Summary
Se ha desarrollado un método para cultivar coles Napa libres de gérmenes que permite a los investigadores evaluar cómo interactúan las especies microbianas individuales o las comunidades microbianas multiespecie en las superficies de las hojas de repollo. También se presenta un extracto vegetal estéril que se puede utilizar para medir los cambios en la composición de la comunidad durante la fermentación vegetal.
Abstract
La filosfera, la parte sobre el suelo de la planta que puede ser colonizada por microbios, es un sistema modelo útil para identificar procesos de ensamblaje comunitario microbiano. Este protocolo describe un sistema para estudiar la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera de las plantas de repollo de Napa. Describe cómo cultivar plantas libres de gérmenes en tubos de ensayo con un sustrato de arcilla calcinada y caldo de nutrientes. La inoculación de plantas libres de gérmenes con cultivos microbianos específicos ofrece oportunidades para medir el crecimiento microbiano y la dinámica comunitaria en la filosfera. A través del uso de extracto vegetal estéril producido a partir de coles cambios en las comunidades microbianas que se producen durante la fermentación también se puede evaluar. Este sistema es relativamente simple y barato de configurar en el laboratorio y se puede utilizar para abordar cuestiones ecológicas clave en el ensamblaje de la comunidad microbiana. También ofrece oportunidades para entender cómo la composición de la comunidad filosfera puede afectar la diversidad microbiana y la calidad de las fermentaciones vegetales. Este enfoque para el desarrollo de comunidades filosfera de repollo gnotobiótico podría aplicarse a otras especies de plantas silvestres y agrícolas.
Introduction
La diversidad microbiana de la filosfera juega un papel importante en el mantenimiento de la salud de la planta y también puede influir en la capacidad de las plantas para soportar el estrés ambiental1,2,3,4,5. A su vez, la salud de los cultivos afecta directamente a la inocuidad y calidad de los alimentos6,,7. Las plantas desempeñan un papel en el funcionamiento del ecosistema y sus microbiomas asociados afectan a la capacidad de las plantas para llevar a cabo estas actividades, así como influyen directamente en el entorno en sí8. Mientras que los científicos han comenzado a descifrar la función y composición de la filosfera, los procesos ecológicos que influyen en la asamblea comunitaria microbiana filosfera no se entienden completamente9,,10. El microbioma filosfera es un excelente sistema experimental para estudiar la ecología de los microbiomas11. Estas comunidades son relativamente simples y muchos de los miembros de la comunidad se pueden cultivar en los medios de laboratorio estándar10,,12,,13.
Las hortalizas fermentadas son un sistema en el que la estructura comunitaria de la filosfera tiene importantes consecuencias. Tanto en el chucrut como en el kimchi, los microbios que se producen naturalmente en las hojas vegetales (la filosfera de las especies de Brassica) sirve como el inóculo para la fermentación14,15. Las bacterias del ácido láctico (LAB) se consideran miembros ubicuos de los microbiomas vegetales, sin embargo pueden estar en baja abundancia en la filosfera16. Una fuerte selección abiótica durante la fermentación impulsa un cambio en la composición de la comunidad microbiana que permite que las bacterias del ácido láctico aumenten en abundancia. A medida que LAB crece, producen ácido láctico que crea el ambiente ácido de los productos vegetales fermentados17. El vínculo entre la filosfera y el fermento proporciona la oportunidad de utilizar las verduras como modelo para entender cómo se estructuran los microbiomas.
Hemos desarrollado métodos para cultivar coles Napa libres de gérmenes y para inocularlas con comunidades microbianas específicas utilizando botellas de aerosol. Este es un método barato y confiable de inocular uniformemente el repollo con microbios individuales o comunidades mixtas. También se ha desarrollado un extracto vegetal estéril (SVE) a partir de tres tipos/variedades diferentes de col: repollo rojo y verde (Brassica oleracea) y repollo Napa (B. rapa). La adición de sal a estas SVEs replica el entorno de fermentación y permite estudios experimentales a pequeña escala y relativamente de alto rendimiento del ensamblaje del microbioma de fermentación. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar el ensamblaje de la comunidad microbiana en la filosfera y cómo la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera puede estar relacionada con el éxito de la fermentación vegetal.
