Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61146
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Summary

Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Abstract

Lipoproteine aus Proteobakterien werden posttranslational durch Fettsäuren modifiziert, die aus Membranphospholipiden durch die Wirkung von drei integralen Membranenzymen gewonnen werden, was zu triacylierten Proteinen führt. Der erste Schritt im Lipoproteinmodifikationsweg beinhaltet die Übertragung einer Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein, was zu Diacylglycerylprolipoprotein führt. Im zweiten Schritt wird das Signalpeptid des Prolipoproteins gespalten und bildet ein Apolipoprotein, das wiederum durch eine dritte Fettsäure aus einem Phospholipid modifiziert wird. Dieser letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert. Der Lipoprotein-Modifikationsweg ist in den meisten γ-Proteobakterien essentiell und damit ein potenzielles Ziel für die Entwicklung neuartiger antibakterieller Wirkstoffe. Hier wird ein sensitiver Assay für Lnt beschrieben, der mit dem Hochdurchsatz-Screening kleiner inhibitorischer Moleküle kompatibel ist. Das Enzym und die Substrate sind membraneingebettete Moleküle; Daher ist die Entwicklung eines In-vitro-Tests nicht einfach. Dazu gehören die Reinigung des aktiven Enzyms in Gegenwart von Detergens, die Verfügbarkeit von Alkin-Phospholipiden und Diacylglycerylpeptidsubstraten sowie die Reaktionsbedingungen in gemischten Mizellen. Um den Aktivitätstest in einem Hochdurchsatz-Screening (HTS) zu verwenden, wird außerdem das direkte Auslesen des Reaktionsprodukts gegenüber gekoppelten enzymatischen Reaktionen bevorzugt. In diesem fluorometrischen Enzymassay wird das alkintriacylierte Peptidprodukt durch eine Klickchemiereaktion fluoreszierend gemacht und in einem Multiwell-Plattenformat detektiert. Diese Methode ist auf andere Acyltransferasen anwendbar, die fettsäurehaltige Substrate verwenden, einschließlich Phospholipide und Acyl-CoA.

Introduction

Bakterielle Lipoproteine sind durch kovalent gebundene Fettsäuren an ihren Aminotermini gekennzeichnet, durch die sie in Membranenverankert sind 1,2. Der reife Teil des Proteins ist in Struktur und Funktion sehr vielfältig, was die Rolle von Lipoproteinen in verschiedenen biologischen Prozessen in der bakteriellen Zellhülle erklärt.

Lipoproteine werden durch Phospholipid-abgeleitete Fettsäuren nach dem Einbringen in die zytoplasmatische Membran modifiziert. Die Prolipoproteine enthalten ein Signaturmotiv, die Lipobox, die einen invarianten Cysteinrest enthält, der acyliert wird, und die erste Aminosäure im reifen Protein. Der erste Schritt dieses Weges wird durch Prolipoprotein Phosphatidylglycerol::d Iacylglyceryltransferase (Lgt) katalysiert, die die Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein über eine Thioetherverbindung zwischen Diacylglyceryl und Cystein überträgt. Die Signalpeptidase II (Lsp) spaltet das Signalpeptid vom Diacylglyceryl-Prolipoprotein, was zu einem Apolipoprotein führt, das durch seinen Diacylglycerylanteil in der Membran verankert ist. Der dritte und letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert, die eine Fettsäure aus der sn-1-Position des Phospholipids an Apolipoprotein hinzufügt, was zu triacyliertem reifem Lipoprotein führt (Abbildung 1)3. Die Lnt-Reaktion ist eine zweistufige Ping-Pong-Reaktion, bei der ein stabiles Thioester-Acylenzym-Zwischenprodukt gebildet wird. Das Lysophospholipid-Nebenprodukt wird vor der Acylierung des Apolipoproteinsubstrats im zweiten Schritt der Reaktion freigesetzt.

