Summary
שיטה של גידול כרוב הנבט ללא חיידקים פותחה המאפשרת לחוקרים להעריך כיצד מינים בודדים או קהילות מיקרוביאלית מינים אינטראקציה על משטחים עלה כרוב. תמצית ירקות סטרילית מוצגת גם אשר ניתן להשתמש כדי למדוד משמרות בקומפוזיציה קהילתית במהלך תסיסה הירקות.
Abstract
The phyיוסה, החלק הקרקע מעל הצמח שיכול להיות הקולוניה על ידי חיידקים, היא מערכת מודל שימושי כדי לזהות תהליכים של האסיפה הקהילה חיידקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת לחקר הדינמיקה הקהילתית מיקרוביאלית של צמחי כרוב נאפה. הוא מתאר כיצד לצמוח צמחים ללא חיידקים בצינורות הבדיקה עם חימר calcined המצע הציר התזונתי. החיסונים של צמחים ללא חיידקים עם תרבויות מסוימות של חיידקים מספקים הזדמנויות למדוד צמיחה חיידקים ודינמיקה קהילתית ב phyיוסה. באמצעות תמצית ירקות סטרילית המיוצרים ממשמרות כרובים בקהילות מיקרוביאלית המתרחשות במהלך החימוץ ניתן גם להעריך. מערכת זו פשוטה יחסית וזולה להקים במעבדה וניתן להשתמש בה לטיפול בשאלות אקולוגיות מרכזיות בהרכבה קהילתית מיקרוביאלית. הוא גם מספק הזדמנויות כדי להבין כיצד הרכב הקהילה phyיוסה יכול להשפיע על מגוון חיידקים ואיכות של fermentations ירקות. גישה זו לפיתוח קהילות הגנוטוביוטיקה כרוב יכול להיות מיושם על מינים אחרים הצמח פראי וחקלאי.
Introduction
מגוון מיקרוביאלית של ה phyיוסה ממלא תפקיד חשוב בשמירה על בריאות הצמח והוא יכול גם להשפיע על היכולת של צמחים לעמוד בלחץ סביבתי1,2,3,4,5. בתורו, בריאות היבול משפיע ישירות על בטיחות המזון ואיכות6,7. צמחים לשחק תפקיד בתפקוד המערכת האקולוגית ואת microbiomes המשויכים שלהם הן משפיעות על היכולת של צמחים לבצע פעילויות אלה, כמו גם השפעה ישירה על הסביבה עצמה8. בעוד מדענים החלו לפענח את הפונקציה ואת ההרכב של phyיוסה, התהליכים האקולוגיים המשפיעים על האסיפה הקהילתית של הפילוספירה לא מובנים לגמרי9,10. מיקרובידום phyיוסה היא מערכת ניסיונית מעולה לחקר האקולוגיה של microbiome11. קהילות אלה פשוטות יחסית ורבים מחברי הקהילה יכולים לגדול בתקשורת מעבדה סטנדרטית10,12,13.
ירקות תוססים הם מערכת אחת שבה למבנה הקהילתי של הפיללספירה יש השלכות חשובות. הן בכרוב החמוץ ובקימחי, החיידקים המתרחשים באופן טבעי על עלי הירק (מינים של כרוב כרוב ) משמש כרשת החימוץ לתסיסה14,15. חיידקים חומצה לקטית (LAB) נחשבים חברים בכל מקום של microbiomes ירקות, אולם הם יכולים להיות בשפע נמוך ב phyיוסה כדור16. בחירה מוצקה חזקה במהלך התסיסה כוננים משמרת בקומפוזיציה של הקהילה מיקרוביאלית המאפשרת לחיידקים חומצת חלב להגדיל בשפע. כמו המעבדה לצמוח, הם מייצרים חומצה לקטית אשר יוצר את הסביבה חומצי של מוצרי ירקות תוססים17. הקשר בין phyיוסה ואת התסיסה מספק הזדמנות להשתמש בירקות כמודל כדי להבין כיצד microbiomes בנויים.
