Summary
تم تطوير طريقة لزراعة الكرنب النابا خالية من الجراثيم التي تمكن الباحثين من تقييم كيفية الأنواع الميكروبية واحدة أو المجتمعات الميكروبية متعددة الأنواع تتفاعل على أسطح أوراق الملفوف. كما يتم تقديم مستخلص خضار معقمة يمكن استخدامها لقياس التحولات في تكوين المجتمع أثناء تخمير الخضروات.
Abstract
الفيلوسفير، الجزء الأرضي أعلاه من النبات الذي يمكن استعماره بواسطة الميكروبات، هو نظام نموذج مفيد لتحديد عمليات التجميع المجتمعية الميكروبية. يحدد هذا البروتوكول نظامًا لدراسة ديناميكيات المجتمع الميكروبي في الغلاف الفيلوسفيري لنابا من مصانع الملفوف. وهو يصف كيفية زراعة النباتات الخالية من الجراثيم في أنابيب الاختبار مع الطين الكالسيد وركيزة مرق المغذيات. التلقيح من النباتات الخالية من الجراثيم مع الثقافات الميكروبية محددة توفر فرصا لقياس النمو الميكروبي وديناميات المجتمع في فيلوسفير. من خلال استخدام مستخلص الخضار العقيمة المنتجة من التحولات الكرنب في المجتمعات الميكروبية التي تحدث أثناء التخمير يمكن أيضا أن تقدر. هذا النظام بسيط نسبيا وغير مكلف لإنشاء في المختبر ويمكن استخدامها لمعالجة المسائل البيئية الرئيسية في تجميع المجتمع الميكروبي. كما أنه يوفر فرصاً لفهم كيف يمكن لتكوين المجتمع فيلوسفير أن يؤثر على التنوع الميكروبي وجودة تخمير الخضروات. ويمكن تطبيق هذا النهج لتطوير مجتمعات الكرنب الغنوتيك فيلوسفير على أنواع نباتية أخرى برية وزراعة.
Introduction
التنوع الميكروبي للphyllosphere يلعب دورا هاما في الحفاظ على صحة النبات ويمكن أن تؤثر أيضا على قدرة النباتات على تحمل الإجهاد البيئي1,2,3,4,5. بدورها، تؤثر صحة المحاصيل بشكل مباشر على سلامة الأغذية وجودة6،7. النباتات تلعب دورا في أداء النظام الإيكولوجي والميكروبيومات المرتبطة بها على حد سواء تؤثر على قدرة النباتات على تنفيذ هذه الأنشطة، فضلا عن التأثير المباشر على البيئة أنفسهم8. في حين أن العلماء قد بدأت فك وظيفة وتكوين الفيلوسفير، والعمليات الإيكولوجية التي تؤثر في المجتمع فيلوسفير الميكروبية المجتمع غير مفهومة تماما9،10. الميكروبيوم phyllosphere هو نظام تجريبي ممتاز لدراسة البيئة من الميكروبيوم11. هذه المجتمعات بسيطة نسبيا ويمكن أن تزرع العديد من أفراد المجتمع على وسائل الإعلام مختبر القياسية10،12،13.
الخضروات المخمرة هي نظام واحد حيث هيكل المجتمع من phyllosphere له عواقب هامة. في كل من sauerkraut والكيمتشي، الميكروبات التي تحدث بشكل طبيعي على أوراق الخضروات (فيلوسفير من أنواع براسيكا) بمثابة inoculum للتخمير14،15. تعتبر بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) أعضاء في كل مكان من الميكروبات النباتية ، ومع ذلك يمكن أن تكون في وفرة منخفضة في phyllosphere16. اختيار غير أحيائي قوي أثناء التخمير يدفع تحولا في تكوين المجتمع الميكروبي تمكين البكتيريا حمض اللبنيك لزيادة في وفرة. كما ينمو LAB، فإنها تنتج حمض اللاكتيك الذي يخلق البيئة الحمضية من المنتجات النباتية المخمرة17. توفر الصلة بين الفيلوسفير والتخمير فرصة لاستخدام الخضروات كنموذج لفهم كيفية هيكلة الميكروبيوم.