Die Phospholipidsubstratspezifität wird in einem Lnt-Assay basierend auf der Mobilitätsverschiebung des N-Acyldiacylglycerylpeptids auf einem hochprozentigen Tris-Tricin-Harnstoff SDS-PAGE4 bestimmt. Phospholipide mit kleinen polaren Kopfgruppen, gesättigt [sn-1] und nicht gesättigt [sn-2], waren bevorzugte Substrate4. Der Gelverschiebungstest eignet sich weder für umfangreiche kinetische Studien der Apolipoprotein-N-Acyltransferase noch für HTS zur Identifizierung hemmender Moleküle. Die Klickchemie unter Verwendung von Alkinfettsäuren wurde erfolgreich eingesetzt, um die Lipoproteinmodifikation in Bakterien5 und den Fettsäurestoffwechsel in Eukaryoten6 zu untersuchen. Vor kurzem wurde ein In-vitro-Assay der Ras-Palmitoylierung berichtet, um Inhibitoren zu identifizieren7.

Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird gereinigtes aktives Lnt in Waschmittel mit Substraten in gemischten Mizellen inkubiert, um alkintriacyliertes Peptid zu bilden, das anschließend durch Fluoreszenzspektrometrie nachgewiesen wird.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Enzym- und Substratzubereitung

  1. Reinigung von Enzymen
    1. Herstellung und Reinigung des Lnt-Enzyms aus waschmittellöslichen Membranen, wie zuvor beschrieben 4,8. Kurz gesagt, induzieren Sie die Expression des lnt-Strep-Gens, das Lnt mit einem C-terminalen Streptokokken-Tag kodiert, bei OD 600 von 0,6 mit wasserfreiem Tetracyclin (200 ng / ml) bei 37 °C für 16 h.
    2. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 10 min und verwerfen Sie den Überstand.
    3. Resuspendieren Sie das Zellpellet im Puffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) auf 100 OD600 Einheiten pro ml.
    4. Brechen Sie die Zellen durch zwei Durchgänge durch eine französische Druckzellenpresse bei 10.000 psi.
    5. Entfernen Sie ungebrochene Zellen und Ablagerungen durch Zentrifugieren bei 13.000 x g für 20 min. Bewahren Sie den Überstand auf und entsorgen Sie das Pellet.
    6. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 120.000 x g für 60 min und sammeln Sie die Membranvesikel (durchscheinendes braun gefärbtes Pellet). Verwerfen Sie den Überstand.
    7. Lösen Sie die integralen Membranproteine aus dem Membranpellet mit 1% (w/v) n-Dodecyl β-D-Maltosid (DDM) im Puffer WA für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Zentrifugieren und entfernen Sie unlösliches Material bei 120.000 x g für 30 min. Verwenden Sie die überstehende Fraktion zur Reinigung.
    8. Lnt-Streptokokken auf einer Affinitätschromatographiesäule (siehe Materialtabelle) und einer S400-Gelfiltrationssäule (siehe Materialtabelle) reinigen, wie von Nozeret et al.8 beschrieben.
    9. Lagern Sie das gereinigte Enzym im Puffer WA mit 0,05% DDM und 10% Glycerin bei -80 °C.
      HINWEIS: Das Enzym ist über 5 Jahre stabil.
  2. Herstellung von Alkin-Phospholipid- und biotinylierten Fibroblasten-stimulierenden Liganden (FSL-1-biotin) Substraten
    1. Aliquot 100 μL kundenspezifisch synthetisiertes Alkin-POPE (1-Hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, siehe Tabelle der Materialien), in Chloroform in 1,5 ml Röhrchen gelöst.
    2. Durchstechen Sie die Röhrchen mit einer Spritze und verdampfen Sie das Chloroform in einem Speed-Vac bei RT für 2 h. Lagern Sie die trockenen Phospholipidproben bei -20 °C.
    3. Alkin-POPE vor Gebrauch in 0,1% Triton X-100 bei 500 μM auflösen. Fügen Sie einen 3-minütigen Ultraschallschritt in einem Ultraschall-Wasserbad bei RT hinzu, um Alkin-POPE bei Bedarf zu lösen.
    4. FSL-1-Biotin in Wasser bei 445 μM resuspendieren.
      HINWEIS: Beide Lösungen können mindestens 2 Monate bei -20 °C gelagert werden.