פיתחנו שיטות לגדל חיידקים בעלי כרוב נאפה ולאפשר להם לחסן אותם עם קהילות מחיידקים ספציפיים באמצעות בקבוקי ריסוס. זוהי שיטה זולה ואמינה של שווה לדבר על כרוב עם חיידקים בודדים או קהילות מעורבות. תמצית ירקות סטרילית (SVE) פותחה גם משלושה סוגים שונים של כרוב/זנים: כרוב אדום וירוק(כרוב)וכרוב נאפה (ב. ראפא). תוספת המלח לאלה משכפל את סביבת התסיסה ומאפשרת מחקרים ניסיוניים בהיקפים קטנים ובקצב גבוה יחסית של הרכבה מיקרוביזום תסיסה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הרכבה קהילתית מיקרוביאלית בתחום הפילולספירה, וכיצד ניתן לקשר בין הדינמיקה הקהילתית של מיקרוביאלית להצלחת התסיסה הצמחית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול כרובים ללא חיידקים
- הכנת ציוד לגידול כרובים ללא חיידקים
- ניקוי החימר המכונה להסרת חלקיקי אבק משובחים
- לשטוף חימר המכונה (טבלת חומרים) לפחות 3x עם מים ברז; רוקן את המים.
התראה: פלסטלינה מייצרת אבק משובח מאוד ומומלץ לחבוש מסכת הגנה (שולחן חומרים) בעת הכביסה. - התפשטות חימר calcined החוצה כשכבה דקה (~ 4 ס מ) לתוך מגש החיטוי והחיטוי על מחזור יבש (121 מעלות צלזיוס עבור 20 דקות ו 20 דקות ייבוש זמן) כדי לחטא.
- הניחו לחימר להתייבש במלואו לפני השימוש על-ידי הפצת המגשים והצבת בחממה חמה (30-37 ° c) לפחות שבוע. מערבבים כדי לערבב כל 3 ימים כדי לייבש באופן מלא את חימר calcined כך הוא יספוג כמות אפילו של מורראשיג ו Skoog (MS) ציר מזינים (סעיף 1.2).
הערה: ייבוש גם עוזר לשמור על נפח של חימר calcined גם כאשר הוא שקול לתוך צינורות. ייבוש באמצעים אחרים, כגון תנור ייבוש, יהיה גם מתאים.
- לשטוף חימר המכונה (טבלת חומרים) לפחות 3x עם מים ברז; רוקן את המים.
- ניקוי כלי הזכוכית לגידול כרובים ללא חיידקים
- לנקות ולעקר ביסודיות את צינורות הזכוכית (טבלת חומרים) בין כל שימוש. להשרות צינורות עבור 30 דקות ב 30% תמיסת אקונומיקה ולשטוף היטב עם מי ברז לפני ניקוי בשטף חומצה על הגדרת בדיקות. חומצה-לשטוף כובעי בדיקה דוכיוון (טבלת חומרים) בין שימושים.
- זרעי כרוב מחוטא
- מקום עד 100 כרוב נאפה (ב. ראפה var pekinensis) זרעים בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
הערה: הוספת יותר מ 100 זרעים לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד או שינוי גודל הצינור עשוי להשפיע על שיעורי נביטה של הזרעים עקב חוסר הסרת מעיל זרעים. - הוסף 1 מ ל של 70% אתנול לזרעים ומערבולת עבור 5 דקות. להיפטר אתנול באמצעות פיפטה.
- הוסף 1 מ ל של 50% אקונומיקה ומערבולת עבור 5 דקות. למחוק את פתרון אקונומיקה באמצעות פיפטה.
- הוסיפו 1 מ ל של מים ומערבולת אוטומטיים במשך 5 דקות. להשליך את המים מוכי באמצעות פיפטה.
- חזור על השלב 1.1.3.4 3x לשטוף את כל אקונומיקה. משרים את הזרעים במים מעוקרים ועקרים עבור 2-8 שעות לפני שתילת לריכוך מעיל הזרע.
- מקום עד 100 כרוב נאפה (ב. ראפה var pekinensis) זרעים בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
- ניקוי החימר המכונה להסרת חלקיקי אבק משובחים
- גידול כרובים ללא חיידקים
הערה: כרוב נאפה (נולד ב-ראקיאר פקינאנסיס) מגודלים בצינורות זכוכית (15 ס"מ x 2.5 ס מ) המכילים חימר שנספג ב מורראשיג ו Skoog (MS) מרק מזינים (איור 1).- שוקל 10 גר' חימר calcined נקי לתוך צינור זכוכית נקייה (15 ס"מ x 2.5 ס מ).
- הכינו ציר תזונתי MS על ידי המסת 4.4 g של MS מדיום ב 1 L של מים מנולים. הוסף ציר מזינים MS (~ 9 מ"ל) על כל צינור זכוכית לכסות את חימר calcined באמצעות פיפטה.
