını kaplamak için 2.2.2 adımından itibaren 75 μL streptavidin (H 2 O'da 10 μg / mL) kullanın. Streptavidin, kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 ° C'de inkübe ederek plakaya bağlanmasına izin verin.
NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 3.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 3.4), floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 3.5).
- Klik-kimya reaksiyonu
- Azido-FAM (DMSO'da 1.2 mM), TCEP (tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; H 2 O'da hazırlanan 24 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 0.48 mMM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H 2 O(H2O'da taze hazırlanmış24mM) stok çözeltilerini hazırlayın.
- Üç klik-kimya reaktifini birleştirin: Azido-FAM (son konsantrasyon 50 μM), TCEP (1 mM final) ve TBTA (0.02 mM final) karışımı, her biri kuyucuk başına 2.25 μL'lik son hacimde 0.75 μL'de. 384 kuyu plakası başına gerekli hacmi hesaplayın (yani, 384 kuyu plakasının tüm kuyuları kullanıldığında 864 μL kullanın). Kuvvetlice karıştırın.
- 3.1.7 adımından itibaren 384 kuyu plakasındaki tamamlanmış Lnt reaksiyonuna kuyu başına 2,25 μL reaktif çözeltisi ekleyin.
- Çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.
- CuSO4 (1 mM nihai konsantrasyon için 24 mM stoktan 0,75 μL) ekleyin ve çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.
- RT'de karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin.
- Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı 384 kuyu plakalarına bağlanması
- Streptavidin kaplı plakaların kuyularını, 3.2.1 1x adımından 85 μL PBS-T1 ile gece boyunca inkübasyondan sonra yıkayın.
- N-asil-FSL-1-biotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için inkübasyon plakasının her bir kuyucuğundan 3.3.6 adımından streptavidin kaplı plakaya adım 3.4.1'den 11 μL klip-kimya reaksiyonunun 11 μL'sini aktarın.
- 64 μL PBS-T1 arabellek ekleyin.
- Streptavidin kaplı kuyucuklara bağlanma kontrolü olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3,1 m'lik bir stoktan 0,19 μM) ekleyin.
- RT'deki 384 kuyu plakasını karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde 300 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
- Otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak plakaları aşağıdaki gibi yıkayın: 85 μL PBS-T2 ile 10 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır; 85 μL PBS ile 5 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır.
- Floresan algılama ve analizi
- PBS (85 μL) ekleyin ve floresan mikroplaka okuyucusuna 535 nm'de floresan kaydedin.
- Verileri açıklandığı gibi analiz edin (adım 2.5.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lnt reaksiyonunda, fosfolipitlerden gelen sn-1 yağ asidi bir diasilgliseril peptid üzerine aktarılır ve olgun triasile peptid8 ile sonuçlanır. Burada tarif edilen in vitro Lnt testi, substrat olarak bir alkin yağ asidi (alkin-POPE) ve FSL-1-biyotin içeren fosfolipitleri kullanmak üzere tasarlanmıştır ve bu da alkin-FSL-1-biyotin oluşumuna neden olur. Azido-FAM ile bir tıklama-kimya reaksiyonu üzerine, bu ürün floresan olarak etiketlenmeli ve floresan spektrometri ile tespit edilmelidir (Şekil 2).
Reaksiyon koşulları, bir plaka okuyucuda 520 nm'de maksimum floresan okuması için optimize edilmiştir. 1 ng/μL enziminde FSL-1-biyotinin tam dönüşümü8 gözlendi (Şekil 3). Negatif kontroller, enzim olmadan, enzimin inaktif bir varyantı (aktif bölge mutantı C387S) veya düşük floresan tespiti ile sonuçlanan tiol spesifik inhibitör MTSES ile reaksiyonları içeriyordu. Biotin-floresein, streptavidin kaplı plakalara verimli bir şekilde bağlandı ve maksimum floresan sinyali için dahili kontrol olarak kullanıldı. Tüm deneyler üçlü ve standart sapma hesaplamalarında yapıldı ve istatistiksel analizler tahlilin hassas ve tekrarlanabilir olduğunu gösterdi.