لقد طورنا أساليب لزراعة الكرنب نابا الخالي من الجراثيم وتطعيمها بمجتمعات ميكروبية محددة باستخدام زجاجات الرش. هذا هو وسيلة رخيصة وموثوق بها من تطعيم بالتساوي الملفوف مع الميكروبات الفردية أو المجتمعات المختلطة. كما تم تطوير مستخلص خضار معقمة (SVE) من ثلاثة أنواع مختلفة من الكرنب/ الأصناف: الملفوف الأحمر والأخضر(Brassica oleracea)والملفوف نابا(B. rapa). إضافة الملح إلى هذه SVEs يكرر بيئة التخمير ويسمح للدراسات التجريبية على نطاق صغير وعالية الإنتاجية نسبيا من تجميع ميكروبيوم التخمير. ويمكن استخدام هذه الطرق لدراسة تجميع المجتمعات الميكروبية في الفيلوسفير وكيف يمكن ربط ديناميات المجتمع الميكروبي في الفيلوسفير بنجاح تخمير الخضروات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تزايد الجرثومة خالية من الملفوف
- تجهيز معدات لزراعة الكرنب الخالي من الجراثيم
- تنظيف الطين المكلس لإزالة جزيئات الغبار الدقيقة
- شطف الطين الكالسيد (جدول المواد) على الأقل 3x مع مياه الصنبور؛ استنزاف قبالة المياه.
تنبيه: الطين الكالسيد تنتج غبار ناعم جدا، ومن المستحسن ارتداء قناع واقية (جدول المواد)عند الغسيل. - انتشار الطين الكالسييد خارج كطبقة رقيقة (~ 4 سم) في علبة الأوتوكلاف والأتوكلاف على دورة جافة (121 درجة مئوية التدفئة لمدة 20 دقيقة و 20 دقيقة وقت التجفيف) لتعقيم.
- السماح للطين المكلس لتجف تماما قبل استخدامها عن طريق انتشار على الصواني ووضعها في حاضنة دافئة (30-37 درجة مئوية) لمدة أسبوع على الأقل. يُحرّك المزيج كل 3 أيام لتجفيف الطين المكَسَم بالكامل بحيث يمتص كمية زوجية من مرق موراشيج وسكوغ (MS) للمغذيات (القسم 1.2).
ملاحظة: يساعد التجفيف أيضًا على الحفاظ على حجم الطين المكلس حتى عندما يتم وزنه في أنابيب. التجفيف بوسائل أخرى، مثل فرن التجفيف، سيكون أيضا مناسبة.
- شطف الطين الكالسيد (جدول المواد) على الأقل 3x مع مياه الصنبور؛ استنزاف قبالة المياه.
- تنظيف الأواني الزجاجية لزراعة الكرنب الخالي من الجراثيم
- تنظيف تام وتعقيم أنابيب الزجاج (جدول المواد) بين كل استخدام. نقع أنابيب لمدة 30 دقيقة في محلول التبييض 30٪ وشطف جيدا مع مياه الصنبور قبل التنظيف في غسل حمض على وضع البكتريولوجيا. حمض غسل أغطية أنبوب اختبار في اتجاهين (جدول المواد) بين الاستخدامات.
- بذور الملفوف المعقمة السطحية
- مكان يصل إلى 100 ملفوف نابا(B. رابا فار pekinensis)البذور في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
ملاحظة: قد يؤثر إضافة أكثر من 100 من البذور إلى أنبوب واحد microcentrifuge أو تغيير حجم الأنبوب على معدلات الإنبات من البذور بسبب عدم إزالة معطف البذور. - إضافة 1 مل من 70٪ الإيثانول إلى البذور ودوامة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من 50٪ التبييض ودوة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من المياه الأيونية ودوامة لمدة 5 دقائق.
- كرر الخطوة 1.1.3.4 3x لشطف كل التبييض. نقع البذور في المياه المعقمة deionized لمدة 2-8 ساعة قبل زرع لتليين معطف البذور.
- مكان يصل إلى 100 ملفوف نابا(B. رابا فار pekinensis)البذور في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- تنظيف الطين المكلس لإزالة جزيئات الغبار الدقيقة
- زراعة الكرنب الخالي من الجراثيم
ملاحظة: تزرع الملفوف نابا(B. رابا فار pekinensis)في أنابيب زجاجية (15 سم × 2.5 سم) تحتوي على الطين المكلس غارقة في موراشيج وSkoog (MS) مرق المغذيات(الشكل 1).- تزن 10 غرام من الطين المكلس نظيفة في أنبوب زجاجي نظيف (15 سم × 2.5 سم).
- إعداد مرق المغذيات MS عن طريق حل 4.4 غرام من المتوسط MS في 1 لتر من المياه ديوند. إضافة مرق المغذيات MS (~ 9 مل) إلى كل أنبوب زجاجي لتغطية الطين الكالسيت باستخدام ماصة.