2. Röhrchen-Assay

HINWEIS: Stellen Sie an Tag 1 die Lnt-Reaktion in 1,5-ml-Röhrchen ein (Schritt 2.1) und beschichten Sie 96 Well-Platten mit Streptavidin (Schritt 2.2).

  1. Herstellung der Reagenzmischung und enzymatische Reaktion
    1. Für einen Standard-Lnt-Assay mischen Sie Alkin-POPE (endgültige 50 μM aus 500 μM-Vorrat) und FSL-1-Biotin (Endkonzentration von 50 μM aus einem 445 μM-Vorrat) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 mit 1% BSA) bei einem Endvolumen von 18 μL in 1,5-ml-Röhrchen. Führen Sie alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung durch.
    2. Die Substratmischung (hergestellt in Schritt 2.1.1) wird 3 min lang in einem Ultraschall-Wasserbad beschallt und vor der Zugabe des Enzyms Lnt bei 37 °C 5 min inkubiert (Schritt 2.1.3).
      HINWEIS: MTSES (Natrium(2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonat), ein thiolspezifisches Reagenz, hemmtLnt 8. 10 mM MTSES (100 mM Stammlösung in 100% DMSO) in die Reaktionsröhrchen geben (Schritt 2.1.1), die als Negativkontrollproben verwendet werden sollen. Stellen Sie das Volumen des Lnt-Reaktionspuffers so ein, dass das Gesamtvolumen 18 μL beträgt.
    3. Fügen Sie aktives (1 ng/μL, entsprechend 17,2 nM) oder inaktives Lnt (C387S) (2 μL 10 ng/μL Vorrat im Puffer WA mit 0,05% DDM) hinzu und mischen Sie es mit den Substraten (Schritt 2.1.2) durch Pipettieren auf und ab.
    4. Die Reaktion wird bei 37 °C für 16 h in einem Thermomixer mit beheiztem Deckel inkubiert.
  2. Streptavidin-Beschichtung von 96 Well-Platten
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung von Streptavidin bei 2 mg/ml inH2Ovor.
      HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
    2. Aus der Stammlösung 10 μg/ml Streptavidin in Wasser als Arbeitslösung herstellen. Geben Sie 100 μL der Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Binden Sie Streptavidin an die Platte, indem Sie bei 37 °C über Nacht ohne Deckel inkubieren, um die Vertiefungen an der Luft zu trocknen.

HINWEIS: Führen Sie an Tag 2 eine Klickchemie durch (Schritt 2.3), binden Sie die Lnt-Reaktionsmischung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 2.4), detektieren Sie Fluoreszenz und analysieren Sie die Ergebnisse (Schritt 2.5).