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Protocol
1. Cultivo de coles libres de gérmenes
- Equipos de preparación para el cultivo de coles libres de gérmenes
- Limpieza de la arcilla calcinada para eliminar las partículas de polvo fino
- Enjuagar arcilla calcinada (Tabla de Materiales) al menos 3x con agua del grifo; drenar el agua.
ADVERTENCIA: La arcilla calcinada produce polvo muy fino y se recomienda llevar una máscara protectora(Tabla de materiales)al lavar. - Esparce la arcilla calcinada como una capa delgada (4 cm) en una bandeja de autoclave y autoclave en un ciclo seco (121 oC de calentamiento durante 20 minutos y 20 minutos de tiempo de secado) para esterilizar.
- Deje que la arcilla calcinada se seque completamente antes de su uso esparciendo en bandejas y colocándola en una incubadora caliente (30-37 oC) durante al menos una semana. Revuelve para mezclar cada 3 días para secar completamente la arcilla calcinada para que absorba una cantidad uniforme de caldo de nutrientes Murashige y Skoog (MS) (sección 1.2).
NOTA: El secado también ayuda a mantener el volumen de arcilla calcinada incluso cuando se pesa en tubos. El secado por otros medios, como un horno de secado, también sería adecuado.
- Enjuagar arcilla calcinada (Tabla de Materiales) al menos 3x con agua del grifo; drenar el agua.
- Limpieza de la cristalería para el cultivo de coles libres de gérmenes
- Limpie y esterilice a fondo los tubos de vidrio(Tabla de materiales)entre cada uso. Remoje los tubos durante 30 minutos en solución de lejía al 30% y enjuague bien con agua del grifo antes de limpiarlos en un lavado ácido en un entorno bacteriológico. Tapas de tubo de ensayo bidireccionales de lavado ácido (Tabla de materiales) entre usos.
- Semillas de repollo esterilizantes de superficie
- Coloque hasta 100 semillas de repollo Napa (B. rapa var pekinensis) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: La adición de más de 100 semillas a un tubo de microcentrífuga o el cambio del tamaño del tubo puede afectar las tasas de germinación de las semillas debido a la falta de eliminación de la capa de semillas. - Añadir 1 ml de etanol al 70% a las semillas y vórtice durante 5 min. Deseche el etanol con una pipeta.
- Añadir 1 ml de lejía y vórtice al 50% durante 5 min. Deseche la solución de lejía con una pipeta.
- Añadir 1 ml de agua desionizada autoclavizada y vórtice durante 5 min. Deseche el agua desionizada con una pipeta.
- Repita el paso 1.1.3.4 3x para enjuagar toda la lejía. Remoje las semillas en agua estéril desionizada durante 2-8 h antes de la siembra para suavizar la capa de semillas.
- Coloque hasta 100 semillas de repollo Napa (B. rapa var pekinensis) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Limpieza de la arcilla calcinada para eliminar las partículas de polvo fino
- Crecimiento de coles libres de gérmenes
NOTA: Las coles Napa (B. rapa var pekinensis) se cultivan en tubos de vidrio (15 cm x 2,5 cm) que contienen arcilla calcinada empapada en caldo de nutrientes Murashige y Skoog (MS) (Figura 1).- Pesar 10 g de arcilla calcinada limpia en un tubo de vidrio limpio (15 cm x 2,5 cm).
- Preparar el caldo de nutrientes MS disolviendo 4,4 g de medio de LA MS en 1 L de agua desionizada. Agregue el caldo de nutrientes MS (9 ml) a cada tubo de vidrio para cubrir la arcilla calcinada utilizando una pipeta.