ملاحظة: السائل الواقف في الأنبوب سيمنع البذور من الإنبات لذلك قد يكون من الضروري إضافة مرق MS أقل قليلاً إلى بعض الأنابيب. - سقف فضفاض أنابيب زجاجية مع 22 مم قبعات أنبوب اختبار في اتجاهين والأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة). عند إزالتها من الأوتوكلاف، ودفع قبعات على أنابيب زجاجية لختم لهم. تبريد أنابيب إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- ضع برفق بذرة الملفوف المعقمة في وسط كل أنبوب باستخدام ملقط معقمة وطويلة (25.4 سم). ضع الأنابيب في صينية ذات 7 طرق ثم ضعها تحت رفوف الضوء (مصابيح الفلورسنت T5 كاملة الطيف أو إعداد الإضاءة الأخرى لنمو النبات) مع دورة ضوء 16 ساعة عند 24 درجة مئوية.
ملاحظة: تنبت البذور بين عشية وضحاها وتطوير أوراقها الحقيقية الأولى بعد 5 أيام. ورقة حقيقية هي أول ورقة الأوعية الدموية بعد أن شكلت كوتيليفدون. لديها حافة أكثر التجاعيد وفي براسيكا رابا مغطى في trichomes.
- اختبار لعقم الكرنب الخالي من الجراثيم
ملاحظة: لاختبار ما إذا كانت الكرنب خالية من الجراثيم، اختر بعض الكرنب (5−10) من كل دفعة وطبقة لتحديد ما إذا كانت هناك أي مستعمرات صالحة للزراعة.- إزالة بلطف الملفوف من الأنابيب الزجاجية عن طريق تجتاح قاعدة النبات مع ملقط معقمة وسحبه. قبل إزالة الملفوف بالكامل من الأنبوب ، قطع الجذور بعناية باستخدام مقص التشريح المعقم. ضغط أوراق الملفوف في أنبوب microcentuge 1.5 مل.
ملاحظة: قد تتطلب الكرنب الأكبر إزالة واحد أو اثنين من الأوراق الكبيرة بينما الملفوف لا يزال في الأنبوب لتسهيل الحصول على الملفوف في أنبوب microcentruge 1.5 مل. ويمكن إضافة هذه الأوراق الكبيرة إلى أنبوب 1.5 مل بعد أن تم وضع بقية الملفوف في الأنبوب إذا كان الملفوف بأكمله مطلوبا. - إضافة 400 μL من 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) إلى كل 1.5 مل ميكروسنتريفوج أنبوب. باستخدام ميكروبستر معقم، التجانس الملفوف عن طريق الآفات 30x.
- لوحة 100 ميكرولتر من الملفوف متجانسة على لوحات أجار لتحديد ما إذا كان هناك أي الملوثات الموجودة في العينة. معظم البكتيريا الموجودة في الفيلوسفير سوف تنمو على الصويا تريبيتي (TS) لوحات أجار. استخدام نصائح الفوهة واسعة ماصة عند طلاء الملفوف متجانسة كما متجانسة الملفوف سميكة ويمكن أن تسد نصائح الماصات العادية.
- إزالة بلطف الملفوف من الأنابيب الزجاجية عن طريق تجتاح قاعدة النبات مع ملقط معقمة وسحبه. قبل إزالة الملفوف بالكامل من الأنبوب ، قطع الجذور بعناية باستخدام مقص التشريح المعقم. ضغط أوراق الملفوف في أنبوب microcentuge 1.5 مل.
2. تلقيح الفيلوسفير بالحلول الميكروبية
- صنع مخزون الغليسيرول من سلالات التطعيم
ملاحظة: يسرد الجدول 1 المعزولات الميكروبية التي يمكن استخدامها في هذه الخطوة. ويمكن أيضا عزل فيلوسفير أخرى يمكن أن تستخدم هنا.- سلسلة كثيفة من المستعمرات الفردية من سلسلة جديدة، على اثنين/ ثلاثة لوحات جديدة من نفس وسائل الإعلام للحصول على العديد من المستعمرات.
- السماح لشرائط تنمو لمدة 2-5 أيام ثم كشط المستعمرات من جميع لوحات في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 15 مل من 15٪ الجلسرين، ودوامة لخلط جيدا.
- نقل aliquot من 1 مل من مخزون الجلسرين المختلطة جيدا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتخزين الأسهم الجلسرين في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. حفظ المتبقية 14 مل من مخزون الجلسرين في -80 درجة مئوية كما كميات كبيرة نسبيا من محلول التطعيم مطلوبة عند تلقيح الملفوف.
- قبل أسبوع واحد من الاستخدام، ذوبان أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1 مل من مخزون الجلسرين (من الخطوة 2.1.3) على الجليد، وتمييع، وطبق في عدة تمييع مختلفة (على سبيل المثال،10-4،10-5،و10-6) لتحديد التركيز (مستعمرة تشكيل وحدة [CFU] لكل ميكرولتر) من 14 مل من محلول التلقيح.