  1. Klickchemische Reaktion
    1. Stammlösungen von Azido-FAM (5 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 50 mM in Wasser hergestellt), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 2 mM in tert-Butanol:DMSO (4:1)) und CuSO4∙5H2O(50 mM frisch zubereitet inH2O).
    2. In den 1,5-ml-Röhrchen, die das in Schritt 2.1.4 hergestellte Lnt-Reaktionsgemisch enthalten, wird eine Klickchemie durchgeführt, indem die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt werden: 0,2 μL Stamm Azido-FAM (Endkonzentration 50 μM), 0,4 μL Stamm-TCEP (Endkonzentration 1 mM), 0,2 μL Stamm-TBTA (Endkonzentration 0,02 mM).
    3. Vortex die Lösung für 5 s. Dann fügen Sie 0,4 μL CuSO4 (Endkonzentration 1 mM) hinzu. Vortex wieder für 5 s. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei RT für 1 h.
  2. Bindung von Lnt-Reaktionsgemisch an Streptavidin-beschichtete Platten
    1. Die Vertiefungen der mit Streptavidin beschichteten Platten werden nach der nächtlichen Inkubation aus Schritt 2.2.2 3x mit 200 μL PBS-T1 (PBS enthält 0,05% Tween-20) gewaschen.
      HINWEIS: Streptavidinplatten können sofort verwendet oder trocken bei 4 °C gelagert werden.
    2. 18 μL aus dem Klick-Chemie-Gemisch aus Schritt 2.3.3 in eine Vertiefung in eine 96-Well-Streptavidin-beschichtete Platte überführen und 100 μL PBS-T1 zugeben, um N-Acyl-FSL-1-biotin-FAM-Produkt an Streptavidinplatten zu binden.
    3. Verwenden Sie Biotin-Fluorescein (0,26 μM aus einem 3,1 mM-Bestand in DMSO) als Positivkontrolle für die Streptavidinbindung und Fluoreszenzauslesung.
    4. Die Platten bei RT für 1 h im Dunkeln in einem Thermomixer unter Schütteln bei 300 U/min inkubieren.
    5. Führen Sie manuelle Waschschritte der 96 Well-Platten mit einer elektronischen Mehrkanalpipette wie folgt durch: sechs Waschgänge mit 200 μL PBS-T2 (PBS enthält 1% Tween-20), drei Spülungen mit einer Pipette, drei Spülungen mit 200 μL PBS, drei Spülungen mit einer Pipette.
  3. Fluoreszenzdetektion und -analyse
    1. Fügen Sie 200 μL PBS hinzu und zeichnen Sie die Fluoreszenz bei 520 nm in einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader auf. Speichern Sie die Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationssoftware.
      HINWEIS: Biotin-Fluorescein wird als Positivkontrolle für die Streptavidinbindung und Fluoreszenzdetektion bei 520 nm verwendet. Es wird ein reproduzierbarer Messwert von 30.000–40.000 A.E. mit 0,26 μM Biotin-Fluorescein erwartet. Alle Proben werden in dreifacher Ausfertigung analysiert, einschließlich Kontrollen.
    2. Berechnen Sie die Standardabweichung für jede Reaktion und berechnen Sie die P-Werte für Negativkontrollen und positive Proben unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests unter Verwendung einer statistischen Software.

3. Multiwell-Plattentest

HINWEIS: An Tag 1 die Lnt-Reaktion in 384 Well-Platten (Schritt 3.1) einrichten und 384 Well-Platten mit Streptavidin beschichten (Schritt 3.2).