הערה: עומד נוזל בצינור ימנע את הזרע מן המונטינג כך שהוא עשוי להיות benecessary כדי להוסיף מעט פחות MS ציר לצינורות כמה. - שפופרות זכוכית כיפה באופן רופף עם 22 מ"מ כמוסות מבחנה בשתי כיוון וכובעים (121 ° c עבור 60 דקות). בעת הסרתם מן החיטוי, לדחוף כובעים על צינורות זכוכית כדי לאטום אותם. צינורות מגניב לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- בעדינות למקם אחד זרע כרוב סטרילי למרכז של כל צינור באמצעות סטרילי, בתוספת ארוכה (25.4 ס מ) מלקחיים. מניחים את הצינורות במגש של 7 כיוון ולאחר מכן מניחים תחת מתלה קל (ספקטרום מלא T5 נורות פלורסנט או הגדרת תאורה אחרת לצמיחה צמח) עם מחזור 16 h האור ב 24 ° c.
הערה: זרעים לנבוט לילה ולפתח עלה האמיתי הראשון שלהם אחרי 5 ימים. עלה אמיתי הוא העלה כלי הדם הראשון לאחר שנוצרו הקוטונים. יש לו קצה מקומט יותר וברוב הכרוב מכוסה trichomes.
- בדיקת עקרות של כרובים ללא חיידקים
הערה: כדי לבדוק אם הכרובים הם ללא חיידקים, בחרו מספר כרוב (5 עד 10) מכל אחת מהאצווה והלוח כדי לקבוע אם קיימים מושבות מסוימות.- בעדינות להסיר את הכרוב מצינורות זכוכית על ידי מרתק את הבסיס של הצמח עם מלקחיים מעוקר ומושך אותו החוצה. לפני הסרת כרוב במלואו מן הצינור, לחתוך בזהירות את השורשים באמצעות מספריים לחיתוך מעוקר. לדחוס את הכרוב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
הערה: כרובים גדולים יותר עשויים לדרוש הסרת אחד או שניים העלים הגדולים בעוד הכרוב הוא עדיין בצינור כדי להקל על הפיכת כרוב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. אלה עלים גדולים ניתן להוסיף לצינור 1.5 mL לאחר שאר הכרוב הונחו לתוך הצינור אם הכרוב כולו נדרש. - הוסף 400 μL של תמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS) לכל שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. בעזרת מיקרופטסל סטרילי, המגון משתמש בכרוב על ידי לימון 30x.
- לוחית 100 μL של כרוב המגון אכלו על צלחות אגר כדי לקבוע אם יש מזהמים כלשהם במדגם. רוב החיידקים שנמצאו ב-phyיוסה יגדלו על צלחות סויה טריטיות (TS) אגר. השתמש בטיפים לשימוש נרחב בצינורות כאשר כרוב הציפוי המגון כרוב כרוב לאכול עבה והוא יכול לסתום את הטיפים בצנרת רגילה.
- בעדינות להסיר את הכרוב מצינורות זכוכית על ידי מרתק את הבסיס של הצמח עם מלקחיים מעוקר ומושך אותו החוצה. לפני הסרת כרוב במלואו מן הצינור, לחתוך בזהירות את השורשים באמצעות מספריים לחיתוך מעוקר. לדחוס את הכרוב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
2. המשך מענה לפיטוספירה עם פתרונות מיקרוביאלית
- הכנת גליצרול למלאי החיסונים
הערה: טבלה 1 מפרטת את החיידקים שניתן להשתמש בהם בשלב זה. ניתן להשתמש כאן גם בבודד phyיוסה אחרים.- בצפיפות החוצה מושבות בודדות מתוך פס טרי, אל שתיים/שלוש צלחות חדשות של אותו מדיה כדי לקבל הרבה מושבות.
- בואו לגדול הפסים עבור 2-5 ימים לאחר מכן לגרד מושבות מכל הצלחות לתוך שפופרת של 15 מ ל המכיל 15 מ ל של 15% גליצרול, ומערבולת לערבב ביסודיות.
- העברת סדרת מחלקים של 1 מ ל של מלאי מעורב היטב גליצרול לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולאחסן מניות גליצרול ב-80 ° צ' עד השימוש. שמרו את הנותרים 14 מ ל של מלאי גליצרול ב-80 ° צ' כמויות גדולות יחסית של פתרון חיסונים נדרשים כאשר מנווים כרובים.