NOTA: El líquido de pie en el tubo evitará que la semilla germine por lo que podría ser necesario añadir un poco menos de caldo de MS a algunos tubos. - Tapar con holgura los tubos de vidrio con tapas de tubo de ensayo bidireccionales de 22 mm y autoclave (121oC durante 60 min). Cuando los retire del autoclave, empuje las tapas sobre los tubos de vidrio para sellarlos. Enfríe los tubos a temperatura ambiente antes de su uso.
- Coloque suavemente una semilla de repollo estéril en el centro de cada tubo utilizando fórceps estériles y extralargos (25,4 cm). Coloque los tubos en una bandeja de 7 vías y colóquelos debajo de los bastidores de luz (bombillas fluorescentes T5 de espectro completo u otra configuración de iluminación para el crecimiento de la planta) con un ciclo de luz de 16 horas a 24 oC.
NOTA: Las semillas germinan durante la noche y desarrollan su primera hoja verdadera después de 5 días. Una verdadera hoja es la primera hoja vascular después de que se hayan formado los cotiledones. Tiene un borde más arrugado y en Brassica rapa está cubierto de tricomas.
- Pruebas de esterilidad de coles libres de gérmenes
NOTA: Para comprobar si las coles no tienen germen, seleccione algunas coles (5-10) de cada lote y placa para determinar si hay colonias culturables.- Retire suavemente el repollo de los tubos de vidrio agarrando la base de la planta con fórceps esterilizados y sacándolo. Antes de retirar el repollo completamente del tubo, cortar cuidadosamente las raíces utilizando tijeras de disección esterilizadas. Compactar las hojas de repollo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Las coles más grandes pueden requerir la extracción de una o dos de las hojas más grandes mientras el repollo todavía está en el tubo para facilitar la obtención del repollo en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Estas hojas más grandes se pueden añadir al tubo de 1,5 ml después de que el resto del repollo se ha colocado en el tubo si se requiere todo el repollo. - Añadir 400 l de 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Usando una micropesta estéril, homogeneizar el repollo en plagas 30x.
- Placa 100 l de la col homogeneiza en las placas de agar para determinar si hay algún contaminante presente en la muestra. La mayoría de las bacterias que se encuentran en la filosfera crecerán en placas de agar de soja tríptica (TS). Utilice puntas anchas de pipeta de orificio al enchapar homogeneizar repollo, ya que el homogeneario de repollo es grueso y puede obstruir las puntas regulares de las pipetas.
- Retire suavemente el repollo de los tubos de vidrio agarrando la base de la planta con fórceps esterilizados y sacándolo. Antes de retirar el repollo completamente del tubo, cortar cuidadosamente las raíces utilizando tijeras de disección esterilizadas. Compactar las hojas de repollo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Inoculación de la filosfera con soluciones microbianas
- Hacer reservas de glicerol de cepas de inoculación
NOTA: La Tabla 1 enumera los aislados microbianos que se pueden utilizar en este paso. Otros aislados de filosfera también podrían ser utilizados aquí.- Densamente rayar colonias individuales de una nueva racha, en dos/tres nuevas placas de los mismos medios para obtener muchas colonias.
- Deje que las rayas crezcan durante 2 a 5 días y luego raspe las colonias de todas las placas en un tubo cónico de 15 ml que contenga 15 ml de 15% de glicerol, y vórtice para mezclar a fondo.
- Transfiera una alícuota de 1 ml del caldo de glicerol bien mezclado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y almacene las existencias de glicerol a -80 oC hasta su uso. Ahorre los 14 ml restantes de stock de glicerol a -80 oC, ya que se requieren volúmenes relativamente grandes de solución de inoculación al inocular coles.