  1. Herstellung der Reagenzmischung und enzymatische Reaktion
    HINWEIS: Die Menge der Reagenzien und des Enzyms ist im Vergleich zum Röhrchentest reduziert und die Lnt-Reaktion wird direkt in 384 Well-Platten durchgeführt. Dies ermöglicht den Einsatz von weniger Material und eine Reduzierung der Schritte, die weiter automatisiert werden können.
    1. Mischen Sie die Substrate wie folgt: Alkin-POPE (Endkonzentration 50 μM aus 500 μM Stoff) und FSL-1-Biotin (endgültige 50 μM aus 500 μM Vorrat) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 mit 1% BSA) bei einem Volumen von 13,5 μL pro Reaktion pro Vertiefung in einem 384-Well-Plattenformat. Führen Sie alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung durch. Berechnen Sie die Gesamtmenge an Reagenzien, die für die Anzahl der durchzuführenden Reaktionen erforderlich ist (d. h. 5.184 μL für eine 384-Well-Platte).
    2. Beschallen Sie die Substratmischung für 3 min in einem Ultraschall-Wasserbad.
    3. Aliquot 13,5 μL der Substratmischung pro Vertiefung in einer 384-Well-Platte.
      HINWEIS: Als Negativkontrolle können 10 mM MTSES (625 mM Stammlösung in 100% DMSO) pro Vertiefung hinzugefügt werden. Stellen Sie das Volumen des Lnt-Puffers ein (Schritt 3.1.1), um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 13,5 μL zu erreichen.
    4. Vor der Zugabe des Enzyms Lnt bei 37 °C 5 min inkubieren (Schritt 3.1.5).
    5. 0,5 ng/μL (entsprechend 8,6 nM) aktives Lnt-Enzym oder inaktive Variante (C387S) (1,5 μL aus 5 ng/μL Bestand im Puffer WA mit 0,05% DDM) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) in jede Vertiefung geben, die das Reaktionsgemisch aus Schritt 3.1.3 enthält. Mischen Sie Reagenzien, indem Sie auf und ab pipettieren. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 15 μL.
    6. Versiegeln Sie die Platte mit Kunststofffolie für Multiwell-Platten.
    7. Bei 37 °C für 16 h in einem Thermomischer mit beheiztem Deckel inkubieren.
  2. Streptavidin beschichtet 384 Well-Platten
    1. Verwenden Sie 75 μL Streptavidin (10 μg/ml inH2O) aus Schritt 2.2.2, um Vertiefungen einer 384-Well-Platte zu beschichten. Lassen Sie Streptavidin an die Platte binden, indem Sie bei 37 °C über Nacht ohne Deckel inkubieren, um die Vertiefungen an der Luft zu trocknen.

HINWEIS: Führen Sie an Tag 2 eine Klickchemie durch (Schritt 3.3), binden Sie die Lnt-Reaktionsmischung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 3.4), erkennen Sie Fluoreszenz und analysieren Sie die Ergebnisse (Schritt 3.5).

  1. Klickchemische Reaktion
    1. Stammlösungen von Azido-FAM (1,2 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 24 mM hergestellt in H2O), TBTA (Tris[(1-Benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 0,48 mM in tert-Butanol:DMSO (4:1)) und CuSO4∙5H2O(24 mM frisch zubereitet inH2O).
    2. Kombinieren Sie die drei Klickchemie-Reagenzien: eine Mischung aus Azido-FAM (Endkonzentration 50 μM), TCEP (1 mM final) und TBTA (0,02 mM final), jeweils bei 0,75 μL im Endvolumen von 2,25 μL pro Well. Berechnen Sie das erforderliche Volumen pro 384-Well-Platte (d. h. verwenden Sie 864 μL, wenn alle Wells der 384-Well-Platte verwendet werden). Kräftig mischen.
    3. 2,25 μl der Reagenzlösung pro Vertiefung direkt in die fertige Lnt-Reaktion in der 384-Well-Platte aus Schritt 3.1.7 geben.
    4. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren mit einer elektronischen Mehrkanalpipette.
    5. CuSO4 (0,75 μL aus 24 mM Bestand für eine Endkonzentration von 1 mM) hinzufügen und durch Pipettieren mit einer elektronischen Mehrkanalpipette auf und ab mischen.
    6. Bei RT für 1 h im Dunkeln inkubieren.
  2. Bindung des Lnt-Reaktionsgemisches an Streptavidin-beschichtete 384-Well-Platten
    1. Die Vertiefungen der Streptavidin-beschichteten Platten nach der nächtlichen Inkubation ab Schritt 3.2.1 1x mit 85 μL PBS-T1 waschen.
    2. 11 μL der Klickchemiereaktion aus jeder Vertiefung der Inkubationsplatte aus Schritt 3.3.6 auf die mit Streptavidin beschichtete Platte aus Schritt 3.4.1 übertragen, um das N-Acyl-FSL-1-biotin-FAM-Produkt an die Streptavidinplatten zu binden.
    3. Fügen Sie 64 μL Puffer PBS-T1 hinzu.
    4. Biotin-Fluorescein (0,19 μM aus einem 3,1 mM-Bestand in DMSO) als Kontrolle für die Bindung an Streptavidin-beschichtete Vertiefungen enthalten.
    5. Die 384 Well-Platten bei RT für 1 h im Dunkeln in einem Thermomixer inkubieren und bei 300 U/min schütteln.
    6. Waschen Sie die Platten mit einer automatischen Plattenwaschanlage wie folgt: 10 Wäschen mit 85 μL PBS-T2, Platten werden zwischen den Wäschen geschüttelt; 5 Wäschen mit 85 μL PBS, Platten werden zwischen den Wäschen geschüttelt.
  3. Fluoreszenzdetektion und -analyse
    1. Fügen Sie PBS (85 μL) hinzu und zeichnen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser bei 535 nm auf.
    2. Analysieren Sie die Daten wie beschrieben (Schritt 2.5.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bei der Lnt-Reaktion wird die sn-1-Fettsäure aus Phospholipiden auf ein Diacylglycerylpeptid übertragen, was zu reifem triacyliertem Peptid8 führt. Der hier beschriebene in vitro Lnt-Assay ist darauf ausgelegt, Phospholipide zu verwenden, die eine Alkinfettsäure (Alkin-POPE) und FSL-1-Biotin als Substrate enthalten, was zur Bildung von Alkin-FSL-1-Biotin führt. Bei einer Klickchemiereaktion mit Azido-FAM sollte dieses Produkt fluoreszierend markiert und mittels Fluoreszenzspektrometrie detektiert werden (Abbildung 2).

