Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Klikkemibaseret fluorometrisk assay for apolipoprotein N-acyltransferase fra enzymkarakterisering til screening med høj kapacitet

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61146
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Summary

Præsenteret her er et følsomt fluorescensassay til overvågning af apolipoprotein N-acyltransferaseaktivitet ved anvendelse af diacylglycerylpeptid og alkyn-phospholipider som substrater med klikkemi.

Abstract

Lipoproteiner fra proteobakterier modificeres posttranslationelt af fedtsyrer afledt af membranphospholipider ved virkningen af tre integrerede membranenzymer, hvilket resulterer i triacylaterede proteiner. Det første trin i lipoproteinmodifikationsvejen involverer overførsel af en diacylglycerylgruppe fra phosphatidylglycerol til prolipoproteinet, hvilket resulterer i diacylglycerylprolipoprotein. I det andet trin spaltes signalpeptidet af prolipoprotein og danner et apolipoprotein, som igen modificeres af en tredje fedtsyre afledt af et phospholipid. Dette sidste trin katalyseres af apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Lipoproteinmodifikationsvejen er afgørende i de fleste γ-proteobakterier, hvilket gør det til et potentielt mål for udviklingen af nye antibakterielle midler. Beskrevet her er et følsomt assay for Lnt, der er kompatibelt med high-throughput screening af små hæmmende molekyler. Enzymet og substraterne er membranindlejrede molekyler; Derfor er udviklingen af en in vitro-test ikke ligetil. Dette omfatter oprensning af det aktive enzym i nærværelse af vaskemiddel, tilgængeligheden af alkyn-phospholipider og diacylglycerylpeptidsubstrater og reaktionsbetingelserne i blandede miceller. For at bruge aktivitetstesten i en HTS-opsætning (High-Throughput Screening) foretrækkes direkte udlæsning af reaktionsproduktet frem for koblede enzymatiske reaktioner. I dette fluorometriske enzymassay gengives alkyntriacyleret peptidprodukt fluorescerende gennem en klikkemireaktion og detekteres i et multiwell-pladeformat. Denne metode kan anvendes til andre acyltransferaser, der anvender fedtsyreholdige substrater, herunder phospholipider og acyl-CoA.

Introduction

Bakterielle lipoproteiner er kendetegnet ved kovalent bundne fedtsyrer ved deres amino-termini, hvorigennem de er forankret i membraner 1,2. Den modne del af proteinet er meget forskelligartet i struktur og funktion, hvilket forklarer lipoproteinernes rolle i forskellige biologiske processer i bakteriecellekuverten.

Lipoproteiner modificeres af phospholipidafledte fedtsyrer efter indsættelse i den cytoplasmatiske membran. Prolipoproteinerne indeholder et signaturmotiv, lipoboxen, som indeholder en invariant cysteinrest, der bliver acyleret og den første aminosyre i det modne protein. Det første trin i denne vej katalyseres af prolipoprotein phosphatidylglycerol::d iacylglyceryltransferase (Lgt), som overfører diacylglycerylgruppen fra phosphatidylglycerol til prolipoproteinet via en thioetherforbindelse mellem diacylglyceryl og cystein. Signalpeptidase II (Lsp) spalter signalpeptidet fra diacylglycerylprolipoprotein, hvilket resulterer i et apolipoprotein, der er forankret i membranen gennem dets diacylglyceryldel. Det tredje og sidste trin katalyseres af apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt), som tilføjer en fedtsyre fra sn-1-positionen af phospholipid på apolipoprotein, hvilket resulterer i triacyleret modent lipoprotein (figur 1)3. Lnt-reaktionen er en to-trins pingpong-reaktion, hvor der dannes et stabilt thioester-acylenzymmellemprodukt. Lysophospholipidbiproduktet frigives før acylationen af apolipoproteinsubstratet i reaktionens andet trin.