- Una semana antes de usar, descongelar el tubo de 1,5 ml que contiene 1 ml de población de glicerol (del paso 2.1.3) sobre hielo, diluir y placa en varias diluciones diferentes (por ejemplo, 10-4, 10-5y 10-6) para determinar la concentración (unidad formadora de colonias [CFU] por L) de los 14 ml de solución de inoculación.
- Botellas de inoculación esterilizantes
- Desmontar las botellas redondas de ámbar de la bomba Boston (59 ml) y remojar todos los componentes (bomba, tubo, tapa y botella) en una solución de lejía al 30% durante 30 minutos en un recipiente de plástico grande con una tapa herméticamente ajustada.
- Después de remojar, vierta cuidadosamente toda la lejía del recipiente levantando sólo una esquina de la tapa del recipiente.
- Enjuague las botellas llenando el recipiente de plástico con agua desionizada autoclave (1 L dependiendo del tamaño del recipiente) y vierta cuidadosamente el agua desionizada, levantando de nuevo la tapa en una esquina.
- Esterilice un gabinete de bioseguridad rociando con una solución de etanol al 70% y encendiendo la luz UV durante 30 minutos.
NOTA: Continúe este trabajo en el gabinete de bioseguridad para que no haya riesgo de contaminación microbiana de las botellas mientras se secan al aire. - Retire las botellas del recipiente de plástico grande y llene cada botella con agua desionizada autoclavizada con una pipeta. Vuelva a montar las bombas y coloque una en cada botella. Bombee el agua desionizada a través de cada botella (10 pulverizaciones por botella) para eliminar la lejía del componente de la bomba de la botella.
- Repita el paso 2.2.5 para asegurarse de que se retira toda la lejía de las botellas de vidrio.
- Pruebe si las botellas son estériles colocando un número en cada botella (pegando cinta de laboratorio al lado de la botella cuando está completamente seca) luego agregue 10 ml de 1x PBS a cada una de las botellas y bombee 3 aerosoles en una placa de agar TS. Después de la pulverización, incubar las placas durante una semana a temperatura ambiente. Si alguna colonia crece en un plato indica que la botella respectiva no era estéril y no debe utilizarse para experimentos.
- Antes de almacenar las botellas estériles, retire todo el PBS restante y deje que las botellas se sequen a fondo en el gabinete de bioseguridad. Almacene las botellas estériles en un recipiente de plástico estéril (normalmente el recipiente utilizado para blanquear las botellas) hasta su uso.
- Preparación del inóculo microbiano y pulverización de coles libres de gérmenes
ADVERTENCIA: Todos los pasos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad, ya que la pulverización se pulveriza las soluciones microbianas que podrían contaminar las superficies de trabajo o suponer un riesgo para la salud si se llevan a cabo en un banco de laboratorio.
NOTA: Los repollos formarán hojas verdaderas después de 5 días, por lo que es aconsejable esperar una semana después de plantar el repollo antes de inocular con cualquier solución microbiana. Como los tubos están sellados, no hay necesidad de regar las coles. Los experimentos se realizan mejor dentro de un mes de la plantación, ya que los pequeños tubos restringen el crecimiento del repollo.- Descongelar las existencias de glicerol sobre hielo y diluir en 1x PBS a la concentración de inoculación deseada (concentración determinada por descongelación y enchapado de una alícuota de 1 ml en el paso 2.1.4).
NOTA: Se puede utilizar una variedad de diferentes niveles de inoculación, pero los aislados de filosfera pueden crecer de 104 a 108 UFC/ml de lodos de repollo en 10 días. - Agregue 10 ml de caldo de glicerol diluido a la botella de bomba estéril y bombee 5 aspersiones en un vaso de precipitados de recolección de residuos grande para eliminar cualquier PBS residual del componente de la bomba de botella.
- Retire la tapa del tubo de repollo, incline el repollo hacia la botella de pulverización y rocíe cada repollo con 3 bombas de la solución de inoculación, que proporciona 600 ml de inóculo.