Die Reaktionsbedingungen wurden für eine maximale Fluoreszenzauslesung bei 520 nm in einem Plattenleser optimiert. Bei einem Enzym von 1 ng/μL wurde eine vollständige Umwandlung von FSL-1-Biotin beobachtet8 (Abbildung 3). Die Negativkontrollen umfassten Reaktionen ohne Enzym, mit einer inaktiven Variante des Enzyms (aktive Mutante C387S) oder mit thiolspezifischen Inhibitoren MTSES, die zu einer niedrigen Fluoreszenzdetektion führen. Biotin-Fluorescein bindet effizient an Streptavidin-beschichtete Platten und wurde als interne Kontrolle für ein maximales Fluoreszenzsignal verwendet. Alle Experimente wurden in dreifachen und Standardabweichungsberechnungen durchgeführt und statistische Analysen zeigten, dass der Assay empfindlich und reproduzierbar war.

Um einen HTS-Assay zum Screening auf niedermolekulare Inhibitoren von Lnt zu entwickeln, wurde die Menge der Reagenzien reduziert, und die Reaktionen wurden direkt in 384 Well-Platten durchgeführt. Darüber hinaus wurden die Waschschritte mit einer Plattenwaschmaschine automatisiert (siehe Materialtabelle). Was den Röhrchentest betrifft, so war die Reaktion empfindlich und reproduzierbar, mit einem signifikanten Unterschied zwischen der Negativkontrolle (C387S) und dem aktiven Enzym (Lnt) (Abbildung 4). In HTS bestimmt der Z'-Faktor, ob eine Antwort in einem Assay groß genug für Screening-Zwecke9 ist, und wird anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Equation 1

Dabei ist S das durchschnittliche Signal, B das Hintergrundsignal und σ die Standardabweichung.

Der durchschnittliche Z'-Faktor betrug >0,6 für den Lnt-Assay, der im HTS-Format unter Verwendung von 384 Well-Platten durchgeführt wurde, was darauf hindeutet, dass der Assay für das Screening kleiner Moleküle auf Lnt-Hemmung hervorragend war.