Fosfolipidsubstratspecificiteten bestemmes i et Lnt-assay baseret på mobilitetsskiftet af N-acyl diacylglycerylpeptid på en høj procentdel Tris-Tricine Urea SDS-SIDE4. Fosfolipider med små polære hovedgrupper, mættet [sn-1] og umættet [sn-2], var foretrukne substrater 4. Gelskiftassayet er ikke egnet til omfattende kinetiske undersøgelser af apolipoprotein N-acyltransferase eller for HTS til at identificere hæmmende molekyler. Klikkemi ved hjælp af alkynfedtsyrer er med succes blevet brugt til at studere lipoproteinmodifikation i bakterier5 og fedtsyremetabolisme i eukaryoter6. For nylig blev der rapporteret om et in vitro-assay af Ras palmitoylation for at identificere hæmmere7.

I den her beskrevne metode inkuberes oprenset aktiv Lnt i vaskemiddel med substrater i blandede miceller til dannelse af alkyntriacyleret peptid, der efterfølgende detekteres ved fluorescensspektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Enzym- og substratpræparat

  1. Oprensning af enzym
    1. Fremstil og rens Lnt-enzym fra opløste membraner i vaskemiddel, som tidligere beskrevet 4,8. Kort fortalt induceres ekspression af lnt-strep-genet, der koder for Lnt med et C-terminal Strep-tag, ved OD600 på 0,6 med vandfri tetracyclin (200 ng/ml) ved 37 °C i 16 timer.
    2. Høst celler ved centrifugering ved 4.000 x g i 10 min og kassér supernatanten.
    3. Cellepelleten resuspenderes i buffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) til 100 OD600 enheder pr. ml.
    4. Bryd cellerne ved to passager gennem en fransk trykcellepresse ved 10.000 psi.
    5. Ubrudte celler og snavs fjernes ved centrifugering ved 13.000 x g i 20 min. Opbevar supernatanten og kassér pellet.
    6. Supernatanten centrifugeres ved 120.000 x g i 60 minutter, og membranvesiklerne opsamles (gennemskinnelig brunfarvet pellet). Kassér supernatanten.
    7. Opsæt de integrerede membranproteiner fra membranpelleten med 1% (w/v) n-Dodecyl β-D-maltosid (DDM) i buffer-WA i 30 minutter ved stuetemperatur (RT). Der centrifugeres og fjernes uopløseligt materiale ved 120.000 x g i 30 min. Brug supernatantfraktionen til rensning.
    8. Lnt-strep renses på en affinitetskromatografikolonne (se Materialetabel) og en S400 gelfiltreringskolonne (se Materialetabel) som beskrevet af Nozeret et al.8.
    9. Det oprensede enzym opbevares i buffer-WA indeholdende 0,05% DDM og 10% glycerol ved -80 °C.
      BEMÆRK: Enzymet er stabilt i over 5 år.
  2. Fremstilling af alkyn-phospholipid og biotinylerede fibroblaststimulerende ligandsubstrater (FSL-1-biotin) substrater
    1. Aliquot 100 μL specialsyntetiseret alkyn-POPE (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, se Materialetabel) opløst i chloroform i 1,5 ml rør.
    2. Gennembor rørene med en sprøjte og fordamp chloroformen i en speed-vac ved RT i 2 timer. De tørre phospholipidprøver opbevares ved -20 °C.
    3. Opløs alkyn-POPE i 0,1% Triton X-100 ved 500 μM før brug. Tilsæt et 3 minutters sonikeringstrin i et ultralydsvandbad ved RT for at opløse alkyn-POPE, hvis det er nødvendigt.
    4. Resuspend FSL-1-biotin i vand ved 445 μM.
      BEMÆRK: Begge opløsninger kan opbevares ved -20 °C i mindst 2 måneder.

2. Rør assay

BEMÆRK: På dag 1 skal du indstille Lnt-reaktionen i 1,5 ml rør (trin 2.1) og belægge 96 brøndplader med streptavidin (trin 2.2).