- שבוע לפני השימוש, להפשיר את הצינור 1.5 mL המכיל 1 מ ל של גליצרול מלאי (משלב 2.1.3) על קרח, לדלל, ואת הצלחת בכמה מדלל שונים (g., 10-4, 10-5, ו 10-6) כדי לקבוע את הריכוז (יחידת המושבה ויוצרים [cfu] לכל μ
- בקבוקי ספריי לחיטוי
- לפרק את הכתום סביב בקבוקי משאבת בוסטון (59 mL) ולהשרות את כל הרכיבים (משאבה, צינור, כובע ובקבוק) ב 30% תמיסת אקונומיקה עבור 30 דקות במיכל פלסטיק גדול עם מכסה הולם היטב.
- לאחר הטבילה, שופכים בזהירות את כל האקונומיקה מן המיכל על ידי הרמת רק פינה אחת של המכסה של המיכל.
- שטפו את הבקבוקים על ידי מילוי מיכל הפלסטיק במים מפוהים באופן אוטומטי (~ 1 L תלוי בגודל המיכל) ובזהירות לשפוך מים מפוהים, שוב על ידי הרמת המכסה בפינה אחת.
- לחטא את הקבינט אבטחה טיחות על ידי ריסוס עם 70% אתנול פתרון והפעלת אור UV עבור 30 דקות.
הערה: המשיכו בעבודה זו בארון הביובטיל, כך שאין כל סיכון לזיהום מחיידקים של הבקבוקים כאשר הם יבשים. - הסירו בקבוקים ממיכל הפלסטיק הגדול ומלאו כל בקבוק במים מפוהים באמצעות פיפטה. לכנס את המשאבות ולמקם אחד בכל בקבוק. משאבה את המים הדימיים דרך כל בקבוק (10 תרסיסים לכל בקבוק) כדי להסיר אקונומיקה מרכיב המשאבה של הבקבוק.
- חזור על השלב 2.2.5 כדי לוודא שכל האקונומיקה יוסר מבקבוקי הזכוכית.
- בדוק אם בקבוקים סטרילי על ידי הצבת מספר על כל בקבוק (דבק קלטת המעבדה בצד של הבקבוק כאשר הוא יבש לגמרי) ולאחר מכן להוסיף 10 מ ל של 1x PBS לכל הבקבוקים ומשאבה 3 תרסיסים על צלחת TS אגר. לאחר הריסוס, מודסת את הצלחות לשבוע אחד בטמפרטורת החדר. אם מושבות כלשהן לגדול על צלחת זה מראה כי הבקבוק המתאים לא סטרילי ולא צריך לשמש ניסויים.
- לפני שאתם מאחסנים את הבקבוקים הסטריליים, מסירים את כל ה-PBS ומאפשרים לבקבוקים להתייבש ביסודיות בארונית הביובטיחות. אחסן בקבוקים סטריליים במיכל פלסטיק סטרילי (בדרך כלל המיכל המשמש להלבנת הבקבוקים) עד השימוש.
- הכנת החיידקים וריסוס כרובים ללא חיידקים
התראה: יש לבצע את כל השלבים בארונית ביולוגית, משום שהריסוס מאפשר את פתרונות החיידקים שיכולים לזהם את משטחי העבודה או להוות סיכון בריאותי אם יבוצע על ספסל מעבדה.
הערה: כרובים יוצרים עלים אמיתיים לאחר 5 ימים, לכן רצוי להמתין שבוע לאחר שתילת הכרוב לפני שהוא מדבר עם פתרונות מיקרוביאלית. כאשר הצינורות חתומים, אין צורך להשקות את הכרובים. ניסויים מבוצעים ביותר תוך חודש של נטיעת, כמו צינורות קטנים להגביל את צמיחת הכרוב.- הפשרת מניות גליצרול על קרח ולדלל ב-1x PBS אל הריכוז הרצוי החיסון (הריכוז נקבע על ידי התפחסותו וציפוי של 1 mL בשלב 2.1.4).
הערה: ניתן להשתמש במגוון רמות חיסון שונות, אך מבודד מסוג phyיוסה יכול לצמוח מ-104 עד 108 מטרים של כרוב בתוך 10 ימים. - הוסף 10 מ ל של מלאי גליצרול מדולל לבקבוק משאבת סטרילי ומשאבה 5 תרסיסים לתוך הגביע הגדול אוסף פסולת כדי להסיר את כל PBS שיורית מרכיב משאבת בקבוק.
- הסר את המכסה מצינור כרוב, להטות את הכרוב כלפי בקבוק ספריי, ולרסס כל כרוב עם 3 משאבות של פתרון החיסונים, אשר מספק ~ 600 μL של האינת.