Figure 1
Abbildung 1: Enzymatische Reaktionen bei posttranslationaler Modifikation von Lipoprotein in Proteobakterien. Die aufeinanderfolgenden Schritte wurden durch Lgt10, Lsp 11 und Lnt12,13,14 in der zytoplasmatischen Membran katalysiert. PGN: Peptidoglykan, SP: Signalpeptid, LB: Lipobox, konserviertes Motiv enthaltend Cys+1 und modifiziert mit Fettsäuren und der ersten Aminosäure in reifem Lipoprotein, PG: Phosphatidylglycerin, G-1-P: Glycerin-1-phosphat, PE: Phosphatidylethanolamin, LysoPE: Lyso- phosphatidylethanolamin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung des fluorometrischen Enzymassays für Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt). Die Substrate FSL-1-Biotin (gelb) und Alkin-POPE (blau) wurden mit gereinigtem Lnt-Enzym gemischt, das in Waschmittel löslich ist. Die Reaktion wurde in gemischten Mizellen bei 37 °C durchgeführt (Schritt 1). Das Alkin-FSL-1-Biotin-Produkt wurde mittels Klickchemie (Schritt 2) mit Fluorescein (orange) markiert und in einem Fluoreszenzplattenleser nach Bindung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 3) nachgewiesen. Die Abbildung ist eine modifizierte Version von Abbildung 1B , die von Nozeret et al.8 gemäß der Creative Commons-Lizenz (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) veröffentlicht wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Fluoreszenzdetektion der Lnt-Aktivität im 96-Well-Format. Lnt-Reaktionen wurden in Röhrchen bei 37 °C für 16 h durchgeführt. Nach fluoreszierender Markierung durch Klickchemie und Bindung an Streptavidin-beschichtete Platten wurde die Fluoreszenz mittels Fluoreszenzspektrometrie gemessen. Biotin-Fluorescein (Biotin-Fluo 0,26 μM) wurde als Kontrolle für die Fluoreszenz verwendet. Puffer war nur Reaktionspuffer. Proben, die Alkin-POPE (50 μM), FSL-1-Biotin (50 μM) und Substrate (Mischung aus Alkin-POPE und FSL-1-Biotin, jeweils 50 μM) anzeigten, enthielten kein Enzym. Die Negativkontrollen umfassten eine Hemmung mit MTSES (10 mM) und eine inaktive Variante von Lnt (C387S). Lnt-Enzym wurde bei 1 ng / μL hinzugefügt. Standardabweichungen wurden für n = 3 Experimente berechnet. ** p-Wert < 0,005. Anregung bei 494 nm, Bandbreite 5 nm und Emission bei 520 nm, Bandbreite 5 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Fluoreszenzauslesung der Lnt-Reaktion in einer mit HTS kompatiblen 384-Well-Platte. Enzymatische Lnt-Reaktionen wurden in 384 Well-Platten bei 37 °C durchgeführt. Biotin-Fluorescein (Biotin-fluo 0,19 μM) wurde als Kontrolle für die Fluoreszenz verwendet. Puffer war ein Reaktionspuffer, der DMSO enthielt. Die Negativkontrollen umfassten eine Hemmung mit MTSES (10 mM) und eine inaktive Variante von Lnt (C387S). Lnt-Enzym wurde bei 0,5 ng/μL hinzugefügt. Standardabweichungen wurden für n = 3 Experimente berechnet. p-Wert < 0,0005. Anregung bei 485 nm, Bandbreite 20 nm und Emission bei 535 nm, Bandbreite 25 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll für den Lnt-Assay, basierend auf der Fluoreszenzdetektion des triacylierten Produkts, ist sensitiv und reproduzierbar. Die spezifische und effiziente Bindung von Biotin an Streptavidin ist ein Schlüsselelement des Assays. Alkin-POPE-Substrat, das nach Abschluss der Lnt-Reaktion übrig bleibt, wird ebenfalls fluoreszierend mit FAM markiert, aber nach der Bindung an die Streptavidinplatten durch mehrere Waschschritte effizient entfernt. Darüber hinaus hat die Zugabe von DMSO keinen Einfluss auf die Lnt-Aktivität und hat keinen Einfluss auf den Assay. Sowohl Substrat als auch Enzym sind stark lipophil und erfordern Reaktionsbedingungen in gemischten Mizellen. Techniken, die für den Produktnachweis auf lösliche Enzyme und Substrate angewiesen sind, einschließlich Fluoreszenzpolarisation, sind nicht anwendbar8. Die einzige Einschränkung des Assays ist die Kompatibilität des Enzyms mit Alkinsubstrat, da die Klickchemie-Reaktion von dieser chemischen Gruppe abhängig ist.