- تعقيم زجاجات رذاذ التلقيح
- تفكيك العنبر جولة بوسطن ضخ زجاجات (59 مل) ونقع جميع المكونات (مضخة، أنبوب، غطاء وزجاجة) في 30% حل التبييض لمدة 30 دقيقة في حاوية بلاستيكية كبيرة مع غطاء مناسب بإحكام.
- بعد نقع، صب بعناية كل التبييض من الحاوية عن طريق رفع زاوية واحدة فقط من غطاء الحاوية.
- شطف الزجاجات عن طريق ملء حاوية بلاستيكية مع المياه ذات الاوتومينات (~ 1 L اعتمادا على حجم الحاوية) وتصب بعناية من المياه deionized، مرة أخرى عن طريق رفع الغطاء في زاوية واحدة.
- تعقيم مجلس الوزراء السلامة الحيوية عن طريق الرش مع 70% محلول الإيثانول وتحول على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: مواصلة هذا العمل في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية بحيث لا يكون هناك خطر من التلوث الميكروبي من الزجاجات لأنها الهواء الجاف. - إزالة زجاجات من حاوية بلاستيكية كبيرة وملء كل زجاجة مع المياه ذات الأيونية ذاتية التكفا باستخدام ماصة. إعادة تجميع المضخات ووضع واحد في كل زجاجة. ضخ المياه ديونسيد من خلال كل زجاجة (10 بخاخ لكل زجاجة) لإزالة التبييض من عنصر مضخة من الزجاجة.
- كرر الخطوة 2.2.5 للتأكد من إزالة جميع التبييض من الزجاجات.
- اختبار ما إذا كانت الزجاجات معقمة عن طريق وضع عدد على كل زجاجة (الشائكة شريط مختبر إلى جانب الزجاجة عندما يكون جافا تماما) ثم إضافة 10 مل من 1X PBS إلى كل من الزجاجات وضخ 3 بخاخ على لوحة TS agar. بعد الرش، احتضان لوحات لمدة أسبوع واحد في درجة حرارة الغرفة. إذا كانت أي مستعمرات تنمو على طبق فإنه يشير إلى أن زجاجة منهما لم تكن معقمة ولا ينبغي استخدامها للتجارب.
- قبل تخزين الزجاجات المعقمة، وإزالة جميع برنامج تلفزيوني المتبقية والسماح للزجاجات لتجف جيدا في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. تخزين زجاجات معقمة في وعاء بلاستيكي معقمة (عادة الحاوية المستخدمة لتبييض الزجاجات) حتى الاستخدام.
- إعداد التلقيح الميكروبي ورش الكرنب الخالي من الجراثيم
تنبيه: ينبغي تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية، حيث أن رش الهباء الجوي يُضفي على المحاليل الميكروبية التي يمكن أن تلوث أسطح العمل أو تشكل خطراً على الصحة إذا تم على مقعد مختبري.
ملاحظة: سوف تشكل الكرنب أوراق حقيقية بعد 5 أيام، لذلك فمن المستحسن الانتظار لمدة أسبوع واحد بعد زرع الملفوف قبل تلقيح مع أي حلول الميكروبية. كما يتم إغلاق الأنابيب، ليست هناك حاجة لسقي الملفوف. يتم إجراء التجارب بشكل أفضل في غضون شهر من الزراعة ، حيث تقيد الأنابيب الصغيرة نمو الملفوف.- ذوبان الغليسيرول الأسهم على الجليد وتمييع في 1X PBS إلى تركيز التطعيم المطلوب (التركيز المحدد عن طريق ذوبان والطلاء aliquot 1 مل في الخطوة 2.1.4).
ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة متنوعة من مستويات التطعيم المختلفة، ولكن عزل فيلوسفير يمكن أن تنمو من 104 إلى 108 CFUs /mL من ملط الملفوف في 10 أيام. - إضافة 10 مل من مخزون الجلسرين المخفف إلى زجاجة مضخة معقم وضخ 5 بخاخ في منبر جمع النفايات الكبيرة لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية من مكون مضخة زجاجة.
- إزالة الغطاء من أنبوب الملفوف، إمالة الملفوف نحو زجاجة رذاذ، ورش كل الملفوف مع 3 مضخات من محلول التطعيم، الذي يوفر ~ 600 ميكرولتر من inoculum.
- بعد تلقيح, حصاد مجموعة فرعية من الملفوف لتقييم تركيز التلقيح المدخلات الفعلية. إزالة الملفوف من أنبوب مع ملقط معقمة. قطع الجذور مع مقص تشريح معقمة ومن ثم وضع بعناية الملفوف في أنبوب معقم مسبق 1.5 مل microcentrifuge. تسجيل وزن الملفوف للحسابات المستقبلية إذا كان مطلوبا CFUs / ز من الملفوف من أجل الحسابات.
- إضافة 400 ميكرول من 1X برنامج تلفزيوني لكل أنبوب microcentuge 1.5 مل التي تحتوي على الملفوف واستخدام micropestle معقم لتجانس الملفوف في برنامج تلفزيوني 1x عن طريق طحن 30x.
- تخفيف المجانسة الملفوف (إذا لزم الأمر) وطبق خارج خليط الملفوف المبيد. استخدام نصائح الفوهة واسعة للأنابيب الطين الملفوف لأنه سيكون سميكة ومليئة بقطع الأنسجة النباتية.
- ذوبان الغليسيرول الأسهم على الجليد وتمييع في 1X PBS إلى تركيز التطعيم المطلوب (التركيز المحدد عن طريق ذوبان والطلاء aliquot 1 مل في الخطوة 2.1.4).
3. إعداد مستخلص خضار معقمة
ملاحظة: هذه الطريقة هي نسخة معدلة من إنتاج وسائل الإعلام المعقمة الملفوف18,19.
- شراء الملفوف من سوبر ماركت. في المختبر، إزالة وتجاهل الأوراق الخارجية من الملفوف. ختم جميع الملفوف المتبقية لتناسب في خلاط والملفوف التجانس إلى لب ناعم، أي، الملفوف لن تحصل على أي أدق مع مزيد من مزج.
ملاحظة: أي خلاط يمكن أن يقطع الملفوف إلى لب متجانس على نحو سلس يجب أن يكون مناسبا لهذه الطريقة. - وزن الملفوف المخلوطة متجانسة وإضافة 2 مل من الماء المقطر لكل غرام من الملفوف. تصفية الطين الملفوف المخلوطة من خلال 2 طبقات من مرشحات القهوة سلة (ورقة غير مفجّر).
- توزيع الطين الملفوف في أنابيب الطرد المركزي (الحجم يعتمد على جهاز الطرد المركزي). الطرد المركزي الطين الملفوف المصفاة في 20،000 س ز لمدة 20 دقيقة حتى الجسيمات الكبيرة تستقر من الحل.
ملاحظة: من الضروري أن الطرد المركزي الطين الملفوف لفترة طويلة من الزمن كما الجسيمات الملفوف تسد بسرعة معقم التصفية. - باستخدام ماصة المصلية، وإزالة فائقة من حطام الملفوف بيليه مع الحرص على عدم إزعاج الملفوف بيليه. إذا كان الهدف من إعادة تهيئة ظروف التخمير حيث يتم استخدام تركيزات الملح القياسية، إضافة 2٪ ث / V NaCl في هذه الخطوة (أي، قبل التعقيم مرشح).
- تصفية تعقيم استخراج الخضار باستخدام مرشح 0.2 μm (500 مل أو 1 لتر) تعلق على فراغ. الاستغناء في أنابيب معقم (إما 50 مل أنابيب الطرد المركزي أو 15 مل أنابيب الطرد المركزي) وتجميد في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. التطعيم من مستخلصات الخضار المعقمة
- ذوبان SVE والاستغناء 490 ميكرول في أنابيب microcentuge 1.5 مل. استخدام أنابيب كافية ليكون ما لا يقل عن خمسة تكرارات لكل معالجة في نقطة زمنية حيث أن كل قياس نقطة زمنية مدمر.
- ذوبان الغليسيرول الأسهم من عزل الميكروبات على الجليد وتمييع مع 1X برنامج تلفزيوني إلى التركيز المطلوب. تركيز بكتيريا حمض اللاكتيك يمكن أن تكون منخفضة إلى 5000 CFU لكل مل من SVE. ولتحقيق هذا التركيز، قم بتخفيف المخزونات إلى 250 وحدة فلورون/ميكرولتر لأن 10 ميكرولتر سوف تستخدم في تلقيح حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر.
- تلقيح SVE مع 10 ميكرولتر من عزل الميكروبات المخفف. الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط شامل. احتضان في درجة الحرارة المطلوبة (14 درجة مئوية لدرجة حرارة إنتاج الكيمتشي أو 24 درجة مئوية لتخمير sauerkraut الحارة).
- قياس معدل نمو عزل الميكروبات في SVE عن طريق حصاد أنابيب تكرار في اليوم 1، اليوم 2، اليوم 4، اليوم 7 واليوم 14.
ملاحظة: التخمير يستمر بسرعة في البداية ويبطئ مع مرور الوقت. لذلك، وجود المزيد من نقاط الوقت الأولية يعطي دقة أكبر لديناميات كيفية التخمير العائدات. - في كل نقطة زمنية، اخلطي SVE الملقح جيدًا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطاً عدة مرات. تخفيف تسلسلي SVE تلقيح في 1X PBS ولوحة على لوحات أجار. احتضان لوحات أجار لمدة 4-7 أيام قبل عد المستعمرات.
ملاحظة: يجب استخدام الرجل، روغوسا، وشارب (MRS) أجار لتعداد جميع البكتيريا حمض اللبنيك، الخميرة بيبتون dextrose (YPD) ينبغي أن تستخدم لخميرة، و TS أجار لمعظم البكتيريا الأخرى يعزل من فيلوسفير. - سجل الرقم الH للعينات في كل نقطة زمنية باستخدام مسبار الرقم الني الجزئي.
ملاحظة: ينبغي تنفيذ هذه الخطوة بعد الطلاء لأن مسبار PH سينقل الخلايا بين الأنابيب/ العلاجات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
معدلات نمو الكرنب النابا
تم اختبار طريقة التعقيم البذور مع العديد من الملفوف نابا مختلفة (B. رابا فار pekinese; الرقم التكميلي 1) من عدد من الموردين المختلفة ونمت جميعها بشكل متسق مع معدلات النمو المماثلة. ومع ذلك، اختبار الأساليب مع أنواع مختلفة من Brassica (B. رابا: اللفت الأرجواني الأعلى; ب. أوليراسيا: القاهرة الهجين، العملاق المداري الهجين؛ باء campestris: باك تشوي Toy Choy الهجين؛ B. juncea: الخردل الأحمر العملاق) أعطى نجاحا محدودا(الرقم التكميلي 2). على عكس الملفوف نابا التي تشكل الورديات أنيق المدمجة التي تندرج في الأنابيب الزجاجية، وهذه SPP Brassica. إما كان معدلات الإنبات منخفضة بعد تعقيم أو الجذعية ممدود بسرعة لجعل مغزل، نبات غير صحي. بالإضافة إلى ذلك، لا ينصح بتعقيم البذور القديمة (> سنة واحدة) حيث أن معاطف البذور تجف مما يجعل من الصعب إزالتها أثناء عملية التعقيم. شراء البذور الجديدة بانتظام واختبار مجموعة فرعية من الملفوف لتحديد ما إذا كانت عقيمة قبل إجراء التجارب.
نمو التلقيحات الميكروبية في فيلوسفير ناباج
تم تلقيح المعزولات الميكروبية (الجدول 1) إما كعزلات سلالة واحدة أو بالاشتراك مع عزل آخر للبحث عن تفاعلات زوجية في فيلوسفير الكابوس. وتم تلقيح ما مجموعه 15 ملفوفاً خالياً من الجراثيم لكل علاج، وحُصاد خمسة من الكرنب مباشرة بعد التلقيح، وحُصِدت خمسة منها بعد أربعة أيام من التلقيح، وحُصِبت الكرنب المتبقية بعد 10 أيام من التلقيح. وتبين النتائج أن عزل فيلوسفير قادر على النمو السريع في فيلوسفير نابا الملفوف(الشكل 2).
نمو التلقيحات الميكروبية في مستخلصات الخضروات المعقمة
اثنين من الخمائر(كازاشتانيا بارنيتي وبيشيا membranifaciens)وثلاث بكتيريا(Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulus, وEuconostoc mesenteroides) تم تلقيحها في ثلاثة أنواع مختلفة من SVE مصنوعة من الكرنب الأحمر والأخضر ونابا. تم احتضان جميع العينات في 24 درجة مئوية، وتم تسجيل نمو التلقيحات على مدى 14 يومًا عن طريق الطلاء الموضعي 5 ميكرولتر من كل علاج على لوحات MRS أو YPD agar (n = 5). تظهر النتائج في الشكل 3أ. كما تم تسجيل الرقم الهى لكل عينة في جميع أنحاء التخمير (الشكل 3B) ويظهر أن بكتيريا حمض اللاكتيك كانت قادرة على تحمض SVE إلى مستويات أقل من الرقم 4 (مما يدل على التخمير الذي هو آمن للاستهلاك).
الشكل 1: رسم بياني لإعداد الملفوف الخالي من الجراثيم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: معدلات نمو البكتيريا المختلفة على الكرنب نابا خالية من الجراثيم. (أ) نمو التطعيمات الفردية في الفيلوسفير. (ب)النمو بعد تلقيح اثنين من الميكروبات في فيلوسفير. تم قياس نمو الميكروبات كما مستعمرة تشكيل وحدات تحسب لكل غرام من المجانسة الملفوف مطلية إما TSA أو وسائل الإعلام MRS. n = 5. أشرطة الخطأ = الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نمو بكتيريا حمض اللاكتيك والخمائر في مستخلصات الخضروات المعقمة (SVE) المصنوعة من الكرنب الأحمر والأخضر والنابا. (أ)تم قياس نمو الطعوس الميكروبي عن طريق عد وحدات تشكيل المستعمرة لكل مل من مطلي SVE. كانت مطلية الخمائر على لوحات YPD agar والبكتيريا على لوحات MRS agar. (B) تحمض استخراج الخضار العقيمة كما تنمو الميكروبات كما تظهر في انخفاض في الأسى. n = 5. أشرطة الخطأ = الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| فيلا/ جينيرا من التلقيحات الميكروبية | مصدر الميكروب |
| فيميكوتسيس عصيات | فيلوسفير |
| فيميكوتسيس لاكتوباسلوس | التخمير |
| بروتيوباكتريا أكروموتباك | فيلوسفير |
| بروتيوباكتيريا ريزوبيوم | فيلوسفير |
| بروتيوباكتيريا سفينيموناس | فيلوسفير |
الجدول 1: عزل الميكروبات تلقيح على الكرنب نابا خالية من الجراثيم.
الشكل التكميلي 1: نمو براسيكا رابا فار بيكينينسيس: بيلكو في ظروف خالية من الجراثيم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: أصناف مختلفة من الملفوف تنمو في ظروف خالية من الجراثيم. (أ) ب رابا: اللفت الأرجواني الأعلى، (ب) ب. oleracea: القاهرة الهجين، (C) B. oleracea: العملاق العملاق المداري الهجين، (D) B. campestris: باك تشوي لعبة تشوي الهجين، (E) B. juncea: الخردل الأحمر العملاق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت النباتات الملفوف نابا خالية من الجراثيم لدراسة الحد من تشتت البكتيريا حمض اللاكتيك في فيلوسفير نابا الملفوف17. ويمكن أيضا أن تستخدم الجرثومة خالية من الملفوف نابا لاختبار الفرد أو الزوج من الحكمة النمو في phyllosphere(الشكل 1). وقد تم اختبار أساليب صنع مستخلصات نباتية معقمة لثلاثة أنواع مختلفة من الملفوف: الأحمر والأخضر ونابا. كل من هذه SVEs بمثابة وسائل الإعلام النمو موثوق بها; تنمو الميكروبات تلقيح باستمرار عبر وسائل الإعلام المختلفة. معدلات نمو سلالة واحدة في SVE(الشكل 2) تبين أن LAB تنمو بسرعة وتحمض وسائل الإعلام بنفس الطريقة التي من المتوقع في17التخمير.
يمكن استخدام النباتات الخالية من الجراثيم ومستخلصات الخضروات المعقمة في تركيبة لمعالجة عدد من المسائل البيئية المختلفة مثل الآثار ذات الأولوية والتعاقب في الفيلوسفير أو داخل التخمير. المجتمع الاصطناعية من الميكروبات بسيطة لبناء من خلال طلاء من الملفوف المتجانسة للحصول على عزل فيلوسفير، أو sauerkraut للحصول على البكتيريا حمض اللاكتيك16. يمكن إجراء التفاعلات الزوجية أو تجارب الخروج من مغادرة واحدة مع المزيد من أفراد المجتمع في phyllosphere أو في SVE لتقييم أهمية أو وظيفة أعضاء المجتمع. ويمكن إجراء دراسات اختيار بيئية في SVE حيث يمكن تقييم تأثير الخضار المخمرة. وهناك أيضاً إمكانية لاستخدام كل من الكرنب الخالي من الجراثيم وSVE لقياس التنوع في الأنواع الميكروبية والمجتمعات المحلية باستخدام التطور التجريبي.
إن الحد من نظام الملفوف الخالي من الجراثيم هو المقياس الزمني القصير للتجارب. بسبب الأنابيب الزجاجية الصغيرة المستخدمة ، فإن الملفوف غير قادر على النمو لفترات أطول من شهر حيث أن أوراقها محصورة على حافة الأنابيب. ويمكن استخدام الحاويات المتنامية الأكبر حجما، مثل صناديق زراعة الأنسجةالنباتية (جدول المواد)،ولكن هذه الحاويات لن تنتج بعد مصنعا كاملا الحجم. لقد حاولنا أيضا زراعة الملفوف في 0.75٪ أجار تحتوي على مرق MS، ولكن وجدت أن هذا أنتج نمو غير متسق من شتلات الملفوف. استخدام الطين المكلس كركيزة متنامية مع ما يكفي من مرق التصلب المتعدد لتشبع ولكن لا الفيضانات الحبوب الطين هو الطريقة المثلى لزراعة الملفوف صحية.
هناك بعض الخطوات الحاسمة لضمان النمو الناجح للجراثث خالية من الملفوف. ضمان أن الطين الكالسيد جافة تماما عند إضافة مرق MS يسمح الطين لاستيعاب كامل مرق MS خلال دورة الأوتوكلاف. ومع ذلك، إذا كان هناك أي مرق التصلب العصبي المتعدد على مستوى الطين، يجب إزالته قبل إضافة البذور؛ بذور لن تنبت إذا كانوا يجلسون في مرق MS. خطوة أخرى مهمة لرصد تعقيم البذور. بذور أقدم (> 1 سنة من العمر) لن تنبت بسرعة أو موثوق بها مثل البذور الشباب. تغيير حجم أنبوب المستخدمة للتعقيم أو الملء الزائد الأنابيب يمكن أن تؤثر أيضا التعقيم. كما تساعد خطوة التعقيم على تليين وإزالة معطف البذور بحيث تنبت البذور بسرعة. لاحظ هنا أن إعادة استخدام زجاجات رش المضخة بعد استخدامها مع الثقافات الميكروبية غير مستحسن ، حيث أنه من الصعب إزالة الأغشية الحيوية من مكون المضخة. وتجدر الإشارة بشكل خاص إلى أنه ينبغي توخي الحذر مع الأنواع Bacillus لأنها مرنة بشكل خاص على الذكات. لا يتم إعادة استخدام أي زجاجات مضخة التي أصبحت في اتصال مع عصية SPP.
في حين أن مستخلص الخضار العقيم لا يحتوي على الهيكلة المكانية الموجودة في وعاء التخمير ، فإن ديناميكيات النمو في LAB تشير إلى أنه يحاكي تقدم التخمير مع انخفاض سريع في درجة الحموضة وزيادة في نمو بكتيريا حمض اللاكتيك على مدى 14 يومًا من التخمير. Leuconostoc mesenteroides مهم في بداية التخمير وزاد في وفرة بسرعة أكبر من Lactobacillus وPediococcus SPP ، وهو الاتجاه الذي شوهد في غيرها من الدراسات الاستقصائية خلافة sauerkraut20،21. وقد استكشف العمل في المختبر أيضا باستخدام مقياس الطيف للحصول على قراءات الكثافة البصرية (OD) لقياس نمو LAB في SVE الاستغناء في 96 لوحات جيدا. بدت النتائج الأولية مع استخراج الملفوف نابا واعدة، ولكن SVE مصنوعة من استخراج الملفوف الأحمر تغير لونه حيث انخفض الرقم الهى مما أدى إلى قراءات OD مشوشة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام قراءات OD في تعداد النمو يحد من استخدام هذا النظام على التلقيحات سلالة واحدة. معا، هذه القيود قادتنا إلى التخلي عن استخدام قراءات OD لقياس النمو الميكروبي.
اختبار التفاعلات الإيكولوجية في الفيلوسفير هو موضعي كما أن هناك أدلة على أن الفيلوسفير يؤثر على صحة المحاصيل النباتية والإنتاجية22. وقد تم تطوير نظامنا نموذج فقط للعمل مع الملفوف نابا، ولكن البكتيريا من phyla بروتيوباكتيريا، فيميكوتيكيت، و أكتينوباكتيريا شائعة في phyllosphere من العديد من الأنواع النباتية13،23. في حين تم اختبار ثلاثة أنواع مختلفة فقط من الملفوف ، يمكن إجراء SVE مع النباتات الزراعية الهامة الأخرى. على سبيل المثال، يمكن تكرار الدراسات التي تُجري بحثاً عن تجميع المجتمعات الجرثومية أثناء تخمير عصير الجزر24 أو الاستعمار الميكروبي لذرة25 باستخدام البروتوكولات المبينة في هذه الورقة.
يمكن أن يظهر اقتران الملفوف الخالي من الجراثيم مع SVE لدراسة تجميع المجتمع في التخمير كيف يمكن أن تؤثر التغييرات في ميكروبيوم الفيلوسفير على نجاح التخمير. يمكن أن يؤدي تلف المخمرات أو الفشل في الوصول إلى مستوى حموضة منخفض بما فيه الكفاية إذا لم يكن هناك تحمض أولي سريع26. قد تكون هذه المخمرات المدللة بسبب عمليات التصنيع ، ولكن الاختلاف في ميكروبيومات phyllosphere قد يكون له تأثير مهم على نجاح تخمير الخضروات17. النظام الموصوف هو نموذج مفيد لتحديد ما هي عمليات تجميع الميكروبيوم قد تؤثر على نجاح تخمير الخضروات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة وزارة الزراعة الأميركية-NIFA: 2017-67013-26520. قدمت تريسي ديبنبورت وكلير فوغان الدعم الفني، وقدمت روبي يي وكسي كوزيتا تعليقات مفيدة على النسخ المبكرة من هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