  1. Fremstilling af reagensblanding og enzymatisk reaktion
    1. For et standard Lnt-assay blandes alkyn-POPE (endelig 50 μM fra 500 μM lager) og FSL-1-biotin (endelig koncentration på 50 μM fra en 445 μM-bestand) i Lnt-reaktionsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 indeholdende 1% BSA) ved et endeligt volumen på 18 μL i 1,5 ml rør. Udfør alle forhold i tre eksemplarer.
    2. Substratblandingen (fremstillet i trin 2.1.1) sonikeres i 3 minutter i et ultralydsvandbad og inkuberes ved 37 °C i 5 minutter før tilsætning af Lnt-enzym (trin 2.1.3).
      BEMÆRK: MTSES (natrium (2-sulfonatoethyl)methanthosulfonat), et thiolspecifikt reagens, hæmmer Lnt8. Der tilsættes 10 mM MTSES (100 mM stamopløsning i 100 % DMSO) til reaktionsrørene (trin 2.1.1) til brug som negative kontrolprøver. Juster volumenet af Lnt-reaktionsbufferen, så det samlede volumen er 18 μL.
    3. Der tilsættes aktiv (1 ng/μL, svarende til 17,2 nM) eller inaktiv Lnt (C387S) (2 μL 10 ng/μL i buffer-WA indeholdende 0,05 % DDM), og der blandes med substraterne (trin 2.1.2) ved at pipettere op og ned.
    4. Inkubere reaktionen ved 37 °C i 16 timer i en termomixer med opvarmet låg.
  2. Streptavidin belægning af 96 brøndplader
    1. Der fremstilles en stamopløsning af streptavidin ved 2 mg/ml i H2O.
      BEMÆRK: Denne opløsning kan opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
    2. Fra stamopløsningen fremstilles 10 μg/ml streptavidin i vand som arbejdsløsning. Der tilsættes 100 μL opløsning til hver brønd i 96-brøndpladen. Bind streptavidin til pladen ved at inkubere ved 37 °C natten over uden låg for at lufttørre brøndene.

BEMÆRK: På dag 2 udføres klikkemi (trin 2.3), binde Lnt-reaktionsblanding til streptavidinbelagte plader (trin 2.4) og detektere fluorescens og analysere resultater (trin 2.5).

  1. Klik-kemi reaktion
    1. Stamopløsninger af Azido-FAM (5 mM i DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 50 mM fremstillet i vand), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 2 mM i tert-butanol:DMSO (4:1)) og CuSO4∙5H 2o (50 mM frisklavet i H2O).
    2. I 1,5 ml rørene indeholdende Lnt-reaktionsblandingen, der blev fremstillet i trin 2.1.4, udføres klikkemi ved at tilsætte reagenserne i følgende rækkefølge: 0,2 μL bestand Azido-FAM (slutkoncentration 50 μM), 0,4 μL stam-TCEP (slutkoncentration 1 mM), 0,2 μL stam-TBTA (endelig koncentration 0,02 mM).
    3. Vortex opløsningen til 5 s. Derefter tilsættes 0,4 μLCuSO4 (slutkoncentration 1 mM). Vortex igen i 5 s. Inkuber prøverne i mørke ved RT i 1 time.
  2. Binding af Lnt-reaktionsblandingen til streptavidinbelagte plader
    1. Brøndene på de streptavidinbelagte plader vaskes efter inkubationen natten over fra trin 2.2.2 3x med 200 μL PBS-T1 (PBS indeholdende 0,05% Tween-20).
      BEMÆRK: Streptavidinplader kan bruges med det samme eller opbevares tørt ved 4 °C.
    2. Der overføres 18 μL fra klikkemiblandingen fra trin 2.3.3 til en brønd i en 96 brønd streptavidinbelagt plade, og der tilsættes 100 μL PBS-T1 for at binde N-acyl-FSL-1-biotin-FAM-produktet til streptavidinplader.
    3. Brug biotin-fluorescein (0,26 μM fra en 3,1 mM bestand i DMSO) som positiv kontrol for streptavidinbinding og fluorescensudlæsning.
    4. Inkuber pladerne ved RT i 1 time i mørke i en termomixer, ryst ved 300 o / min.
    5. Udfør manuelle vasketrin på de 96 brøndplader med en multikanals elektronisk pipette som følger: seks vaske med 200 μL PBS-T2 (PBS indeholdende 1% Tween-20), tre skylninger med en pipette, tre vaske med 200 μL PBS, tre skylninger med en pipette.
  3. Detektion og analyse af fluorescens
    1. Der tilsættes 200 μL PBS, og fluorescensen registreres ved 520 nm i en fluorescensmikropladelæser. Gem resultater i regnearkssoftware.
      BEMÆRK: Biotin-fluorescein anvendes som en positiv kontrol til streptavidinbinding og fluorescensdetektion ved 520 nm. Der forventes en reproducerbar aflæsning på 30.000-40.000 A.U. med 0,26 μM biotin-fluorescein. Alle prøver analyseres i tre eksemplarer, herunder kontroller.
    2. Beregn standardafvigelsen for hver reaktion og beregn P-værdierne for negative kontroller og positive prøver ved hjælp af uparret t-test ved hjælp af en statistisk software.