In früheren Studien wurden Gelschichtassays zur Analyse der Lnt-Aktivität und zur Bestimmung der Substratspezifität berichtet4. Mit dem aktuellen Protokoll und parallel zur Fluoreszenzspektrometrie kann die In-Gel-Fluoreszenzdetektion zur Überwachung der Lnt-Aktivität8 verwendet werden, obwohl dieses Format für HTS nicht geeignet ist. Der Röhrchentest ist besonders interessant für kinetische und vergleichende Studien von Lnt-Mutanten. Die Spezifität des Phospholipidsubstrats kann unter Verwendung von Alkin-Phospholipiden adressiert werden, die durch metabolische Markierung von Bakterien mit Alkinfettsäuren erhalten werden, die aus verschiedenen Kettenlängen und Sättigungsgraden bestehen, wie beschrieben8.

Das 384-Well-Plattenformat ist mit HTS-Studien kompatibel, da ein signifikanter Unterschied zwischen einem aktiven Enzym und einer reinen Substratkontrolle beobachtet wird. Mit den hier vorgestellten optimierten Bedingungen wurde ein durchschnittlicher Z'-Faktor von >0,6 berechnet. Die hohe Reproduzierbarkeit des Assays trägt zum hohen Z'-Faktor bei. Für ein erfolgreiches HTS wird ein Z'-Faktor über 0,6 empfohlen9. Waschschritte sind effizient mit dem Einsatz eines automatisierten Plattenwaschers. Andere Schritte können weiter optimiert werden, einschließlich des Pipettierens von Reagenzien, was das Screening großer Bibliotheken kleiner Moleküle ermöglichen würde.

Das Protokoll gilt für andere Acyltransferasen, die fettsäurehaltige Substrate verwenden, wenn Alkingruppen mit der Substraterkennung durch das Enzym kompatibel sind. Eine aktuelle Studie zur Identifizierung spezifischer Inhibitoren der eukaryotischen Palmitoyl-Acyltransferase (PAT) beschreibt die Verwendung von membrangebundenen Enzymen und Alkin-Acyl-CoA als Substrat7. Die Palmitoylierung eines kleinen biotinylierten Ras-Peptids wurde durch klickchemische fluorogene Detektion beobachtet. Ein Pilot-Screen im 384-Well-Plate-Format dieses Assays identifizierte spezifische Inhibitoren von PAT, was darauf hindeutet, dass Substrate aus Alkinfettsäuregruppe in Kombination mit Klickchemie und empfindlicher Fluoreszenzdetektion eine vielversprechende Methode für zielbasiertes HTS sind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken Fabrice Agou und Alix Boucharlat von der Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) am Institut Pasteur Paris für hilfreiche Vorschläge zum Protokoll, allen Mitgliedern der BGPB-Einheit für Unterstützung und wissenschaftliche Diskussionen und Simon Legood für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit wurde von Global Care Initiatives des Instituts Carnot Infektionskrankheiten und des Instituts Carnot Microbes and Health finanziert (15 CARN 0017-01 und 16 CARN 0023-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).

Tags

Biochemie Ausgabe 159 integrale Membranapolipoprotein N-Acyltransferase Diacylglycerylpeptid Alkin-Phospholipid Mischmizellen Klickchemie Fluoreszenz
Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nozeret, K., Pernin, A.,… More

Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter