Summary

Un système gnotobiotique pour l’étude de l’assemblage de microbiome dans la Phyllosphère et dans la fermentation végétale

Published: June 03, 2020
doi:

Summary

Une méthode de culture de choux Napa sans germes a été mise au point qui permet aux chercheurs d’évaluer comment les espèces microbiennes uniques ou les communautés microbiennes multi-espèces interagissent sur les surfaces des feuilles de chou. Un extrait de légume stérile est également présenté qui peut être utilisé pour mesurer les changements dans la composition communautaire pendant la fermentation végétale.

Abstract

La phyllosphère, la partie au-dessus du sol de la plante qui peut être colonisée par des microbes, est un système modèle utile pour identifier les processus d’assemblage de la communauté microbienne. Ce protocole décrit un système d’étude de la dynamique des communautés microbiennes dans la phyllosphère des plants de choux de Napa. Il décrit comment cultiver des plantes exemptes de germes dans des tubes à essai avec un substrat d’argile calcinée et de bouillon nutritif. L’inoculation de plantes exemptes de germes ayant des cultures microbiennes spécifiques offre des possibilités de mesurer la croissance microbienne et la dynamique communautaire dans la phyllosphère. Grâce à l’utilisation d’extrait de légumes stériles produits à partir de choux, les changements dans les communautés microbiennes qui se produisent pendant la fermentation peuvent également être évalués. Ce système est relativement simple et peu coûteux à mettre en place en laboratoire et peut être utilisé pour répondre à des questions écologiques clés dans l’assemblage de la communauté microbienne. Il offre également des occasions de comprendre comment la composition de la communauté phyllosphère peut avoir un impact sur la diversité microbienne et la qualité des fermentations végétales. Cette approche pour le développement de communautés phyllosphère de chou gnotobiotique pourrait être appliquée à d’autres espèces végétales sauvages et agricoles.

Introduction

La diversité microbienne de la phyllosphère joue un rôle important dans le maintien de la santé des plantes et peut également influencer la capacité des plantes à résister au stress environnemental1,2,3,4,5. À son tour, la santé des cultures a un impact direct sur la salubrité et la qualité des aliments6,7. Les plantes jouent un rôle dans le fonctionnement de l’écosystème et leurs microbiomes associés affectent à la fois la capacité des plantes à mener à bien ces activités ainsi que d’influencer directement l’environnement eux-mêmes8. Alors que les scientifiques ont commencé à déchiffrer la fonction et la composition de la phyllosphère, les processus écologiques qui influencent l’assemblage de la communauté microbienne phyllosphère ne sont pas pleinement compris9,10. Le microbiome de phyllosphère est un excellent système expérimental pour étudier l’écologie des microbiomes11. Ces communautés sont relativement simples et bon nombre des membres de la communauté peuvent être cultivés sur les médias de laboratoire standard10,12,13.

Les légumes fermentés sont un système où la structure communautaire de la phyllosphère a des conséquences importantes. Dans la choucroute et le kimchi, les microbes qui se trouvent naturellement sur les feuilles végétales (la phyllosphère des espèces de Brassica) sert d’inoculum pour la fermentation14,15. Les bactéries lactiques (LAB) sont considérées comme des membres omniprésents des microbiomes végétaux, mais elles peuvent être en faible abondance dans la phyllosphère16. Une forte sélection abiotique pendant la fermentation entraîne un changement dans la composition de la communauté microbienne permettant aux bactéries lactiques d’augmenter en abondance. Au fur et à mesure que LAB se développe, ils produisent de l’acide lactique qui crée l’environnement acide des produits végétaux fermentés17. Le lien entre la phyllosphère et le ferment offre l’occasion d’utiliser les légumes comme modèle pour comprendre comment les microbiomes sont structurés.

Nous avons mis au point des méthodes pour cultiver des choux Napa exempts de germes et les inoculer avec des communautés microbiennes spécifiques à l’aide de bouteilles de pulvérisation. Il s’agit d’une méthode peu coûteuse et fiable d’inoculer uniformément le chou avec des microbes individuels ou des communautés mixtes. Un extrait de légumes stériles (SVE) a également été développé à partir de trois types de choux différents / variétés: chou rouge et vert (Brassica oleracea) et chou Napa (B. rapa). L’ajout de sel à ces SVE reproduit l’environnement de fermentation et permet des études expérimentales à petite échelle et à débit relativement élevé de l’assemblage du microbiome de fermentation. Ces méthodes peuvent être utilisées pour étudier l’assemblage de la communauté microbienne dans la phyllosphère et comment la dynamique de la communauté microbienne dans la phyllosphère peut être liée au succès de la fermentation végétale.

Protocol

1. Cultiver des choux sans germes Préparation de l’équipement pour la culture de choux sans germes Nettoyage de l’argile calcinée pour éliminer les particules fines de poussière Rincer l’argile calcinée (Table des matériaux)au moins 3x avec l’eau du robinet; égoutter l’eau.ATTENTION : L’argile calcinée produit de la poussière très fine et il est recommandé de porter un masque protecteur (Table des matériaux)lors du lavage. <l…

Representative Results

Taux de croissance des choux napaLa méthode de stérilisation des graines a été testée avec plusieurs choux Napa différents (B. rapa var pekinese; Figure supplémentaire 1) d’un certain nombre de fournisseurs différents et tous ont augmenté de façon constante avec des taux de croissance similaires. Cependant, tester les méthodes avec différentes espèces de Brassica (B. rapa: Navet Purple Top; B. oleracea:</e…

Discussion

Les plants de choux napa exempts de germes ont été utilisés pour étudier la limitation de dispersion des bactéries lactiques dans la phyllosphère du chou napa17. Les choux napa exempts de germes peuvent également être utilisés pour tester la croissance individuelle ou en couple dans la phyllosphère (figure 1). Des méthodes de fabrication d’extrait de légumes stériles ont été testées pour trois variétés différentes de choux : le rouge, le vert et l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la subvention USDA-NIFA : 2017-67013-26520. Tracy Debenport et Claire Fogan ont fourni un soutien technique et Ruby Ye et Casey Cosetta fournissent des commentaires utiles sur les premières versions de ce manuscrit.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 20170-650
15 mL conical tubes Falcon 352096
7-way tray tray Sigma Magenta T8654
Amber Round Boston Glass Bottle GPS 712OZSPPK12BR Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters If you care (unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free) Austin's 50-010-45
Borosilicate Glass tubes VWR 47729-586
Calcined clay Turface MVP Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender Cuisinart Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors 7-389-A American Educational Products Ordered on Amazon.com
Ethanol VWR 89125-172
Forceps Aven 18434 Ordered on Amazon.com
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
KleenGuard M10 Kimberley-Clark 64240
Large plastic container Rubbermaid Ordered on Amazon.com
Light racks Gardner's Supply 39-357 full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps Millipore Sigma C1934
Man, Rogosa, and Sharpe Fisher Scientific DF0881-17-5 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP
Micropestle Carolina 215828 Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth Millipore Sigma M5519 Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl Sigma Aldrich S9888
Napa cabbage seeds Johnny's Select Seeds 2814G B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 Used to make agar plates
Phosphate buffer saline Fisher Scientific 50-842-941 Teknova
Plant tissue culture box Sigma Magenta GA-7
Serologial pipettes VWR 89130-900
Sterile dowel Puritan 10805-018 Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter Nalgene 974103
Tryptic soy agar Fisher Scientific DF0370-17-3 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips Rainin 17007102
Yeast, peptone and dextrose Fisher Scientific DF0428-17-5 This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates

References

  1. Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
  2. Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
  5. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  6. Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
  7. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
  8. Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
  9. Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
  10. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
  11. Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
  12. Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
  13. Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
  14. Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
  15. Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
  16. Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
  17. Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
  18. Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
  19. Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
  20. Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), 77 (2018).
  21. Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
  22. Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
  23. Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
  24. Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
  25. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  26. Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).

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Cite This Article
Miller, E. R., O’Mara Schwartz, J., Cox, G., Wolfe, B. E. A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation. J. Vis. Exp. (160), e61149, doi:10.3791/61149 (2020).

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