Summary
세균이 없는 나파 양배추를 재배하는 방법은 연구자들이 양배추 잎 표면에서 단일 미생물 종 또는 다종 미생물 공동체가 어떻게 상호 작용하는지 평가할 수 있도록 개발되었습니다. 멸균 식물성 추출물은 또한 식물성 발효 시 지역 사회 조성의 변화를 측정하는 데 사용할 수있는 것으로 제시됩니다.
Abstract
미생물에 의해 식민지화될 수 있는 식물의 상부 인 필로스피어는 미생물 공동체 조립의 과정을 식별하는 유용한 모델 시스템이다. 이 프로토콜은 나파 양배추 식물의 필로스피어에서 미생물 공동체 역학을 연구하기위한 시스템을 설명합니다. 그것은 석회화 점토와 영양 국물 기판시험관에서 세균없는 식물을 성장하는 방법을 설명합니다. 특정 미생물 배양과 세균이없는 식물의 접종은 필로스피어의 미생물 성장과 지역 사회 역학을 측정 할 수있는 기회를 제공합니다. 양배추에서 생산된 멸균 식물성 추출물의 사용을 통해 발효 중에 발생하는 미생물 공동체의 이동도 평가될 수 있다. 이 시스템은 실험실에 설치하는 것이 비교적 간단하고 저렴하며 미생물 커뮤니티 어셈블리에서 주요 생태 학적 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 필로스피어 커뮤니티 구성이 식물성 발효의 미생물 다양성과 품질에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해할 수 있는 기회를 제공합니다. gnotobiotic 양배추 필로스피어 지역 사회를 개발하기위한이 접근 방식은 다른 야생 및 농업 식물 종에 적용 될 수있다.
Introduction
필로피어의 미생물 다양성은 식물의 건강을 유지하는 데 중요한 역할을 하며 식물의 환경 응력1,,2,,3,,4,,5를견딜 수 있는 능력에영향을 미칠 수 있다. 차례로, 작물의 건강은 식품 안전 및 품질6,,7에직접적인 영향을 미칩니다. 식물은 생태계 기능에서 역할을 하며, 관련 미생물군유전체는 식물이 이러한 활동을 수행하는 능력에 영향을 미치고 환경 자체에 직접적인 영향을미친다8. 과학자들은 필로스피어의 기능과 구성을 해독하기 시작했지만, 필로스피어 미생물 공동체 조립에 영향을 미치는 생태학적 과정은9,,10을완전히 이해하지 못한다. 필로스피어 미생물군유전체는미생물군유전체(11)의생태학을 연구하기 위한 우수한 실험 시스템이다. 이러한 커뮤니티는 비교적 간단하며 커뮤니티 구성원의 대부분은 표준 실험실 미디어10,,12,,13에서재배 할 수 있습니다.
발효 된 채소는 필로스피어의 지역 사회 구조가 중요한 결과를 초래하는 하나의 시스템입니다. 소금에 절인 양배추와 김치 모두에서, 자연적으로 야채 잎 (브라시카 종의 필로스피어)에서 발생하는 미생물은 발효,14,15의발효를위한 접종역할을한다. 유산균(LAB)은 식물성 미생물군유전체의 유비쿼터스 멤버로 간주되지만,필로스피어(16)에서낮은 풍부하게 함유될 수 있다. 발효 중 강력한 아바이오틱 선택은 유산균이 풍부하게 증가할 수 있도록 미생물 공동체 조성의 변화를 촉진합니다. LAB이 성장함에 따라 발효 야채제품(17)의산성 환경을 조성하는 유산산을 생산한다. 필로스피어와 발효 사이의 링크는 미생물군유전체가 어떻게 구조화되는지 이해하는 모델로 채소를 사용할 수 있는 기회를 제공한다.
우리는 세균이없는 나파 양배추를 재배하고 스프레이 병을 사용하여 특정 미생물 지역 사회와 접종하는 방법을 개발했습니다. 이것은 개별 미생물 또는 혼합 된 지역 사회 중 하나 양배추를 고르게 접종하는 저렴하고 신뢰할 수있는 방법입니다. 멸균 야채 추출물(SVE)은 빨강과 녹색양배추(브라시카 올레라사)와나파양배추(B. 라파)의세 가지 양배추 타입/품종에서 개발되었습니다. 이러한 SV에 소금을 첨가하면 발효 환경을 복제하고 발효 미생물군유전체 조립에 대한 소규모 및 비교적 높은 처리량 실험 연구를 가능하게 합니다. 이러한 방법은 필로스피어에서 미생물 공동체 어셈블리를 연구하고 필로피어의 미생물 공동체 역학이 식물성 발효의 성공과 어떻게 연관될 수 있는지를 연구하는 데 사용될 수 있다.
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Protocol
1. 세균이 없는 양배추 를 재배
- 세균이 없는 양배추 를 재배하기 위한 장비 준비
- 미세먼지 를 제거하기 위해 석회화점 세척
- 수돗물로 소목(재료테이블)을헹구는 데 3배 이상; 물을 빼내십시오.
주의: 석회화점은 매우 미세한 먼지를 생성하며 세척 시 보호마스크(재료 표)를착용하는 것이 좋습니다. - 소독하기 위해 소싱 된 점토를 얇은 층 (~4cm)을 오토클레이브 트레이에 넣고 건조 사이클 (121 °C 가열 20 분 및 건조 시간 20 분)에 오토클레이브를 퍼냅니다.
- 칼수개 점토가 트레이에 펴서 적어도 일주일 동안 따뜻한 인큐베이터(30-37°C)에 배치하여 사용하기 전에 완전히 건조하도록 허용합니다. 3일마다 섞어 석회화점과 스쿠그(MS) 영양국수(1.2절)를 흡수할 수 있도록 충분히 건조합니다.
참고: 건조는 또한 튜브에 무게를 두어도 석회화점의 부피를 유지하는 데 도움이 됩니다. 건조 오븐과 같은 다른 방법으로 건조하는 것도 적합합니다.
- 수돗물로 소목(재료테이블)을헹구는 데 3배 이상; 물을 빼내십시오.
- 세균이 없는 양배추를 재배하기 위한 유리제품 청소
- 유리 튜브(재료의 표)를철저히 청소하고 소독 할 때마다 사용하십시오. 30% 표백제 용액으로 튜브를 30분 간 담그고 수돗물로 잘 헹구고 세균학 환경에서 산성 세척으로 세척하십시오. 산세척 양방향 테스트 튜브캡(재료 표)을사용 한다.
- 표면 살균 양배추 씨앗
- 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브에 최대 100나파양배추(B. 라파 바르 페키넨시스)씨앗을 놓습니다.
참고: 1개의 미세원심분리기 관에 100개 이상의 씨앗을 추가하거나 튜브의 크기를 변경하면 종자 외투 제거부족으로 인한 씨앗의 발아 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. - 씨앗과 소용돌이에 70% 에탄올 1mL을 넣고 5분 동안 피펫을 사용하여 에탄올을 버립니다.
- 5분 동안 표백제와 소용돌이 1mL을 추가합니다.
- 5 분 동안 오토클레이브 된 분과 소용돌이 의 1 mL을 추가합니다.
- 모든 표백제에서 헹기 위해 1.1.3.4 3배를 반복하십시오. 씨앗을 부드럽게 하기 위해 심기 전에 2-8 시간 동안 멸균 된 물에 씨앗을 담급니다.
- 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브에 최대 100나파양배추(B. 라파 바르 페키넨시스)씨앗을 놓습니다.
- 미세먼지 를 제거하기 위해 석회화점 세척
- 성장하는 세균없는 양배추
참고: 나파 양배추(B. 라파 바르 페키넨시스)는무라시게와 스쿠오 (MS) 영양 국물에 담근 석회화 점토를 함유 한 유리 튜브 (15cm x 2.5cm)에서 재배됩니다.Figure 1- 깨끗한 석회화 점토 10g을 깨끗한 유리 튜브(15cm x 2.5cm)에 넣습니다.
- 1L의 탈온화물에 MS 배지 4.4 g을 용해시켜 MS 영양국물을 준비합니다. 각 유리 튜브에 MS 영양국수(~9mL)를 추가하여 파이펫을 사용하여 석회화점토를 덮습니다.
참고 : 튜브에 액체를 서면 씨앗이 발아되는 것을 방지하므로 일부 튜브에 MS 국물을 약간 적게 추가해야합니다. - 느슨하게 22mm 양방향 테스트 튜브 캡과 오토 클레이브 (60 분 동안 121 ° C)와 유리 튜브를 캡. 오토클레이브에서 제거하면 캡을 유리 튜브에 밀어 밀봉합니다. 사용하기 전에 실내 온도에 튜브를 냉각합니다.
- 멸균 양배추 씨앗 1개를 멸균, 여분의 긴(25.4cm) 집게를 사용하여 각 튜브의 중앙에 부드럽게 놓습니다. 튜브를 7방향 트레이에 놓은 다음 24°C에서 16h 광사이클을 사용하여 광랙(풀 스펙트럼 T5 형광 전구 또는 식물 성장을 위한 기타 조명 설정)에 놓습니다.
참고 : 씨앗은 하룻밤 발아하고 5 일 후 첫 번째 진정한 잎을 개발합니다. 진정한 잎은 코틸레던이 형성된 후 최초의 혈관 잎입니다. 그것은 더 주름 가장자리와 브라시카 라파에서 트리홈으로 덮여있다.
- 세균이 없는 양배추의 멸균 에 대한 테스트
참고: 양배추가 세균이 없는지 테스트하려면 각 배치에서 몇 개의 양배추(5-10) 양배추를 선택하고 접시에 나와 어떤 배컬 가능한 식민지가 있는지 확인합니다.- 소독 된 포셉으로 식물의 베이스를 잡고 꺼내서 유리 튜브에서 양배추를 부드럽게 제거합니다. 튜브에서 양배추를 완전히 제거하기 전에 살균 된 해부 가위를 사용하여 뿌리를 조심스럽게 잘라냅니다. 양배추 잎을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 압축합니다.
참고: 양배추가 튜브에 있는 동안 양배추가 1.5mL 미세 센세리후근 튜브에 양배추를 쉽게 넣을 수 있도록 더 큰 잎 중 하나 또는 두 개의 제거가 필요할 수 있습니다. 이 더 큰 잎은 양배추의 나머지가 전체 양배추가 필요한 경우 튜브에 배치 된 후 1.5 mL 튜브에 추가 될 수 있습니다. - 각 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 1x 인산염 완충식염식염수(PBS)의 400μL을 추가합니다. 멸균 마이크로페슬을 사용하여 양배추를 30배 봉제하여 균질화합니다.
- 양배추의 플레이트 100 μL은 식기 판에 균질화되어 시료에 오염 물질이 있는지 여부를 결정합니다. 필로스피어에서 발견되는 대부분의 박테리아는 트립틱 콩(TS) 한천 판에서 자랍니다. 양배추 균질이 두껍고 일반 파이펫 팁을 막을 수 있기 때문에 양배추 균질을 도금 할 때 넓은 오리피스 파이펫 팁을 사용하십시오.
- 소독 된 포셉으로 식물의 베이스를 잡고 꺼내서 유리 튜브에서 양배추를 부드럽게 제거합니다. 튜브에서 양배추를 완전히 제거하기 전에 살균 된 해부 가위를 사용하여 뿌리를 조심스럽게 잘라냅니다. 양배추 잎을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 압축합니다.
2. 미생물 솔루션으로 필로스피어 접종
- 접종 균주의 글리세롤 주식 만들기
참고: 표 1에는 이 단계에서 사용할 수 있는 미생물 격리가 나열되어 있습니다. 다른 필로스피어 분리도 여기에서 사용될 수 있다.- 신선한 줄무늬에서 개별 식민지를 조밀하게 줄무늬, 많은 식민지를 얻기 위해 같은 미디어의 두/ 세 개의 새로운 접시에.
- 줄무늬가 2-5 일 동안 성장한 다음 모든 플레이트에서 15 mL의 글리세롤을 포함하는 15 mL 원전 튜브로 식민지를 긁어 내고 소용돌이가 완전히 섞이도록합니다.
- 잘 혼합된 글리세롤 스톡 1mL의 알리쿼트(aliquot)를 1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브로 옮기고 글리세롤 재고를 -80°C에서 사용할 때까지 저장한다. 양배추를 접종할 때 상대적으로 대량의 접종 용액이 요구되기 때문에 -80°C에서 나머지 14mL의 글리세롤 스톡을 저장한다.
- 사용하기 1주일 전에, 1.5mL의 글리세롤 스톡(단계 2.1.3에서) 얼음, 희석 및 플레이트에 있는 1.5mL 튜브를 여러 가지 희석(예를 들어,10-4,10-5및10-6)에서해동하여 14ml의 농도(콜로니 형성 단위 [CFU]를 μL당)로 결정한다.
- 살균 접종 스프레이 병
- 호박색 라운드 보스턴 펌프 병(59mL)을 분해하고 모든 부품(펌프, 튜브, 캡 및 병)을 30% 표백액으로 30분간 담그고 뚜껑을 단단히 끼우고 있는 대형 플라스틱 용기에 넣습니다.
- 몸을 담그고 용기 뚜껑의 한 쪽 모서리만 들어 올려 용기에서 모든 표백제를 조심스럽게 붓습니다.
- 플라스틱 용기를 오토클레이브 탈수(용기 크기에 따라 ~1L)로 채우고 한 쪽 모서리에 뚜껑을 들어 올려 다시 조심스럽게 물을 붓습니다.
- 70% 에탄올 용액을 살포하고 자외선을 30분 동안 켜서 바이오 세이프티 캐비닛을 살균합니다.
참고: 바이오 세이프티 캐비닛에서 이 작업을 계속하여 공기가 건조할 때 병의 미생물 오염 위험이 없도록 하십시오. - 대형 플라스틱 용기에서 병을 제거하고 파이펫을 사용하여 각 병을 오토클레이브 디온화 된 물로 채웁니다. 펌프를 다시 조립하고 각 병에 하나씩 놓습니다. 각 병(병당 10분무)을 통해 탈이온된 물을 펌핑하여 병의 펌프 구성 요소에서 표백제제거합니다.
- 모든 표백제가 유리 병에서 제거되도록 2.2.5 단계를 반복하십시오.
- 각 병에 숫자를 배치하여 병이 멸균되는지 여부를 테스트한 다음 각 병에 1x PBS 10mL를 추가하고 TS 한천 접시에 스프레이 3개를 펌프합니다. 살포 후, 실온에서 1 주일 동안 접시를 배양하십시오. 어떤 식민지가 접시에 성장하는 경우 그것은 각각의 병이 멸균되지 않았으며 실험에 사용되어서는 안된다는 것을 나타냅니다.
- 멸균 병을 저장하기 전에 남은 PBS를 모두 제거하고 병이 생물 안전 캐비닛에서 철저히 건조되도록 하십시오. 멸균 병을 멸균 플라스틱 용기에 보관하십시오 (일반적으로 병을 표백하는 데 사용되는 용기)를 사용할 때까지 보관하십시오.
- 미생물 접종을 준비하고 세균이없는 양배추를 살포
주의: 모든 단계는 실험실 벤치에서 수행될 경우 작업 표면을 오염하거나 건강 상의 위험을 초래할 수 있는 미생물 용액을 에어로졸화하기 때문에 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
참고 : 양배추는 5 일 후에 진정한 잎을 형성하므로 양배추를 심은 후 미생물 솔루션으로 접종하기 전에 1 주일 정도 기다리는 것이 좋습니다. 튜브가 밀봉되어 있기 때문에 양배추에 물을 넣을 필요가 없습니다. 작은 튜브가 양배추의 성장을 제한하기 때문에 실험은 심기 한 달 이내에 가장 잘 수행됩니다.- 얼음에 글리세롤 주식을 해동하고 원하는 접종 농도로 1x PBS로 희석한다(2.1.4단계에서 1mL 알리쿼트해빙 및 도금에 의해 결정된 농도).
참고: 다양한 다른 접종 수준을 사용할 수 있지만, 필로스피어 분리는 10일 안에8 양배추 슬러리의 104~108CFUs/mL까지 성장할 수 있다.4 - 멸균 펌프 병에 희석 된 글리세롤 스톡 10mL를 추가하고 병 펌프 구성 요소에서 잔류 PBS를 제거하기 위해 대형 폐기물 수거 비커에 5 스프레이를 펌프합니다.
- 양배추 튜브에서 뚜껑을 제거하고 양배추를 스프레이 병쪽으로 기울이고 각 양배추에 접종 용액 3 펌프로 스프레이하여 접종 용액의 ~600 μL을 제공합니다.
- 접종 후, 양배추의 하위 집합을 수확하여 실제 입력 접종 농도를 평가합니다. 살균 된 집게로 튜브에서 양배추를 제거합니다. 멸균 해부 가위로 뿌리를 잘라낸 다음 양배추를 미리 계량한 멸균 1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브에 조심스럽게 놓습니다. 계산에 필요한 경우 추후 계산을 위해 양배추의 무게를 기록합니다.
- 양배추를 함유한 각 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 1x PBS 400 μL을 추가하고 멸균 마이크로페슬을 사용하여 양배추를 1x PBS로 균질화하여 30배 분쇄합니다.
- 양배추 균모게네이트를 희석 (필요한 경우) 유봉 양배추 혼합물을 접시. 그것은 두껍고 식물 조직 조각의 전체 될 것이기 때문에 양배추 슬러리를 파이프에 대한 넓은 오리피스 팁을 사용합니다.
- 얼음에 글리세롤 주식을 해동하고 원하는 접종 농도로 1x PBS로 희석한다(2.1.4단계에서 1mL 알리쿼트해빙 및 도금에 의해 결정된 농도).
3. 멸균 야채 추출물 준비
참고 :이 방법은 양배추 멸균 미디어 생산18,,19의수정 된 버전입니다.
- 슈퍼마켓에서 양배추를 구입합니다. 실험실에서 양배추의 가장 바깥쪽 잎을 제거하고 폐기합니다. 남은 양배추를 모두 믹서기에 넣고 양배추를 미세 한 펄프에 균질화하는 것, 즉 양배추는 더 잘 블렌딩되지 않습니다.
참고: 양배추를 매끄러운 균일 한 펄프로 잘라 낼 수있는 모든 블렌더는이 방법에 적합해야합니다. - 혼합 양배추 균형의 무게를 측정하고 양배추 그램 당 증류수 2mL를 추가합니다. 혼합 양배추 슬러리를 바구니 커피 필터 2층(표백되지 않은 종이)을 통해 필터링합니다.
- 양배추 슬러리를 원심분리관으로 분배합니다(크기는 원심분리기에 의존). 큰 입자가 용액에서 정착 할 때까지 20 분 동안 20,000 x g에서 여과 된 양배추 슬러리를 원심 분리합니다.
참고: 양배추 입자가 필터 멸균기를 빠르게 막히기 때문에 양배추 슬러리를 장기간 원심분리하는 것이 필수적입니다. - 세로지학적 파이펫을 사용하여 펠릿 양배추를 방해하지 않도록 주의하여 펠릿 양배추 파편에서 상퍼를 제거하십시오. 표준 염 농도가 사용되는 발효 조건을 재현하는 것을 목표로하는 경우 이 단계에서 NaCl을 2% 추가합니다(즉, 필터 살균 전).
- 필터는 진공에 부착된 0.2 μm 필터(500mL 또는 1L)를 사용하여 야채 추출물을 살균합니다. 멸균 튜브 (50 mL 원심 분리관 또는 15 mL 원심분리관)에 분배하고 사용할 때까지 -80 °C에서 동결하십시오.
4. 멸균 식물성 추출물 접종
- SVE를 해동하고 490 μL을 1.5mL 마이크로센트심리분리기 튜브로 분배합니다. 각 타임포인트 측정이 파괴적이기 때문에 시간당 처리당 최소 5개의 복제를 할 수 있는 충분한 튜브를 사용합니다.
- 미생물의 글리세롤 스톡을 얼음에 분리하고 원하는 농도로 1x PBS로 희석합니다. 유산균의 농도는 SVE의 mL 당 5,000 CFU만큼 낮을 수 있습니다. 이러한 농도를 달성하기 위해 10 μL이 총 부피 500 μL을 접종하는 데 사용되기 때문에 250 CFU/μL으로 주식을 희석합니다.
- 희석 된 미생물 분리의 10 μL로 SVE를 접종합니다. 파이펫을 몇 번 위아래로 위아래로 섞어 철저히 섞습니다. 원하는 온도에서 배양 (김치 생산 온도 14 ° C 또는 따뜻한 소금에 절인 양배추 발효를위한 24 °C).
- 1일, 2일, 4일, 7일, 14일째에 복제튜브를 수확하여 SVE에서 미생물 분리의 증가율을 측정합니다.
참고: 발효는 처음에는 빠르게 진행되며 시간이 지남에 따라 느려집니다. 따라서 초기 타임포인트를 더 사용하면 발효가 진행되는 방식의 역학에 대한 해상도가 더 큽합니다. - 각 시점에서 접종된 SVE를 몇 번 위아래로 피펫하여 잘 섞습니다. 접종된 SVE를 1x PBS로 일렬로 희석하고 접시를 한천 판에 희석시합니다. 식민지를 계산하기 전에 4-7 일 동안 한천 판을 배양하십시오.
참고: 남자, 로고사, 샤프(MRS) 한천은 모든 젖산 박테리아를 포제화하는 데 사용해야 하며, 효모 펩톤 덱스트로스(YPD)는 효모에 사용해야 하며, 대부분의 다른 박테리아가 필로스피어로부터 분리되는 TS 천을 사용해야 합니다. - 마이크로 pH 프로브를 사용하여 각 시정점에서 샘플의 pH를 기록합니다.
참고: pH 프로브가 튜브/치료 사이에 세포를 전송하기 때문에 이 단계는 도금 후에 수행되어야 합니다.
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Representative Results
나파 양배추의 성장 속도
종자 살균 방법은 여러 가지 다른 나파 양배추(B. 라파 var pekinese;; 보충 도 1) 여러 다른 공급 업체에서 모두 비슷한 성장률로 꾸준히 성장했습니다. 그러나, 브라시카의 다른 종으로 방법을 테스트(B. 라파: 순무 보라색 상단; B. 올레라세아: 카이로 하이브리드, 트로픽 자이언트 하이브리드; B. 캠프트리스: 박최토이 초이 하이브리드; B. juncea: 겨자 레드 자이언트) 제한 된 성공을 준(보충 그림 2). 유리 튜브에 맞는 컴팩트한 깔끔한 로즈트를 형성하는 나파 양배추와는 달리, 이 Brassica spp. 살균 후 낮은 발아율을 가지고 있거나 줄기가 빠르게 길어져 가시적이고 건강에 해로운 식물을 만듭니다. 또한, 오래된 씨앗(>1 세)을 살균하는 것은 종자 털이 건조되어 살균 과정에서 제거하기가 더 어려워지므로 권장되지 않습니다. 정기적으로 새로운 씨앗을 구입하고 실험을 수행하기 전에 그들이 멸균 여부를 결정하기 위해 양배추의 하위 집합을 테스트합니다.
나파 양배추 필로스피어에서 미생물 접종의 성장
미생물분리(표 1)는단일 균주 분리또는 다른 분리와 함께 접종하여 나파 양배추 필로피어에서 쌍방향으로 상호 작용을 하였다. 각 처리마다 총 15개의 세균이 없는 양배추를 접종하고 5개의 양배추가 접종 직후 수확되었고, 5개는 접종 후 4일 후에 수확되었고, 나머지는 접종 후 10일 후에 수확되었다. 결과는 필로스피어 분리가 나파 양배추 필로스피어(그림 2)에서급속한 성장을 할 수 있음을 보여줍니다.
멸균 식물성 추출물의 미생물 이뇨제 의 성장
효모2개(카자크스타니아 바넷니와 피치아 메브라니파시엔)및 3개의 박테리아(유산균코렌시스, 페디오코커스 파르불루스, 류코노쇼크 메센테로이드)는빨강, 녹색, 나파 양배추로 만든 세 가지 종류의 SVE로 접종되었다. 모든 시료는 24°C에서 배양되었고 14일 동안 접종된 접종의 성장은 각 처리의 5 μL을 MRS 또는 YPD 화기 플레이트(n= 5)에 반점 도금하여 기록하였다. 결과는 그림 3A에표시됩니다. 각 시료의 pH는발효(도3B)에걸쳐 기록되었으며, 유산균이 PH 4 이하수준으로 SVE를 산화할 수 있었다는 것을 보여준다(소비에 안전한 발효를 나타낸다).
그림 1: 세균이 없는 양배추 설정의 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세균이 없는 나파 양배추에 다른 박테리아의 성장 속도. (a)필로스피어내 단일 접종의 성장. (B)두 개의 미생물을 필로스피어로 접종한 후 성장. 미생물의 성장은 TSA 또는 MRS 미디어에 도금 양배추 균주네이트의 g 당 계산 식민지 형성 단위로 측정되었다. n = 5. 오류 막대 = 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유산균과 효모의 성장은 빨강, 녹색 및 나파 양배추로 만든 멸균 야채 추출물 (SVE)에서 증가합니다. (a)미생물 이성제의 성장은 SVE 도금의 mL 당 콜로니 형성 단위를 계산하여 측정하였다. 효모는 YPD 천 접시에 도금되었고 박테리아는 MRS 한천 접시에 도금되었습니다. (b)미생물이 성장함에 따라 멸균 식물성 추출물의 산성화는 pH에 속하는 것으로 나타났다. n = 5. 오류 막대 = 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미생물 접종의 필라/제네라 | 미생물의 근원 |
| Firmicutes 바실루스 | 필로스피어 |
| Firmicutes 유산균 | 발효 |
| 프로테오박테리아 아크로모박터 | 필로스피어 |
| 프로테오박테리아 리조비움 | 필로스피어 |
| 프로테오박테리아 스핑크고모나스 | 필로스피어 |
표 1: 세균이 없는 나파 양배추에 접종된 미생물 분리.
보충 도 1: 브라시카 라파 바르 페키넨시스의 성장: 생식없는 조건에서 빌코. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 세균이없는 조건에서 성장하는 다른 양배추 품종. (A) B. 라파: 순무 퍼플 탑,(B) B. 올레라세아: 카이로 하이브리드,(C) B. 올레라세아: 트로피크 자이언트 하이브리드,(D) B. 캠프트리스: 박최토이 초이 하이브리드,(E) B. 준시아: 겨자 레드 자이언트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세균이 없는 나파 양배추 식물은 나파 양배추 필로스피어17에서유산균의 분산 한계를 연구하는 데 사용되어 왔다. 세균이 없는 나파 양배추는 또한 필로스피어에서 개인 또는 쌍 현명한 성장을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다(그림 1). 멸균 야채 추출물을 만드는 방법은 양배추의 세 가지 다른 종류에 대한 테스트되었습니다 : 빨간색, 녹색과 나파. 이러한 각 SV는 신뢰할 수 있는 성장 매체역할을 합니다. 접종된 미생물은 다른 매체를 통해 일관되게 증가합니다. SVE(그림2)의단일 균주 증가율은 LAB이 급속히 성장하고발효(17)에서예상되는 것과 동일한 방식으로 미디어를 산성화한다는 것을 보여준다.
세균이 없는 식물및 멸균 식물 추출물은 펠로스피어 또는 발효 내의 우선 효과 및 승계와 같은 다양한 생태학적 문제를 해결하기 위해 조합하여 사용될 수 있다. 미생물의 합성 커뮤니티는 질화 양배추를 도금하여 식물성 분리제를 얻거나, 또는 젖산박테리아(16)를얻기 위해 소금에 절인 양배추를 생성하기 쉽습니다. 더 많은 커뮤니티 구성원과의 쌍별 상호 작용 또는 탈퇴 실험은 지역 사회 구성원의 중요성이나 기능을 평가하기 위해 필로스피어 또는 SVE에서 수행 될 수 있습니다. 환경 선택 연구는 채소 발효의 영향을 평가할 수 있는 SVE에서 수행될 수 있다. 또한 세균이 없는 양배추와 SVE를 사용하여 실험적 진화를 사용하여 미생물 종과 지역 사회의 다양화를 정량화할 가능성도 있습니다.
이 세균이 없는 양배추 시스템의 제한은 실험의 짧은 기간입니다. 사용되는 작은 유리 튜브 때문에 잎이 튜브의 가장자리에 국한되어 있기 때문에 양배추는 한 달 이상 동안 자랄 수 없습니다. 식물 조직 배양 상자(재료의 표)와같은 더 큰 재배 용기는 사용될 수 있지만, 이들은 여전히 전체 크기의 양배추 식물을 생산하지 않습니다. 우리는 또한 MS 국물을 포함하는 0.75% 한천에서 양배추를 성장시키려 고 시도했습니다, 그러나 이것은 양배추 묘목의 일관되지 않은 성장을 생성한다는 것을 것을을 발견했습니다. 석회화점점과 충분한 MS 국물을 함유한 성장하는 기판으로 사용하지만 점토 곡물은 홍수가 되지 않는 건강한 양배추를 재배하는 최적의 방법입니다.
세균이 없는 양배추의 성공적인 성장을 보장하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. MS 국물을 첨가할 때 석회화점이 완전히 건조하도록 하면 점토가 오토클레이브 주기 동안 MS 국물을 완전히 흡수할 수 있습니다. 그러나 점토 의 수준에 MS 국물이있는 경우 씨앗을 추가하기 전에 제거해야합니다. 그들은 MS 국물에 앉아있는 경우 씨앗은 발아하지 않습니다. 모니터링하는 또 다른 중요한 단계는 종자 살균입니다. 오래된 씨앗 (>1 세)은 어린 씨앗만큼 빨리 또는 안정적으로 발아하지 않습니다. 튜브를 살균하거나 과충전하는 데 사용되는 튜브의 크기를 변경하면 멸균에도 영향을 미칠 수 있습니다. 살균 단계는 또한 씨앗이 급속하게 발아되도록 종자 코트를 부드럽게 하고 제거하는 데 도움이됩니다. 여기에 미생물 배양과 함께 사용 후 펌프 스프레이 병을 재사용하는 것은 펌프 성분에서 생물막을 제거하기 어렵기 때문에 권장되지 않습니다. 특히 바실러스 종은 오토클레이브에 특히 탄력적이기 때문에 주의를 기울여야 합니다. 바실러스 스프와 접촉한 펌프 병은 재사용되지 않습니다.
멸균 식물성 추출물은 발효 용기에 존재하는 공간 구조화를 가지고 있지 않지만, LAB의 성장 역학은 발효 14 일 동안 pH의 급격한 하락과 유산균의 성장 증가와 함께 발효 진행을 모방하는 것을 시사합니다. 류코노스토크 메센테로이드는 발효 초기에 중요하며 유산균과 페디오코커스 스PP보다 더 빠르게 풍부하게 증가했으며, 다른 소금에 절인 양배추 승계 조사에서 볼 수 있는추세는 20,,21이다. 실험실에서의 작업은 또한 96 개의 웰 플레이트로 분배 된 SVE의 LAB의 성장을 측정하기 위한 광학 밀도 (OD) 판독값을 얻기 위해 분광계를 사용하여 탐구했습니다. 나파 양배추 추출물로 인한 초기 결과는 유망한 것으로 보였지만, pH가 떨어지면서 붉은 양배추 추출물로 만든 SVE는 색을 바꾸어 악취 판독값을 혼동했습니다. 또한 OD 판독값을 사용하여 성장을 확대하면 이 시스템의 사용을 단일 변형 접종으로 제한합니다. 함께, 이러한 제한은 미생물 성장을 측정하기 위해 OD 판독값을 사용하여 포기하는 우리를 이끌었다.
필로스피어에서 생태학적 상호 작용을 테스트하는 것은 소류권이 작물 식물의 건강과생산성(22)에영향을 미친다는 증거가 있기 때문에 국소적이다. 우리의 모델 시스템은 나파 양배추와 함께 작동하도록 개발되었지만, 필라 프로테오박테리아, Firmicutes 및 Actinobacteria의 박테리아는 많은 식물 종의 필로스피어에서 흔히 볼 수 있습니다13,,23. 양배추의 세 가지 다른 종류가 테스트되었지만, SVE는 다른 중요한 농업 식물로 만들 수 있습니다. 예를 들어, 당근 주스 발효24 또는 옥수수 뿌리25의 미생물 식민지 동안 미생물 공동체 어셈블리를 조사하는 연구는 이 논문에 설명된 프로토콜을 사용하여 복제될 수 있다.
세균이 없는 양배추를 SVE와 결합하여 발효 지역 사회 집회를 연구하면 필로스피어 미생물군유전체의 변화가 발효의 성공에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 를 보여줄 수 있습니다. 발효의 부패 또는 충분히 낮은 pH에 도달하지 못하면 급속한 초기 산성화가 없을 경우 발생할 수있습니다(26). 이러한 버릇없는 발효는 제조 공정 때문일 수 있지만, 필로스피어 미생물군유전체의 변화는 또한 식물성발효(17)의성공에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 상기 설명된 시스템은 어떤 미생물군유전체 조립 공정이 식물성 발효의 성공에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하는 유용한 모델이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 USDA-NIFA 보조금에 의해 지원되었다: 2017-67013-26520. 트레이시 데벤포트와 클레어 포건은 기술 지원을 제공했고 루비 예와 케이시 코세타는 이 원고의 초기 버전에 대한 유용한 의견을 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
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