3. Multiwell plade assay

BEMÆRK: På dag 1 opsættes Lnt-reaktionen i 384 brøndplader (trin 3.1) og belægges 384 brøndplader med streptavidin (trin 3.2).

  1. Fremstilling af reagensblanding og enzymatisk reaktion
    BEMÆRK: Mængden af reagenser og enzym reduceres sammenlignet med rørassayet, og Lnt-reaktionen udføres direkte i 384 brøndplader. Dette tillader brug af mindre materiale og en reduktion af trin, der kan automatiseres yderligere.
    1. Substraterne blandes som følger: alkyn-POPE (slutkoncentration 50 μM fra 500 μM bestand) og FSL-1-biotin (endelig 50 μM fra 500 μM bestand) i Lnt-reaktionsbuffer (50 mM Tris-HCI pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 indeholdende 1% BSA) ved et volumen på 13,5 μL pr. reaktion pr. brønd i et 384 brøndpladeformat. Udfør alle forhold i tre eksemplarer. Den samlede mængde reagenser, der kræves for antallet af reaktioner, der skal udføres (dvs. 5.184 μL for en 384-brøndplade), beregnes.
    2. Sonicer substratblandingen i 3 minutter i et ultralydsvandbad.
    3. Aliquot 13,5 μL af substratblandingen pr. brønd i en 384 brøndplade.
      BEMÆRK: Som en negativ kontrol kan der tilsættes 10 mM MTSES (625 mM lageropløsning i 100% DMSO) pr. Brønd. Volumenet af Lnt-bufferen (trin 3.1.1) justeres for at nå et endeligt reaktionsvolumen på 13,5 μL.
    4. Der inkuberes ved 37 °C i 5 minutter før tilsætning af Lnt-enzym (trin 3.1.5).
    5. Der tilsættes 0,5 ng/μL (svarende til 8,6 nM) aktivt Lnt-enzym eller inaktiv variant (C387S) (1,5 μL fra 5 ng/μL lager i buffer-WA indeholdende 0,05 % DDM) i Lnt-reaktionsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 % BSA) til hvert hul, der indeholder reaktionsblandingen fra trin 3.1.3. Bland reagenser ved at pipettere op og ned. Det samlede reaktionsvolumen er 15 μL.
    6. Forsegl pladen med plastfolie til multiwell-plader.
    7. Inkuberes ved 37 °C i 16 timer i en termomixer med opvarmet låg.
  2. Streptavidin belægning 384 brøndplader
    1. Brug 75 μL streptavidin (10 μg/ml i H 2 O) fra trin2.2.2 til at belægge brønde på en 384 brøndplade. Lad streptavidin binde til pladen ved at inkubere ved 37 °C natten over uden låg for at lufttørre brøndene.

BEMÆRK: På dag 2 udføres klikkemi (trin 3.3), binde Lnt-reaktionsblanding til streptavidinbelagte plader (trin 3.4), detektere fluorescens og analysere resultater (trin 3.5).