- לאחר שהוא מדבר, הקציר מערכת משנה של הכרובים כדי להעריך את הריכוז של קלט בפועל. להסיר את הכרוב מצינור עם מלקחיים מעוקר. לחתוך את השורשים עם מספריים לחיתוך סטרילי ולאחר מכן בזהירות למקם את הכרוב בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי מראש 1.5 mL. להקליט את המשקל של כרוב לחישובים עתידיים אם הדפוס/g של כרוב נדרש עבור חישובים.
- הוסף 400 μL של הערוץ 1x כדי כל שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL המכילה כרוב ולהשתמש micrope, סטרילי כדי המגון לסדר את הכרוב לתוך ה-PBS 1x ידי שיוף זה 30x.
- לדלל כרוב המגון (אם נדרש) ולוחית את תערובת כרוב שורק. השתמש בטיפים מלאים ללטף את הכרוב, כי זה יהיה עבה ומלא של חתיכות רקמה צמח.
- הפשרת מניות גליצרול על קרח ולדלל ב-1x PBS אל הריכוז הרצוי החיסון (הריכוז נקבע על ידי התפחסותו וציפוי של 1 mL בשלב 2.1.4).
3. הכנת תמצית ירקות סטרילית
הערה: שיטה זו היא גרסה שונה של ייצור מדיה סטרילית כרוב18,19.
- . לרכוש כרוב מסופרמרקט במעבדה, להסיר ולמחוק את העלים החיצוני של הכרוב. קוצצים את כל הכרוב הנותרים כדי להתאים לבלנדר המגון כרוב לעיסה קנס, כלומר, כרוב לא יקבל כל טוב יותר עם מיזוג נוסף.
הערה: כל בלנדר אשר יכול לקצוץ כרוב לעיסת הומוגנית חלקה צריך להיות מתאים לשיטה זו. - שוקלים את כרוב ממוזג לאכול ולהוסיף 2 מ ל של מים מזוקקים לכל גרם של כרוב. מסננים את הכרוב הממוזג באמצעות 2 שכבות של מסנני קפה סל (נייר לא מולבן).
- לוותר על הכרוב כרוב לתוך צינורות צנטריפוגה (גודל תלוי בצנטריפוגה). צנטריפוגה את הכרוב כרוב מסוננים ב 20,000 x g עבור 20 דקות עד חלקיקים גדולים ליישב את הפתרון.
הערה: הכרחי לצנטריפוגה את הכרוב כרוב במשך תקופה ארוכה כאשר חלקיקי כרוב מסננים במהירות את מסנן הפילטר. - באמצעות הצינורות הסרולוגיים, להסיר את הסופרנטאנט מן הפסולת כרוב כרוב מטפלת לא להפריע כרוב הפלטד. אם במטרה ליצור מחדש תנאי תסיסה בהם ריכוזי מלח סטנדרטיים משמשים, להוסיף 2% w/v בשלב זה (כלומר, לפני הסינון עיקור).
- מסנן לעקר את תמצית ירקות באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר (500 mL או 1 L) מחובר ואקום. מדבקות לצינורות סטריליים (או שפופרות צנטריפוגה מ-50 mL או 15 מנורות צנטריפוגה) ומקפיאים ב-80 ° צ' עד השימוש.
4. חיסון לתמצית ירקות סטרילית
- הפשרת SVE ולוותר 490 μL לתוך 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות. השתמש בצינורות מספיקים כדי לקבל לפחות חמש משכפל לכל טיפול לכל נקודת זמן, כאשר כל מדידה של נקודת זמן היא הרסנית.
- הפשרת מלאי גליצרול של מיקרוביאלית מבודד על הקרח לדלל עם 1x PBS לריכוז הרצוי. הריכוז של חיידקים חומצה לקטית יכול להיות נמוך כמו 5,000 CFU לכל mL של SVE. כדי להשיג ריכוז זה, לדלל את המניות 250 CFUs/μL מכיוון 10 μL ישמש עבור חיסונים של נפח כולל של 500 μL.
- מחסן SVE עם 10 μL של בידוד חיידקים מדולל. הפיפטה עולה ויורדת כמה פעמים כדי לערבב ביסודיות. מודטה בטמפרטורה הרצויה (14 ° צלזיוס לטמפרטורת הייצור של קמחי או 24 ° c לתסיסה חמה בכרוב כבוש).
- שיעור מדידה של צמיחה של בידוד חיידקים ב SVE על ידי קצירת שכפול צינורות ביום 1, יום 2, יום 4, יום 7 ויום 14.