Lnt'nin küçük moleküllü inhibitörlerini taramak için bir HTS testi geliştirmek için, reaktiflerin miktarı azaltıldı ve reaksiyonlar doğrudan 384 kuyu plakasında gerçekleştirildi. Ayrıca, yıkama adımları bir plaka yıkayıcı kullanılarak otomatikleştirildi (bakınız Malzeme Tablosu). Tüp testine gelince, reaksiyon duyarlı ve tekrarlanabilirdi, negatif kontrol (C387S) ve aktif enzim (Lnt) arasında anlamlı bir fark vardı (Şekil 4). HTS'de Z' faktörü, bir tahlildeki yanıtın tarama amaçları için yeterince büyük olup olmadığını belirler9 ve aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
Burada S ortalama sinyal, B arka plan sinyalidir ve σ standart sapmadır.
Ortalama Z' faktörü, 384 kuyu plakası kullanılarak HTS formatında gerçekleştirilen Lnt testi için >0.6 idi, bu da Lnt inhibisyonu için küçük molekülün taranması için yapılan tahlilin olağanüstü olduğunu düşündürmektedir.
Şekil 1: Proteobakterilerde lipoproteinin posttranslasyonel modifikasyonunda enzimatik reaksiyonlar. Sıralı basamaklar sitoplazmik membranda Lgt 10, Lsp11 ve Lnt 12,13,14 tarafından katalize edildi. PGN: peptidoglikan, SP: sinyal peptidi, LB: lipobox, Cys+1 içeren korunmuş motif ve yağ asitleri ile modifiye edilmiş ve olgun lipoproteindeki ilk amino asit, PG: fosfatidilgliserol, G-1-P: gliserol-1-fosfat, PE: fosfatidiletanolamin, lizoPE: lizo- fosfatidiletanolamin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) için florometrik enzim testinin şeması. FSL-1-biotin (sarı) ve alkin-POPE (mavi) substratları, deterjanda çözünen saflaştırılmış Lnt enzimi ile karıştırıldı. Reaksiyon 37 ° C'de karışık misellerde gerçekleştirildi (adım 1). Alkin-FSL-1-biyotin ürünü, tıklama kimyası (adım 2) ile floresein (turuncu) ile etiketlendi ve streptavidin kaplı plakalara bağlandıktan sonra bir floresan plaka okuyucusunda tespit edildi (adım 3). Şekil, Nozeret ve ark.8 tarafından Creative Commons lisansına göre yayınlanan Şekil 1B'nin değiştirilmiş bir versiyonudur (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 96 kuyu formatında Lnt aktivitesinin floresan tespiti. Lnt reaksiyonları tüplerde 37 °C'de 16 saat boyunca gerçekleştirildi. Klik kimyası ile floresan etiketleme ve streptavidin kaplı plakalara bağlanma işleminden sonra, floresan floresan spektrometrisi ile ölçüldü. Floresan için kontrol olarak biyotin-floresein (biotin-fluo 0.26 μM) kullanıldı. Tampon sadece reaksiyon tamponuydu. Alkin-POPE (50 μM), FSL-1-biyotin (50 μM) ve substratları (alkin-POPE ve FSL-1-biyotin karışımı, her biri 50 μM) gösteren örnekler enzim içermiyordu. Negatif kontroller MTSES (10 mM) ile inhibisyon ve inaktif bir Lnt varyantı (C387S) içeriyordu. Lnt enzimi 1 ng/μL'de eklendi. Standart sapmalar n=3 deney için hesaplandı. ** P değeri 0,005'<. 494 nm'de uyarma, 5 nm bant genişliği ve 520 nm'de emisyon, 5 nm bant genişliği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: HTS ile uyumlu 384 kuyu plakasındaki Lnt reaksiyonunun floresan okuması. Enzimatik Lnt reaksiyonları 37 °C'de 384 kuyu plakasında gerçekleştirildi. Floresan için kontrol olarak biyotin-floresein (biotin-fluo 0.19 μM) kullanıldı. Tampon, DMSO içeren reaksiyon tamponuydu. Negatif kontroller MTSES (10 mM) ile inhibisyon ve inaktif bir Lnt varyantı (C387S) içeriyordu. Lnt enzimi 0.5 ng/μL'de eklendi. n = 3 deney için standart sapmalar hesaplandı. P değeri 0,0005'<. 485 nm'de uyarma, 20 nm bant genişliği ve 535 nm'de emisyon, bant genişliği 25 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Triasillenmiş ürünün floresan tespitine dayanan burada açıklanan Lnt testi protokolü hassas ve tekrarlanabilirdir. Biotin'in streptavidin'e spesifik ve verimli bağlanması, tahlilde kilit bir unsurdur. Lnt reaksiyonunun tamamlanmasından sonra bırakılan alkin-POPE substratı da FAM ile floresan olarak etiketlenir, ancak streptavidin plakalarına çoklu yıkama adımlarıyla bağlandıktan sonra verimli bir şekilde çıkarılır. Ayrıca, DMSO'nun eklenmesi Lnt aktivitesini etkilemez ve tahlil üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Hem substrat hem de enzim oldukça lipofiliktir ve karışık misellerde reaksiyon koşulları gerektirir. Floresan polarizasyonu da dahil olmak üzere ürün tespiti için çözünür enzimlere ve substratlara dayanan teknikler uygulanamaz8. Tahlilin tek sınırlaması, enzimin alkin-substrat ile uyumluluğudur, çünkü tıklama-kimya reaksiyonu bu kimyasal gruba bağlıdır.
Lnt aktivitesini analiz etmek ve substrat özgüllüğünü belirlemek için önceki çalışmalarda jel kayma testleri bildirilmiştir4. Mevcut protokolle ve floresan spektrometrisine paralel olarak, bu format HTS için uygun olmasa da, Lnt aktivitesi8'i izlemek için jel içi floresan algılama kullanılabilir. Tüp tahlili, Lnt mutantlarının kinetik ve karşılaştırmalı çalışmaları için özellikle ilginçtir. Fosfolipid substrat özgüllüğü, bakterilerin metabolik olarak etiketlenmesiyle elde edilen alkin-fosfolipitler kullanılarak çeşitli zincir uzunluklarından ve doygunluk derecelerinden oluşan alkin-fosfolipitler kullanılarak ele alınabilir8.
384 kuyu plakası formatı HTS çalışmaları ile uyumludur, çünkü aktif enzim ile sadece substrat kontrolü arasında önemli bir fark gözlenmiştir. Ortalama Z' faktörü >0.6, burada sunulan optimize edilmiş koşullarla hesaplanmıştır. Tahlilin yüksek tekrarlanabilirliği, yüksek Z' faktörüne katkıda bulunur. Başarılı HTS için 0,6'nın üzerinde bir Z' faktörü9 önerilir. Yıkama adımları, otomatik bir plaka yıkayıcının kullanılmasıyla etkilidir. Küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranmasına izin verecek olan reaktiflerin pipetlenmesi de dahil olmak üzere diğer adımlar daha da optimize edilebilir.
Protokol, alkin grupları enzim tarafından substrat tanıma ile uyumluysa, yağ asidi içeren substratları kullanan diğer asiltransferazlara uygulanabilir. Ökaryotik Palmitoil Asil Transferaz'ın (PAT) spesifik inhibitörlerinin tanımlanması üzerine yapılan yeni bir çalışmada, substrat7 olarak membrana bağlı enzim ve alkin-açil-CoA'nın kullanılması tanımlanmaktadır. Küçük bir biyotinile Ras peptidinin palmitoilasyonu, klik kimyası florojenik tespiti ile gözlendi. Bu tahlilin 384 kuyu plakası formatındaki bir pilot ekran, spesifik PAT inhibitörlerini tanımladı, bu da alkin yağ asidi grubundan oluşan substratların, tıklama kimyası ve hassas floresan tespiti ile birleştirilmesinin hedef tabanlı HTS için umut verici bir yöntem olduğunu düşündürmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Kemogenomik ve Biyolojik Tarama Platformu'ndan Fabrice Agou ve Alix Boucharlat'a, Institut Pasteur Paris'teki Teknolojik Kaynaklar ve Araştırma Merkezi'ne (C2RT) protokol hakkında yararlı öneriler için, BGPB Birimi'nin tüm üyelerine destek ve bilimsel tartışmalar için ve Simon Legood'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma, Carnot Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Carnot Mikropları ve Sağlığı Enstitüsü'nün Küresel Bakım Girişimleri (15 CARN 0017-01 ve 16 CARN 0023-01) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L.
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