  1. Klik-kemi reaktion
    1. Stamopløsninger af Azido-FAM (1,2 mM i DMSO), TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 24 mM fremstillet i H 2 O), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 0,48 mM i tert-butanol:DMSO (4:1)) og CuSO4∙5H 2O (24 mM frisklavet i H2O).
    2. Kombiner de tre klikkemireagenser: en blanding af Azido-FAM (slutkoncentration 50 μM), TCEP (1 mM endelig) og TBTA (0,02 mM endelig), hver ved 0,75 μL i slutvolumen på 2,25 μL pr. brønd. Beregn det krævede volumen pr. 384 brøndplade (dvs. brug 864 μL, når alle brønde i 384-brøndpladen er brugt). Bland kraftigt.
    3. Der tilsættes 2,25 μL reagensopløsning pr. brønd direkte til den færdige Lnt-reaktion i 384-brøndpladen fra trin 3.1.7.
    4. Bland ved at pipettere op og ned med en multikanals elektronisk pipette.
    5. Der tilsættes CuSO4 (0,75 μL fra 24 mM stammateriale for en slutkoncentration på 1 mM) og blandes ved at pipettere op og ned med en flerkanals elektronisk pipette.
    6. Inkuberes ved RT i 1 time i mørket.
  2. Binding af Lnt-reaktionsblanding til streptavidinbelagte 384-brøndplader
    1. Brøndene på de streptavidinbelagte plader vaskes efter inkubationen natten over fra trin 3.2.1 1x med 85 μL PBS-T1.
    2. 11 μL af klikkemireaktionen overføres fra hver brønd i inkubationspladen fra trin 3.3.6 til den streptavidinbelagte plade fra trin 3.4.1 for at binde produktet N-acyl-FSL-1-biotin-FAM til streptavitinpladerne.
    3. Der tilsættes 64 μL buffer PBS-T1.
    4. Medtag biotin-fluorescein (0,19 μM fra en 3,1 mM bestand i DMSO) som en kontrol til binding til streptavidinbelagte brønde.
    5. Inkuber de 384 brøndplader ved RT i 1 time i mørket i en termomixer, ryst ved 300 o / min.
    6. Pladerne vaskes med en automatisk pladevasker som følger: 10 vaske med 85 μL PBS-T2, plader rystes mellem vaske; 5 vaske med 85 μL PBS, plader rystes mellem vaske.
  3. Detektion og analyse af fluorescens
    1. Der tilsættes PBS (85 μL), og fluorescens registreres i en fluorescensmikropladelæser ved 535 nm.
    2. Analysere data som beskrevet (trin 2.5.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I Lnt-reaktionen overføres sn-1-fedtsyren fra phospholipider til et diacylglycerylpeptid, hvilket resulterer i modent triacyleret peptid8. In vitro Lnt-assayet, der er beskrevet her, er designet til at anvende phospholipider indeholdende en alkynfedtsyre (alkyn-POPE) og FSL-1-biotin som substrater, hvilket resulterer i dannelsen af alkyn-FSL-1-biotin. Ved en klikkemireaktion med azido-FAM skal dette produkt fluorescerende mærkes og detekteres ved fluorescensspektrometri (figur 2).

Reaktionsbetingelserne blev optimeret til maksimal fluorescensaflæsning ved 520 nm i en pladelæser. Ved 1 ng/μL enzym blev fuldstændig omdannelse af FSL-1-biotin observeret8 (figur 3). Negative kontroller omfattede reaktioner uden enzym, med en inaktiv variant af enzymet (aktiv site mutant C387S) eller med thiol-specifik hæmmer MTSES, der resulterer i lav fluorescensdetektion. Biotin-fluorescein bundet effektivt til streptavidinbelagte plader og blev brugt som en intern kontrol for maksimalt fluorescenssignal. Alle eksperimenter blev udført i tredobbelte og standardafvigelsesberegninger, og statistisk analyse viste, at analysen var følsom og reproducerbar.

For at udvikle et HTS-assay til screening for små molekylehæmmere af Lnt blev mængden af reagenser reduceret, og reaktionerne blev udført direkte i 384 brøndplader. Desuden blev vasketrin automatiseret ved hjælp af en pladevasker (se Materialetabel). Med hensyn til røranalysen var reaktionen følsom og reproducerbar med en signifikant forskel mellem den negative kontrol (C387S) og det aktive enzym (Lnt) (figur 4). I HTS bestemmer Z'-faktoren, om et svar i et assay er stort nok til screeningsformål9 og beregnes ved hjælp af følgende ligning:

Equation 1

Hvor S er det gennemsnitlige signal, B er baggrundssignal, og σ er standardafvigelse.

Den gennemsnitlige Z 'faktor var >0,6 for Lnt-analysen udført i HTS-format ved hjælp af 384 brøndplader, hvilket tyder på, at analysen til screening af lille molekyle for Lnt-hæmning var fremragende.

Figure 1
Figur 1: Enzymatiske reaktioner i posttranslationel modifikation af lipoprotein i proteobakterier. De sekventielle trin blev katalyseret af Lgt 10, Lsp11 og Lnt12,13,14 i den cytoplasmatiske membran. PGN: peptidoglycan, SP: signalpeptid, LB: lipobox, konserveret motiv indeholdende Cys + 1 og modificeret med fedtsyrer og den første aminosyre i modent lipoprotein, PG: phosphatidylglycerol, G-1-P: glycerol-1-phosphat, PE: phosphatidylethanolamin, lysoPE: lysophosphatidylethanolamin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk af det fluorometriske enzymassay for apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Substraterne FSL-1-biotin (gul) og alkyn-POPE (blå) blev blandet med oprenset Lnt-enzym opløst i vaskemiddel. Reaktionen blev udført i blandede miceller ved 37 °C (trin 1). Alkyn-FSL-1-biotinproduktet blev mærket med fluorescein (orange) ved klikkemi (trin 2) og detekteret i en fluorescenspladelæser ved binding til streptavidinbelagte plader (trin 3). Figuren er en modificeret version af figur 1B udgivet af Nozeret et al.8 i henhold til Creative Commons-licensen (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Fluorescensdetektion af Lnt-aktivitet i 96-brøndformat. Lnt-reaktioner blev udført i rør ved 37 °C i 16 timer. Efter fluorescerende mærkning ved klikkemi og binding til streptavidinbelagte plader blev fluorescens målt ved fluorescensspektrometri. Biotin-fluorescein (biotin-fluo 0,26 μM) blev anvendt som kontrol for fluorescens. Buffer var kun reaktionsbuffer. Prøver, der indikerede alkyn-POPE (50 μM), FSL-1-biotin (50 μM) og substrater (blanding af alkyn-POPE og FSL-1-biotin, 50 μM hver) indeholdt ikke enzym. Negative kontroller omfattede hæmning med MTSES (10 mM) og en inaktiv variant af Lnt (C387S). Lnt-enzym blev tilsat ved 1 ng/μL. Standardafvigelser blev beregnet for n = 3 eksperimenter. ** P-værdi < 0,005. Excitation ved 494 nm, båndbredde 5 nm og emission ved 520 nm, båndbredde 5 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Fluorescensaflæsning af Lnt-reaktionen i 384 brøndplade kompatibel med HTS. Enzymatiske Lnt-reaktioner blev udført i 384 brøndplader ved 37 °C. Biotin-fluorescein (biotin-fluo 0,19 μM) blev anvendt som kontrol for fluorescens. Buffer var reaktionsbuffer indeholdende DMSO. Negative kontroller omfattede hæmning med MTSES (10 mM) og en inaktiv variant af Lnt (C387S). Lnt-enzym blev tilsat ved 0,5 ng/μL. Standardafvigelser blev beregnet for n = 3 forsøg. P-værdi < 0,0005. Excitation ved 485 nm, båndbredde 20 nm og emission ved 535 nm, båndbredde 25 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen for Lnt-analysen, der er beskrevet her, baseret på fluorescensdetektion af det triacylerede produkt, er følsom og reproducerbar. Den specifikke og effektive binding af biotin til streptavidin er et centralt element i analysen. Alkyne-POPE-substrat, der er tilbage efter afslutningen af Lnt-reaktionen, er også fluorescerende mærket med FAM, men fjernes effektivt efter binding på streptavitinpladerne ved flere vasketrin. Desuden påvirker tilføjelsen af DMSO ikke Lnt-aktiviteten og har ingen indflydelse på analysen. Både substrat og enzym er meget lipofile og kræver reaktionsbetingelser i blandede miceller. Teknikker, der er afhængige af opløselige enzymer og substrater til produktdetektion, herunder fluorescenspolarisation, finder ikke anvendelse8. Den eneste begrænsning af analysen er enzymets kompatibilitet med alkynsubstrat, fordi klikkemireaktionen er afhængig af denne kemiske gruppe.