- Después de la inoculación, cosechar un subconjunto de las coles para evaluar la concentración real de inoculación de insumos. Retire el repollo de un tubo con fórceps esterilizados. Corte las raíces con tijeras de disección estériles y luego coloque cuidadosamente el repollo en un tubo de microcentrífuga estéril prepesado de 1,5 ml. Registre el peso del repollo para los cálculos futuros si se requiereN UFC/g de repollo para los cálculos.
- Añadir 400 l de 1x PBS a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga repollo y utilizar una micropesta estéril para homogeneizar el repollo en el 1x PBS moliéndolo 30x.
- Diluir el homogeneizado de repollo (si es necesario) y la placa fuera de la mezcla de repollo plagado. Utilice puntas de orificio anchas para pipetear la lodo de repollo, ya que será gruesa y llena de trozos de tejido vegetal.
- Descongelar las existencias de glicerol sobre hielo y diluir en 1x PBS a la concentración de inoculación deseada (concentración determinada por descongelación y enchapado de una alícuota de 1 ml en el paso 2.1.4).
3. Preparación de extracto vegetal estéril
NOTA: Este método es una versión modificada de la producción de medios estériles de repollo18,19.
- Compra un repollo en un supermercado. En el laboratorio, retire y deseche las hojas más externas del repollo. Cortar todo el repollo restante para encajar en una licuadora y homogeneizar el repollo a una pulpa fina, es decir, el repollo no conseguirá más fino con la mezcla adicional.
NOTA: Cualquier licuadora que pueda cortar el repollo a una pulpa homogénea lisa debe ser adecuada para este método. - Pesar el homogeneario de repollo mezclado y añadir 2 ml de agua destilada por gramo de repollo. Filtrar la suspensión de repollo mezclado a través de 2 capas de filtros de café de cesta (papel sin blanquear).
- Dispensar la loda de repollo en tubos centrífugos (el tamaño depende de la centrífuga). Centrifugar la lechada de repollo filtrada a 20.000 x g durante 20 min hasta que las partículas grandes se asienten fuera de la solución.
NOTA: Es esencial centrifugar la lechada de repollo durante un largo período de tiempo, ya que las partículas de repollo obstruyen rápidamente el esterilizador del filtro. - Con una pipeta serológica, retire el sobrenadante de los restos de repollo peletados teniendo cuidado de no perturbar el repollo peletista. Si tiene como objetivo recrear las condiciones de fermentación en las que se utilizan concentraciones de sal estándar, añada un 2% de NaCl en este paso (es decir, antes de la esterilización del filtro).
- Filtrar el extracto vegetal utilizando un filtro de 0,2 m (500 ml o 1 L) unido a un vacío. Dispensar en tubos estériles (ya sea tubos centrífugos de 50 ml o tubos centrífugos de 15 ml) y congelar a -80 oC hasta su uso.
4. Inoculación de extracto vegetal estéril
- Descongelar SVE y dispensar 490 l en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilice tubos suficientes para tener al menos cinco réplicas por tratamiento por punto de tiempo, ya que cada medición del punto de tiempo es destructiva.
- Descongelar las reservas de glicerol de aislados microbianos en hielo y diluir con 1x PBS a la concentración deseada. La concentración de bacterias del ácido láctico puede ser tan baja como 5.000 UFC por ml de SVE. Para lograr esta concentración, diluir las poblaciones a 250 UFC/L, ya que se utilizarán 10 l para la inoculación de un volumen total de 500 l.
- Inocular SVE con 10 ml de aislado microbiano diluido. Pipetear hacia arriba y hacia abajo un par de veces para mezclar a fondo. Incubar a la temperatura deseada (14oC para la temperatura de producción de kimchi o 24oC para fermentación más cálida del chucrut).
- Mida la tasa de crecimiento del aislado microbiano en el SVE mediante la cosecha de tubos replicados en el día 1, día 2, día 4, día 7 y día 14.
NOTA: La fermentación se realiza rápidamente desde el principio y se ralentiza con el tiempo. Por lo tanto, tener más puntos de tiempo iniciales da una mayor resolución a la dinámica de cómo procede la fermentación. - En cada punto de tiempo, mezcle el pozo SVE inoculado pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces. Diluir en serie el SVE inoculado en 1x PBS y la placa en placas de agar. Incubar las placas de agar durante 4-7 días antes de contar las colonias.
NOTA: El agar hombre, rogosa y Sharpe (MRS) debe utilizarse para enumerar todas las bacterias del ácido láctico, la dextrosa de la peptona de levadura (YPD) debe utilizarse para la levadura y el agar TS para la mayoría de los aislados de bacterias de la filosfera. - Registre el pH de las muestras en cada punto de tiempo utilizando una sonda de micro pH.
NOTA: Este paso debe llevarse a cabo después del chapado porque la sonda de pH transferirá las células entre tubos/tratamientos.
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Representative Results
Tasas de crecimiento de las coles Napa
El método de esterilización de semillas fue probado con varias coles Napa diferentes (B. rapa var pekinese; Figura suplementaria 1) de un número de diferentes proveedores y todos crecieron consistentemente con tasas de crecimiento similares. Sin embargo, probando los métodos con diferentes especies de Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. juncea: Mustard Red Giant) dio un éxito limitado(Figura Suplementaria 2). A diferencia del repollo Napa que forma rosetas limpias compactas que caben en los tubos de vidrio, estos Brassica spp. tenían bajas tasas de germinación después de la esterilización o el tallo alargado rápidamente para hacer una planta espinosa e insalubre. Además, no se recomienda esterilizar semillas más viejas (>1 año de edad) ya que las capas de semillas se secan, lo que dificulta su eliminación durante el proceso de esterilización. Compra regularmente nuevas semillas y prueba un subconjunto de coles para determinar si son estériles antes de llevar a cabo experimentos.
Crecimiento de inoculantes microbianos en la filosfera de repollo de Napa
Los aislados microbianos (Tabla 1) se inocularon como aislados de una sola cepa o en combinación con otro aislado para buscar interacciones en pareja en la filosfera de repollo napa. Se inocularon un total de 15 coles libres de gérmenes para cada tratamiento y cinco coles se cosecharon inmediatamente después de la inoculación, cinco se cosecharon cuatro días después de la inoculación y el resto se cosecharon 10 días después de la inoculación. Los resultados muestran que los aislados de filosfera son capaces de un rápido crecimiento en la filosfera de repollo de Napa (Figura 2).
Crecimiento de inoculantes microbianos en extracto vegetal estéril
Dos levaduras (Kazachstania barnetti y Pichia membranifaciens) y tres bacterias (Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulus, y Leuconostoc mesenteroides) se inocularon en tres tipos diferentes de SVE hecho de rojo, verde, y repollo Napa. Todas las muestras se incubaron a 24oC y el crecimiento de las inoculadas durante 14 días se registró mediante chapado puntual de 5 oL de cada tratamiento en placas de agar MRS o YPD (n a 5). Los resultados se muestran en la Figura 3A. El pH de cada muestra también se registró a lo largo de la fermentación(Figura 3B)y muestra que las bacterias del ácido láctico fueron capaces de acidificar el SVE a niveles inferiores a pH 4 (lo que indica un fermento que es seguro para el consumo).
Figura 1: Diagrama de configuración de repollo libre de gérmenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tasas de crecimiento de diferentes bacterias en repollo Napa libre de gérmenes. (A) Crecimiento de inoculaciones únicas en la filosfera. (B) Crecimiento después de inocular dos microbios en la filosfera. El crecimiento de los microbios se midió como unidades formadoras de colonias contadas por g de homogeneiza de repollo chapadas en medios TSA o MRS. n 5. Barras de error: desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Crecimiento de bacterias y levaduras de ácido láctico en extracto vegetal estéril (SVE) hecho con repollo rojo, verde y napa. (A) El crecimiento de inoculantes microbianos se midió contando unidades formadoras de colonias por ml de SVE chapadas. Las levaduras se ensoplaban en placas de agar YPD y bacterias en las placas de agar MRS. (B) La acidificación del extracto vegetal estéril a medida que crecen los microbios se muestra como caída del pH. n 5. Barras de error: desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Phyla/Genera de inoculantes microbianos | Fuente de microbios |
| Firmicutes Bacillus | Phyllosphere |
| Firmicutes Lactobacillus | Fermentación |
| Proteobacteria Achromobacter | Phyllosphere |
| Proteobacteria Rhizobium | Phyllosphere |
| Proteobacterias Sphingomonas | Phyllosphere |
Tabla 1: Aislados microbianos inoculados en repollo Napa libre de gérmenes.
Figura suplementaria 1: Crecimiento de Brassica rapa var pekinensis: Bilko en condiciones libres de gérmenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 2: Diferentes variedades de repollo que crecen en condiciones libres de gérmenes. (A) B. rapa: Nabip Purple Top, (B) B. oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid, (D) B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid, (E) B. juncea: Mustard Red Giant. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las plantas de repollo Napa libres de gérmenes se han utilizado para estudiar la limitación de dispersión de las bacterias del ácido láctico en la filosfera de repollo Napa17. Las coles Napa libres de gérmenes también se pueden utilizar para probar el crecimiento individual o par en la filosfera (Figura 1). Los métodos para la elaboración de extracto vegetal estéril han sido probados para tres variedades diferentes de repollo: rojo, verde y Napa. Cada una de estas EV actúa como un medio de crecimiento fiable; los microbios inoculados crecen constantemente en los diferentes medios. Las tasas de crecimiento de cepa única en SVE (Figura 2) muestran que LAB crece rápidamente y acidifica los medios de la misma manera que se anticiparía en un fermento17.
Plantas libres de gérmenes y extracto vegetal estéril se pueden utilizar en combinación para abordar una serie de diferentes cuestiones ecológicas tales como efectos prioritarios y sucesión en la filosfera o dentro de una fermentación. Una comunidad sintética de microbios es fácil de construir a través de chapado de coles homogeneizadas para obtener aislados de filosfera, o chucrut para obtener bacterias del ácido láctico16. Las interacciones por pares o los experimentos de salida única con más miembros de la comunidad se pueden llevar a cabo en la filosfera o en el SVE para evaluar la importancia o función de los miembros de la comunidad. Los estudios de selección ambiental se pueden llevar a cabo en el SVE donde se puede evaluar el impacto de la fermentación vegetal. También existe el potencial de utilizar tanto las coles libres de gérmenes como el SVE para cuantificar la diversificación de las especies microbianas y las comunidades que utilizan la evolución experimental.
Una limitación de este sistema de repollo libre de gérmenes es la corta escala de tiempo de los experimentos. Debido a los pequeños tubos de vidrio utilizados, las coles no son capaces de crecer durante períodos más de un mes, ya que sus hojas están confinadas por el borde de los tubos. Se podrían utilizar recipientes de cultivo más grandes, como cajas de cultivo de tejido vegetal (Tabla de materiales),pero estos todavía no producirán una planta de repollo de tamaño completo. También hemos intentado cultivar coles en un 0,75% de agar que contiene caldo de LA MS, pero hemos encontrado que esto produjo un crecimiento inconsistente de las plántulas de repollo. El uso de arcilla calcinada como sustrato en crecimiento con suficiente caldo de MS para saturar pero no inundar los granos de arcilla es el método óptimo para el cultivo de coles saludables.
Hay algunos pasos críticos para asegurar el crecimiento exitoso de coles libres de gérmenes. Asegurar que la arcilla calcinada esté completamente seca al agregar caldo de MS permite que la arcilla absorba completamente el caldo de MS durante el ciclo de autoclave. Sin embargo, si hay algún caldo de MS sobre el nivel de la arcilla, debe ser retirado antes de agregar las semillas; las semillas no germinarán si están sentadas en el caldo de LA MS. Otro paso importante para monitorear es la esterilización de semillas. Las semillas más viejas (>1 año de edad) no germinarán tan rápido o de manera tan confiable como las semillas jóvenes. Cambiar el tamaño del tubo utilizado para la esterilización o sobrellenar los tubos también puede afectar a la esterilización. El paso de esterilización también ayuda a suavizar y eliminar la capa de semillas para que las semillas germinen rápidamente. Tenga en cuenta aquí que no se recomienda reutilizar las botellas de pulverización de la bomba después de utilizar con cultivos microbianos, ya que es difícil eliminar las biopelículas del componente de la bomba. Cabe destacar que se debe tener precaución con las especies de Bacillus, ya que son particularmente resistentes al autoclaving. Las botellas de bombeo que hayan entrado en contacto con Bacillus spp no se reutilizan.
Mientras que el extracto vegetal estéril no tiene la estructuración espacial que está presente en un recipiente de fermentación, la dinámica de crecimiento de LAB sugiere que imita el progreso de la fermentación con una rápida caída en el pH y un aumento en el crecimiento de bacterias del ácido láctico durante los 14 días de fermentación. Leuconostoc mesenteroides es importante al comienzo de la fermentación y aumentó en abundancia más rápidamente que el Lactobacillus y Pediococcus spp, una tendencia vista en otras encuestas de sucesión de chucrut20,,21. El trabajo en el laboratorio también ha explorado el uso del espectrofotómetro para obtener lecturas de densidad óptica (OD) para medir el crecimiento de LAB en SVE dispensado en placas de 96 pozos. Los resultados iniciales con extracto de repollo Napa parecían prometedores, pero SVE hecho con extracto de repollo rojo cambió de color como el pH cayó resultando en lecturas de OD confundidas. Además, el uso de lecturas de OD para enumerar el crecimiento limita el uso de este sistema a inoculaciones de una sola tensión. Juntos, estas limitaciones nos llevaron a abandonar el uso de lecturas de OD para medir el crecimiento microbiano.
Las pruebas de interacciones ecológicas en la filosfera son tópicas, ya que hay evidencia de que la filosfera afecta la salud y la productividad de las plantas de cultivo22. Nuestro sistema modelo sólo ha sido desarrollado para trabajar con repollo Napa, pero las bacterias de la phyla Proteobacterias, Firmicutes, y Actinobacteria son comunes en la filosfera de muchas especies de plantas13,,23. Aunque sólo se han probado tres variedades diferentes de repollo, SVE se puede hacer con otras plantas agrícolas importantes. Por ejemplo, los estudios que investigan el ensamblaje de la comunidad microbiana durante la fermentación del jugo de zanahoria24 o la colonización microbiana de la raíz de maíz25 se pueden replicar utilizando los protocolos descritos en este documento.
El acoplamiento del repollo libre de gérmenes con el SVE para estudiar el montaje comunitario en fermentación puede mostrar cómo los cambios en el microbioma de la filosfera pueden influir en el éxito de la fermentación. El deterioro de los fermentos o la falta de un pH suficientemente bajo pueden resultar si no hay una acidificación inicial rápida26. Estos fermentos estropeados pueden deberse a procesos de fabricación, pero la variación en los microbiomas de la filosfera también puede tener una influencia importante en el éxito de los fermentos vegetales17. El sistema descrito es un modelo útil para determinar qué procesos de ensamblaje del microbioma pueden afectar el éxito de la fermentación vegetal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport y Claire Fogan proporcionaron soporte técnico y Ruby Ye y Casey Cosetta proporcionan comentarios útiles sobre las primeras versiones de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
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