הערה: התסיסה ממשיכה במהירות בהתחלה ומאיטה לאורך זמן. לכן, לאחר שנקודות הזמן הראשוניות יותר מעניקה רזולוציה רבה יותר לדינמיקה של אופן ההכנסות של תסיסה. - בכל פעם, לערבב את הטוב SVE מחוסן על ידי מלטף למעלה ולמטה כמה פעמים. סרילית לדלל את SVE מחוסן ב-1x PBS ו צלחת על צלחות אגר. מודאת צלחות אגר עבור 4-7 ימים לפני ספירת המושבות.
הערה: אדם, רוגוסה, ו שארפ (גברת) אגר יש להשתמש כדי לספור את כל החיידקים חומצה לקטית, peptone שמרים דקסטרוז (YPD) יש להשתמש עבור שמרים, ו-TS אגר עבור החיידקים האחרים רוב מבודד מתוך phyיוסה הספירה. - הקלט את ה-pH של דגימות בכל פעם באמצעות בדיקה מיקרו pH.
הערה: שלב זה צריך להתבצע לאחר הציפוי כי הבדיקה pH יעביר תאים בין צינורות/טיפולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיעורי צמיחה של כרובים נאפה
שיטת סירוס הזרעים נבדקה עם מספר כרוב של נאפה (ב. ראפא בר פקינז; משלימה איור 1) ממספר ספקים שונים וכולם גדלו בעקביות עם קצבי צמיחה דומים. עם זאת, בדיקת השיטות עם מינים שונים של הכרוב (ב. ראפא: העליון הסגול לפת; B. oleracea: קהיר היברידי, היברידית ענק טרופי; ב. קאמסטרis: פאק צ'וי טוי choy היברידית; ב. יונמית: ענק אדום חרדל) נתן הצלחה מוגבלת (איור משלים 2). בניגוד כרוב נאפה המהווה ברוטות קומפקטית מסודר המתאימים לתוך צינורות הזכוכית , הכרוב האלה spp. או שיעורי נביטה נמוכים לאחר עיקור או גבעול מוארך במהירות כדי להפוך את הצמח בצורה בלתי בריאה. בנוסף, לחיטוי זרעים ישנים יותר (> בן שנה) לא מומלץ כמו מעילים הזרע יבש הופך את זה קשה יותר להסיר אותם בתהליך העיקור. באופן קבוע לרכוש זרעים חדשים ולבדוק תת קבוצה של כרובים כדי לקבוע אם הם סטרילי לפני ביצוע ניסויים.
צמיחה של חיידקים בתוך הכרוב הרוקולספירה של נאפה
מבודד מחיידקים (שולחן 1) חוסנו או כמו זן יחיד מבודד או בשילוב עם בודד אחר לחפש אינטראקציות זיווגים בתוך הכרוב כרוב נאפה. סך של 15 כרובים ללא חיידקים חוסנו עבור כל טיפול וחמישה כרובים נקצרו מיד לאחר החיסון, חמישה נקצרו ארבעה ימים לאחר החיסון, והנותרים נקצרו 10 ימים לאחר החיסון. תוצאות מראות כי phyיוסה מבודד מסוגלים לצמיחה מהירה בתוך הכרוב כרוב נאפה (איור 2).
צמיחת מיקרוביאלית של חיידקים בתמצית ירקות סטרילית
שני ייאס (קאזאצ'ניה בררוטי ו pichia membranifaciens) ושלושה חיידקים (לקטטבק koreensis, גמלון הפאקקוקוס, ו leuconostoc) היו מחוסן לתוך שלושה סוגים שונים של sve עשוי אדום, ירוק, כרוב נאפה. כל הדגימות היו מודבטים ב -24 ° c וצמיחה של האינופונים מעל 14 ימים נרשם על ידי ציפוי ספוט 5 μL של כל טיפול על הצלחות או גברת YPD אגר (n = 5). תוצאות מוצגות באיור 3א. ה-pH של כל דוגמה נרשם גם בכל התסיסה (איור 3ב) ומראה כי חיידקים חומצה לקטית היו מסוגלים לacidifying את sve אל רמות מתחת ל-pH 4 (המציין את התסיסה כי הוא בטוח לצריכה).
איור 1: דיאגרמה של הגדרת כרוב ללא חיידקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שיעורי צמיחה של חיידקים שונים על חיידקים כרוב נאפה. (א) גידול של מנוכי בודד בתחום הפיליוסה. (ב) הצמיחה לאחר שהפך שני חיידקים לתוך הפיטוספירה. הצמיחה של חיידקים נמדד כמושבה להרכיב יחידות שנספרו g של הומומטר כרוב מצופה על או או או גברת מדיה. n = 5. קווי שגיאה = סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צמיחה של חיידקים חומצת חלב ועוד בתמצית ירקות סטרילית (SVE) עשה עם אדום, ירוק כרוב נאפה. (א) הצמיחה של מיקרוביאלית של חיידקים נמדדה על ידי ספירת מושבה היוצרים יחידות ל-mL של מצופה sve. לייטס היו מצופה לוחות YPD אגר וחיידקים על לוחית של גברת אגר. (ב) חמצה של תמצית ירקות סטרילית כמו חיידקים לגדול המוצג כסתיו pH. n = 5. קווי שגיאה = סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| Phyla/Genera של חיידקים | מקור חיידק |
| מקרתגו | פילוספירה |
| מקרתגו | תסיסה |
| פרוטאובקטריה | פילוספירה |
| פרוטאובקטריה | פילוספירה |
| פרוטאובקטריה | פילוספירה |
שולחן 1: מחיידקים מבודד מחוסן על כרוב נאפה ללא חיידקים.
משלים איור 1: גידול כרוב בצורת הדגל הגדול: bilko בתנאים ללא חיידקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 2: זנים כרוב שונים הגדלים בתנאים ללא חיידקים. (א) ב. ראפה: העליון הסגול לפת, (ב) b. oleracea: קהיר היברידי, (ג) b. היברידי: טרופי ענק היברידית, (ד) ב. קמפסטרין: פאק צ'וי צעצוע choy היברידית, (E) ב. ג'ונמית : ענק אדום חרדל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נבט ללא חיידקים צמחים כרוב נאפה שימשו כדי ללמוד הגבלת הפיזור של חיידקים חומצה לקטית בתוך הכרוב נאפה phyיוסה17. נבט חינם נאפה כרובים יכול לשמש גם כדי לבדוק את הצמיחה בודדים או זוג ביותר ב phyיוסה (איור 1). שיטות להכנת תמצית ירקות סטרילית נבדקה עבור שלושה זנים שונים של כרוב: אדום, ירוק ו נאפה. כל אחד מאותם משמשים כאמצעי צמיחה אמינים; חיידקים מחוסן לצמוח בעקביות על פני אמצעי התקשורת השונים. זן אחד שיעורי גדילה ב SVE (איור 2) להראות כי המעבדה לצמוח במהירות ולacidify את התקשורת באותו אופן שצפוי בתוך תסיסה17.
צמחים ללא נבט ותמצית ירקות סטרילית ניתן להשתמש בשילוב כדי לטפל במספר שאלות אקולוגיות שונות כגון השפעות בעדיפות ורצף בתוך הפיליוסה או התסיסה. קהילה סינתטית של חיידקים הוא פשוט לבנות דרך ציפוי כרוב הומוגניים כדי להשיג phyיוסה מבודד, או כרוב כבוש להשיג חיידקים חומצה לקטית16. זיווגים-אינטראקציות או לעזוב-ניסויים חד-אאוט עם חברי קהילה יותר ניתן לבצע בתוך phyיוסה או ב SVE כדי להעריך את החשיבות או התפקוד של חברי הקהילה. לימודי איכות הסביבה ניתן לבצע ב SVE שבו ההשפעה של הירק מותסס ניתן להעריך. יש גם פוטנציאל להשתמש הן כרובים ללא חיידקים ו SVE לכמת גיוון של מינים וקהילות מיקרוביאלית באמצעות האבולוציה ניסיוני.
מגבלה של מערכת הכרוב נטול החיידקים הזאת היא ציר הזמן הקצר של הניסויים. בגלל צינורות זכוכית קטנים המשמשים, הכרובים אינם מסוגלים לצמוח לתקופות ארוכות יותר מחודש כמו העלים שלהם מוגבלים על ידי קצה הצינורות. ניתן להשתמש במכולות גידול גדולות יותר, כגון תיבותהתרבות שלרקמת הצמח (טבלת חומרים), אך אלה עדיין לא ייצרו מפעל כרוב בגודל מלא. ניסינו גם לגדל כרובים ב 0.75% אגר המכיל ציר MS, אבל מצא כי זה הפיק צמיחה לא עקבית של שתילי כרוב. באמצעות חימר calcined כמצע גדל עם מספיק ציר MS כדי הרוויה אבל לא המבול גרגרי חימר היא השיטה האופטימלית לגידול כרובים בריאים.
ישנם כמה צעדים קריטיים כדי להבטיח צמיחה מוצלחת של כרובים ללא חיידקים. להבטיח כי חימר calcined הוא יבש לחלוטין בעת הוספת ציר MS מאפשר חימר לקלוט במלואו את ציר MS במהלך מחזור האוטוקלב. עם זאת, אם יש ציר MS על פני רמת החימר, יש להסירו לפני הוספת הזרעים; זרעים לא לנבוט אם הם יושבים בציר MS. צעד חשוב נוסף לפקח הוא הזרע עיקור. זרעים ישנים יותר (> 1 בן) לא לנבוט במהירות או מהימנה כמו זרעים צעירים. שינוי גודל הצינור המשמש עיקור או מילוי יתר של צינורות יכול גם להשפיע עיקור. שלב העיקור מסייע גם לריכוך ולהסרה של מעיל הזרע כך שהזרעים מתנבוט במהירות. הערה כאן שימוש חוזר בבקבוקי תרסיס המשאבה לאחר שימוש בתרביות חיידקים אינו מומלץ, משום שקשה להסיר ביואילאמים מרכיב המשאבה. מתוך הערה מיוחדת, יש לנקוט זהירות עם מינים של מקרתגו כאשר הם גמישים במיוחד לאוטוקלינג. כל בקבוקי משאבה שבאו במגע עם מקרתגו spp לא נעשה שימוש חוזר.
בעוד תמצית ירקות סטרילית אין מבנה מרחבי הנמצא בתוך כלי תסיסה, הדינמיקה הצמיחה של LAB מציע כי הוא מחקה התקדמות תסיסה עם ירידה מהירה ב-pH ועלייה בצמיחה של חיידקים חומצה לקטית על 14 ימי תסיסה. מעבר התסיסה הוא חשוב בתחילת החימוץ והוא גדל בשפע במהירות רבה יותר מאשר לקטצילוס ו- "ספפ ", מגמה שנראתה בסקרים אחרים של כרוב כבוש20,21. עבודה במעבדה גם חקר באמצעות ספקטרוסקופיה כדי להשיג צפיפות אופטית (OD) קריאות למדידת הצמיחה של המעבדה ב SVE מחולקת לצלחות 96. תוצאות ראשוניות עם תמצית כרוב נאפה נראה מבטיח, אבל SVE עשה עם לחלץ כרוב אדום צבע שונה כמו ה-pH ירד וכתוצאה מכך קריאות OD מבולבל. יתר על כן, שימוש בקריאות OD כדי לספור את גבולות הצמיחה את השימוש במערכת זו כדי מאמץ יחיד החיסונים. יחד, מגבלות אלה הובילו אותנו לזנוח את השימוש בקריאות OD כדי למדוד את הגידול בחיידקים.
בדיקת אינטראקציות אקולוגיות ב phyיוסה הוא אקטואלי כמו שיש ראיות כי phyיוסה משפיע על בריאות צמח יבול ופרודוקטיביות22. מערכת המודל שלנו פותחה רק כדי לעבוד עם כרוב נאפה, אבל בקטריה של phyla פרוטאובקטריה, firmicutes ו כחוליות שכיחים בתחום phyla של מינים צמחים רבים13,23. בעוד שלושה זנים שונים של כרוב נבדקו, SVE ניתן לעשות עם צמחים חקלאיים חשובים אחרים. לדוגמה, ניתן לשכפל מחקרים החוקרים הרכבה של הקהילה במהלך תסיסה של מיץ גזר24 או התיישבות מיקרוביאלית של שורש תירס25 באמצעות הפרוטוקולים המפורטים במאמר זה.
זיווג של כרוב נטול חיידקים עם SVE ללמוד האסיפה הקהילה בתסיסה יכול להראות איך שינויים מיקרובידום phyיוסה יכול להשפיע על הצלחת התסיסה. Spoilage של תסוס או כישלון להגיע pH נמוך מספיק יכול לנבוע אם אין חמצה הראשונית מהירה26. אלה תסוס מקולקל עשוי להיות בשל תהליכי ייצור, אבל וריאציה במיקרו מיקרובידור של phyיוסה עשויה גם להיות השפעה חשובה על ההצלחה של צמחי ירקות17. המערכת המתוארת היא מודל שימושי לקביעת מה תהליכי ההרכבה microbiome עשוי להשפיע על ההצלחה של תסיסה הירקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו תמכה במענק משרד החקלאות-NIFA: 2017-67013-26520. טרייסי דבנפורט וקלייר פוגן סיפקו תמיכה טכנית ורובי יה וקייסי Cosetta לספק הערות מועילות על גרסאות מוקדמות של כתב יד זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