Gelskiftassays er blevet rapporteret i tidligere undersøgelser for at analysere Lnt-aktivitet og for at bestemme substratspecificitet4. Med den nuværende protokol og parallelt med fluorescensspektrometri kan in-gel fluorescensdetektion bruges til at overvåge Lnt-aktivitet8, selvom dette format ikke er egnet til HTS. Røranalysen er især interessant for kinetiske og sammenlignende undersøgelser af Lnt-mutanter. Fosfolipidsubstratspecificitet kan behandles ved anvendelse af alkyn-phospholipider opnået ved metabolisk mærkning af bakterier med alkynfedtsyrer sammensat af forskellige kædelængder og mætningsgrad som beskrevet8.

384-brøndpladeformatet er kompatibelt med HTS-undersøgelser, fordi der observeres en signifikant forskel mellem aktivt enzym og en substratkontrol. En gennemsnitlig Z 'faktor på >0,6 blev beregnet med de optimerede forhold, der præsenteres her. Den høje reproducerbarhed af analysen bidrager til den høje Z 'faktor. For vellykket HTS anbefales en Z'faktor over 0,69. Vasketrin er effektive ved brug af en automatiseret pladevasker. Andre trin kan optimeres yderligere, herunder pipettering af reagenser, hvilket ville muliggøre screening af store biblioteker af små molekyler.

Protokollen gælder for andre acyltransferaser, der anvender fedtsyreholdige substrater, hvis alkyngrupper er kompatible med substratgenkendelse af enzymet. En nylig undersøgelse af identifikation af specifikke hæmmere af eukaryot Palmitoyl Acyl Transferase (PAT) beskriver anvendelse af membranbundet enzym og alkyn-acyl-CoA som substrat7. Palmitoylation af et lille biotinyleret Ras-peptid blev observeret ved klikkemi fluorogen detektion. En pilotskærm i 384 brøndpladeformat af dette assay identificerede specifikke hæmmere af PAT, hvilket tyder på, at substrater sammensat af alkynfedtsyregruppe kombineret med klikkemi og følsom fluorescensdetektion er en lovende metode til målbaseret HTS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Fabrice Agou og Alix Boucharlat fra Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) ved Institut Pasteur Paris for nyttige forslag til protokollen, alle medlemmer af BGPB-enheden for støtte og videnskabelige diskussioner og Simon Legood for kritisk læsning af manuskriptet. Arbejdet blev finansieret af Global Care Initiatives fra Institute Carnot Infectious Diseases og Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 og 16 CARN 0023-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).

Tags

Biokemi udgave 159 integreret membranapolipoprotein N-acyltransferase diacylglycerylpeptid alkyn-phospholipid blandede miceller klikkemi fluorescens
Klikkemibaseret fluorometrisk assay for apolipoprotein N-acyltransferase fra enzymkarakterisering til screening med høj kapacitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nozeret, K., Pernin, A.,… More

Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter