Summary
Foi desenvolvido um método de cultivo de repolhos Napa sem germes que permite aos pesquisadores avaliar como espécies microbianas únicas ou comunidades microbianas multiespécies interagem em superfícies de folhas de repolho. Também é apresentado um extrato vegetal estéril que pode ser usado para medir mudanças na composição da comunidade durante a fermentação vegetal.
Abstract
A filosfera, a porção acima do solo da planta que pode ser colonizada por micróbios, é um sistema modelo útil para identificar processos de montagem comunitária microbiana. Este protocolo descreve um sistema para estudar a dinâmica da comunidade microbiana na filosfera das plantas de repolho Napa. Descreve como cultivar plantas livres de germes em tubos de ensaio com um substrato de argila calcinada e caldo de nutrientes. A inoculação de plantas livres de germes com culturas microbianas específicas oferece oportunidades para medir o crescimento microbiano e a dinâmica comunitária na filosfera. Através do uso de extrato vegetal estéril produzido a partir de repolhos, também podem ser avaliados os deslocamentos em comunidades microbianas que ocorrem durante a fermentação. Este sistema é relativamente simples e barato de ser criado em laboratório e pode ser usado para abordar questões ecológicas importantes na montagem da comunidade microbiana. Também oferece oportunidades para entender como a composição da comunidade da filosfera pode impactar a diversidade microbiana e a qualidade das fermentações vegetais. Essa abordagem para o desenvolvimento de comunidades de filosfera de repolho gnotobiótico poderia ser aplicada a outras espécies de plantas selvagens e agrícolas.
Introduction
A diversidade microbiana da fisfera desempenha um papel importante na manutenção da saúde vegetal e também pode influenciar a capacidade das plantas de suportar o estresse ambiental1,,2,3,4,,5. Por sua vez, a saúde das culturas impacta diretamente na segurança alimentar e na qualidade6,7. As plantas desempenham um papel no funcionamento do ecossistema e seus microbiomas associados afetam tanto a capacidade das plantas de realizar essas atividades como influenciam diretamente o meio ambiente8. Embora os cientistas tenham começado a decifrar a função e a composição da filosfera, os processos ecológicos que influenciam a montagem da comunidade microbiana da filosfera não são totalmente compreendidos9,,10. O microbioma da fisfera é um excelente sistema experimental para estudar a ecologia dos microbiomas11. Essas comunidades são relativamente simples e muitos dos membros da comunidade podem ser cultivados em mídia de laboratório padrão10,,12,,13.
Vegetais fermentados são um sistema onde a estrutura comunitária da filosfera tem consequências importantes. Tanto no chucrute quanto no kimchi, os micróbios que ocorrem naturalmente nas folhas vegetais (a filosfera da espécie Brassica) servem como o inóculo para a fermentação14,15. As bactérias do ácido láctico (LAB) são consideradas membros onipresentes de microbiomas vegetais, porém podem estar em baixa abundância na fisfera16. Uma forte seleção abiótica durante a fermentação impulsiona uma mudança na composição da comunidade microbiana, permitindo que as bactérias do ácido láctico aumentem em abundância. À medida que o LAB cresce, eles produzem ácido láctico que cria o ambiente ácido de produtos vegetais fermentados17. A ligação entre a fisfera e o fermento proporciona uma oportunidade de usar vegetais como modelo para entender como os microbiomas são estruturados.
Desenvolvemos métodos para cultivar repolhos Napa sem germes e inocula-los com comunidades microbianas específicas usando garrafas de spray. Trata-se de um método barato e confiável de inocular uniformemente o repolho com micróbios individuais ou comunidades mistas. Um extrato vegetal estéril (SVE) também foi desenvolvido a partir de três tipos/variedades diferentes de repolho: repolho vermelho e verde(Brassica oleracea) e repolho Napa (B. rapa). A adição de sal a essas PMEs replica o ambiente de fermentação e permite estudos experimentais de pequena escala e relativamente de alto rendimento da montagem de microbioma de fermentação. Esses métodos podem ser usados para estudar a montagem da comunidade microbiana na filosfera e como a dinâmica da comunidade microbiana na filosfera pode estar ligada ao sucesso da fermentação vegetal.
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Protocol
1. Repolhos sem germes
- Preparando equipamentos para o cultivo de repolhos sem germes
- Limpeza da argila calcinada para remover partículas de poeira fina
- Enxágüe argila calcinada(Tabela de Materiais) pelo menos 3x com água da torneira; drenar água.
ATENÇÃO: A argila calcinada produz pó muito fino e recomenda-se usar uma máscara protetora(Tabela de Materiais)durante a lavagem. - Espalhe argila calcinada como uma camada fina (~4 cm) em uma bandeja de autoclave e autoclave em um ciclo seco (aquecimento de 121 °C por 20 min e 20 min de tempo de secagem) para esterilizar.
- Deixe a argila calcinada secar completamente antes de ser usada, espalhando-se em bandejas e colocando em uma incubadora quente (30-37 °C) por pelo menos uma semana. Mexa para misturar a cada 3 dias para secar totalmente a argila calcinada para que absorva uma quantidade uniforme de caldo de nutrientes Murashige e Skoog (MS) (seção 1.2).
NOTA: A secagem também ajuda a manter o volume de argila calcinada mesmo quando é pesada em tubos. A secagem por outros meios, como um forno de secagem, também seria adequada.
- Enxágüe argila calcinada(Tabela de Materiais) pelo menos 3x com água da torneira; drenar água.
- Limpeza dos vidros para o cultivo de repolhos sem germes
- Limpe e esterilize completamente os tubos de vidro(Tabela de Materiais)entre cada uso. Mergulhe os tubos por 30 minutos em solução de alvejante de 30% e enxágue bem com água da torneira antes de limpar em uma lavagem ácida em um ambiente de bacteriologia. As tampas do tubo de ensaio de lavagem a ácido(Tabela de Materiais)entre os usos.
- Sementes de repolho esterilizadoras superficiais
- Coloque até 100 sementes de repolho Napa(B. rapa var pekinensis) em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
NOTA: Adicionar mais de 100 sementes a um tubo de microcentrifuuge ou alterar o tamanho do tubo pode afetar as taxas de germinação das sementes devido à falta de remoção do casaco de sementes. - Adicione 1 mL de 70% de etanol às sementes e vórtice por 5 minutos. Descarte o etanol usando uma pipeta.
- Adicione 1 mL de alvejante de 50% e vórtice por 5 minutos. Descarte a solução de alvejante usando uma pipeta.
- Adicione 1 mL de água deionizada autoclavada e vórtice por 5 minutos. Descarte a água deionizada usando uma pipeta.
- Repita o passo 1.1.3.4 3x para enxaguar todo o alvejante. Mergulhe as sementes em água deionizada estéril por 2-8 h antes do plantio para suavizar a camada de sementes.
- Coloque até 100 sementes de repolho Napa(B. rapa var pekinensis) em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Limpeza da argila calcinada para remover partículas de poeira fina
- Cultivando repolhos sem germes
NOTA: Os repolhos napa(B. rapa var pekinensis) são cultivados em tubos de vidro (15 cm x 2,5 cm) contendo argila calcinada encharcada em Murashige e Skoog (MS) caldo de nutrientes(Figura 1).- Pesar 10 g de argila calcinada limpa em um tubo de vidro limpo (15 cm x 2,5 cm).
- Prepare o caldo de nutrientes MS dissolvendo 4,4 g de ms médio em 1 L de água deionizada. Adicione caldo de nutrientes MS (~9 mL) a cada tubo de vidro para cobrir a argila calcinada usando uma pipeta.
NOTA: O líquido em pé no tubo evitará que a semente germinasse para que possa ser necessário adicionar um pouco menos de caldo MS a alguns tubos. - Tampa solta de tubos de vidro com tampas de tubo de ensaio bidireis de 22 mm e autoclave (121 °C por 60 min). Ao removê-los da autoclave, empurre as tampas para os tubos de vidro para selá-las. Esfrie os tubos à temperatura ambiente antes de usar.
- Coloque suavemente uma semente de repolho estéril no centro de cada tubo usando fórceps estéreis e longos (25,4 cm). Coloque os tubos em uma bandeja de 7 vias e coloque sob racks de luz (lâmpadas fluorescentes T5 de espectro completo ou outra configuração de iluminação para crescimento da planta) com um ciclo de luz de 16 horas a 24 °C.
NOTA: As sementes germinam durante a noite e desenvolvem sua primeira folha verdadeira após 5 dias. Uma verdadeira folha é a primeira folha vascular depois que os cotilledons se formaram. Tem uma borda mais enrugada e em Brassica rapa é coberta de trichomes.
- Testes para esterilidade de repolhos sem germes
NOTA: Para testar se os repolhos estão livres de germes, selecione alguns repolhos (5-10) de cada lote e placa para determinar se há colônias culturais presentes.- Remova suavemente o repolho dos tubos de vidro, agarrando a base da planta com fórceps esterilizados e puxando-o para fora. Antes de remover o repolho totalmente do tubo, corte cuidadosamente as raízes usando uma tesoura de dissecção esterilizada. Compacte as folhas de repolho em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mL.
NOTA: Repolhos maiores podem exigir a remoção de uma ou duas das folhas maiores enquanto o repolho ainda está no tubo para facilitar a entrada do repolho no tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Estas folhas maiores podem ser adicionadas ao tubo de 1,5 mL depois que o resto do repolho tiver sido colocado no tubo se todo o repolho for necessário. - Adicione 400 μL de 1x de soro fisiológico tampão fosfato (PBS) a cada tubo de microcentrifus de 1,5 mL. Usando uma micropestle estéril, homogeneize o repolho por importunação de 30x.
- Placa 100 μL do repolho homogeneizar em placas de ágar para determinar se há algum contaminante presente na amostra. A maioria das bactérias encontradas na fisosfera crescerá em placas de ágar de soja trippática (TS). Use pontas de pipeta de orifício largo ao emplacar repolho homogeneizar, pois o repolho homogeneado é espesso e pode entupir pontas regulares de pipeta.
- Remova suavemente o repolho dos tubos de vidro, agarrando a base da planta com fórceps esterilizados e puxando-o para fora. Antes de remover o repolho totalmente do tubo, corte cuidadosamente as raízes usando uma tesoura de dissecção esterilizada. Compacte as folhas de repolho em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mL.
2. Vacinar a fisfera com soluções microbianas
- Fazendo estoques de glicerol de cepas de inoculação
NOTA: A Tabela 1 lista os isolados microbianos que podem ser usados nesta etapa. Outros isolados da fisfera também podem ser usados aqui.- Densamente, as colônias individuais saem de uma nova raia, em duas ou três novas placas da mesma mídia para obter muitas colônias.
- Deixe as listras crescerem por 2-5 dias e raspar colônias de todas as placas em um tubo cônico de 15 mL contendo 15 mL de 15% de glicerol, e vórtice para misturar completamente.
- Transfira uma alíquota de 1 mL do estoque de glicerol bem misturado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene os estoques de glicerol a -80 °C até usar. Salve os 14 mL restantes de estoque de glicerol a -80 °C, pois volumes relativamente grandes de solução de inoculação são necessários ao vacinar repolhos.
- Uma semana antes do uso, descongele o tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de estoque de glicerol (a partir do passo 2.1.3) no gelo, diluir e chapar em várias diluições diferentes (por exemplo, 10-4, 10-5e 10-6) para determinar a concentração (unidade formadora de colônias [UFC] por μL) da solução de inoculação de 14 mL.
- Esterilizando garrafas de spray de inoculação
- Desmonte as garrafas de bomba em volta âmbar de Boston (59 mL) e mergulhe todos os componentes (bomba, tubo, tampa e garrafa) em solução de alvejante de 30% por 30 minutos em um grande recipiente plástico com uma tampa bem encaixada.
- Após a imersão, despeje cuidadosamente todo o alvejante do recipiente levantando apenas um canto da tampa do recipiente.
- Enxágüe as garrafas enchendo o recipiente de plástico com água deionizada autoclaved (~1 L, dependendo do tamanho do recipiente) e despeje cuidadosamente água desionizada, novamente levantando a tampa em um canto.
- Esterilize um armário de biossegurança pulverizando com solução de 70% de etanol e ligando a luz UV por 30 minutos.
NOTA: Continue este trabalho no armário de biossegurança para que não haja risco de contaminação microbiana das garrafas à medida que secam o ar. - Retire as garrafas do grande recipiente plástico e encha cada garrafa com água deionizada autoclaved usando uma pipeta. Remonte as bombas e coloque uma em cada garrafa. Bombeie a água deionizada através de cada garrafa (10 sprays por garrafa) para remover alvejante do componente da bomba da garrafa.
- Repita o passo 2.2.5 para garantir que todo o alvejante seja removido das garrafas de vidro.
- Teste se as garrafas são estéreis colocando um número em cada garrafa (colando fita de laboratório ao lado da garrafa quando estiver totalmente seca) em seguida, adicione 10 mL de 1x PBS a cada uma das garrafas e bombeie 3 sprays em uma placa de ágar TS. Depois de pulverizar, incubar as placas por uma semana em temperatura ambiente. Se alguma colônia crescer em uma placa, indica que a respectiva garrafa não era estéril e não deve ser usada para experimentos.
- Antes de armazenar as garrafas estéreis, remova todos os PBS restantes e deixe as garrafas secarem completamente no armário de biossegurança. Armazene garrafas estéreis em um recipiente plástico estéril (tipicamente o recipiente usado para branquear as garrafas) até usar.
- Preparando o inóculo microbiano e pulverizando repolhos sem germes
ATENÇÃO: Todas as etapas devem ser executadas em um armário de biossegurança, pois a pulverização aerossóola as soluções microbianas que podem contaminar superfícies de trabalho ou representar um risco para a saúde se realizadas em um banco de laboratório.
NOTA: Os repolhos formarão folhas verdadeiras após 5 dias, por isso é aconselhável esperar uma semana após o plantio do repolho antes de vacinar com quaisquer soluções microbianas. Como os tubos estão selados, não há necessidade de regar os repolhos. Os experimentos são melhor realizados dentro de um mês após o plantio, pois os pequenos tubos restringem o crescimento do repolho.- Descongelar os estoques de glicerol no gelo e diluir em 1x PBS à concentração de inoculação desejada (concentração determinada por descongelamento e revestimento de uma alíquota de 1 mL na etapa 2.1.4).
NOTA: Uma variedade de diferentes níveis de inoculação pode ser usada, mas os isolados da filosfera podem crescer de 104 a10 8 UFC/mL de chorume de repolho em 10 dias. - Adicione 10 mL de caldo de glicerol diluído ao frasco de bomba estéril e bombeie 5 sprays em um grande béquer de coleta de lixo para remover qualquer PBS residual do componente da bomba de garrafa.
- Retire a tampa do tubo de repolho, incline o repolho em direção à garrafa de spray e pulverize cada repolho com 3 bombas da solução de inoculação, que fornece ~600 μL de inóculo.
- Após a inoculação, colher um subconjunto dos repolhos para avaliar a concentração real de inoculação de entrada. Remova o repolho de um tubo com fórceps esterilizados. Corte as raízes com uma tesoura de dissecção estéril e, em seguida, coloque cuidadosamente o repolho em um tubo de microcentrifuge estéril pré-varrido de 1,5 mL. Registo o peso do repolho para cálculos futuros se as CFUs/g de repolho forem necessárias para os cálculos.
- Adicione 400 μL de 1x PBS a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo repolho e use uma micropestle estéril para homogeneizar o repolho no PBS 1x moendo-o 30x.
- Diluir o repolho homogeneizar (se necessário) e aplacar a mistura de repolho pestled. Use pontas de orifícios largos para tubos de chorume de repolho, pois ele será espesso e cheio de pedaços de tecido vegetal.
- Descongelar os estoques de glicerol no gelo e diluir em 1x PBS à concentração de inoculação desejada (concentração determinada por descongelamento e revestimento de uma alíquota de 1 mL na etapa 2.1.4).
3. Preparar extrato vegetal estéril
NOTA: Este método é uma versão modificada da produção de mídia estéril de repolho18,19.
- Compre um repolho de um supermercado. No laboratório, remova e descarte as folhas mais externas do repolho. Pique todo o repolho restante para caber em um liquidificador e homogeneizar o repolho a uma polpa fina, ou seja, o repolho não ficará mais fino com mais mistura.
NOTA: Qualquer liquidificador que possa cortar repolho a uma polpa homogênea lisa deve ser adequado para este método. - Pesar o repolho misturado homogeneizar e adicionar 2 mL de água destilada por grama de repolho. Filtre o chorume de repolho misturado através de 2 camadas de filtros de café cesta (papel não abatado).
- Distribua o chorume de repolho em tubos de centrífuga (o tamanho depende da centrífuga). Centrifugar o chorume filtrado de repolho a 20.000 x g por 20 minutos até que grandes partículas se acalmem fora da solução.
NOTA: É essencial centrifugar o chorume de repolho por um longo período de tempo, pois as partículas de repolho entupiram rapidamente o esterilizador do filtro. - Usando uma pipeta sorológica, remova o sobrenante dos detritos de repolho pelleted tomando cuidado para não perturbar o repolho pelleted. Se tiver o objetivo de recriar condições de fermentação onde as concentrações de sal padrão são usadas, adicione 2% de c/v NaCl nesta etapa (ou seja, antes da esterilização do filtro).
- O filtro esteriliza o extrato vegetal usando um filtro de 0,2 μm (500 mL ou 1 L) ligado a um vácuo. Dispense em tubos estéreis (tubos centrífugas de 50 mL ou tubos de centrífugas de 15 mL) e congele a -80 °C até usar.
4. Inoculação de extrato vegetal estéril
- Descongele SVE e dispense 490 μL em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Use tubos suficientes para ter pelo menos cinco réplicas por tratamento por ponto de tempo, pois cada medição de ponto de tempo é destrutiva.
- Descongelar os estoques de glicerol de isolados microbianos no gelo e diluir com 1x PBS à concentração desejada. A concentração de bactérias de ácido láctico pode ser tão baixa quanto 5.000 UFC por mL de SVE. Para alcançar essa concentração, diluir os estoques para 250 UFC/μL, pois 10 μL serão utilizados para a inoculação de um volume total de 500 μL.
- SVE inoculada com 10 μL de isolante microbiano diluído. Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para misturar completamente. Incubar a temperatura desejada (14 °C para temperatura de produção de kimchi ou 24 °C para fermentação mais quente de chucrute).
- Medir a taxa de crescimento do isolado microbiano na SVE por meio da colheita de tubos de réplica no dia 1, dia 2, dia 4, dia 7 e dia 14.
NOTA: A fermentação prossegue rapidamente no início e diminui com o tempo. Portanto, ter mais pontos de tempo iniciais dá maior resolução à dinâmica de como proceder a fermentação. - A cada ponto de tempo, misture bem o SVE inoculado por pipetting para cima e para baixo algumas vezes. Diluir em série o SVE inoculado em 1x PBS e placa em placas de ágar. Incubar as placas de ágar por 4-7 dias antes de contar colônias.
NOTA: O ágar man, Rogosa e Sharpe (MRS) deve ser usado para enumerar todas as bactérias de ácido láctico, levedura peptone dextrose (YPD) deve ser usado para levedura, e ágar TS para a maioria das outras bactérias isoladas da fisfera. - Registo o pH das amostras em cada ponto de tempo usando uma sonda micro pH.
NOTA: Esta etapa deve ser realizada após o revestimento, pois a sonda pH irá transferir células entre tubos/tratamentos.
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Representative Results
Taxas de crescimento de repolhos Napa
O método de esterilização de sementes foi testado com vários repolhos Napa diferentes (B. rapa var pekinese; Figura Suplementar 1) de vários fornecedores diferentes e todos cresceram consistentemente com taxas de crescimento semelhantes. No entanto, testando os métodos com diferentes espécies de Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Híbrido Gigante Trópico; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. juncea: Gigante Vermelho mostarda) deu sucesso limitado(Figura Suplementar 2). Ao contrário do repolho Napa que forma rosetas compactas que se encaixam nos tubos de vidro, estes brassica spp. ou tiveram baixas taxas de germinação após a esterilização ou a haste alongou rapidamente para fazer uma planta espinhosa e insalubre. Além disso, a esterilização de sementes mais antigas (>1 ano de idade) não é recomendada, pois as camadas de sementes secam, dificultando a remoção durante o processo de esterilização. Compre regularmente novas sementes e teste um subconjunto de repolhos para determinar se são estéreis antes de realizar experimentos.
Crescimento de inoculantes microbianos na filosfera de repolho napa
Os isolados microbianos(Tabela 1) foram inoculados tanto como isolados de cepa únicas quanto em combinação com outro isolado para procurar interações pareadas na fillofera de repolho Napa. Um total de 15 repolhos sem germes foram vacinados para cada tratamento e cinco repolhos foram colhidos imediatamente após a inoculação, cinco foram colhidos quatro dias após a inoculação, e os restantes foram colhidos 10 dias após a inoculação. Os resultados mostram que os isolados da fisfera são capazes de um rápido crescimento na fisfera do repolho Napa (Figura 2).
Crescimento de inoculantes microbianos em extrato vegetal estéril
Duas leveduras (Kazachstania barnetti e Pichia membranifaciens) e três bactérias (Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvuluse Leuconostoc mesenteroides) foram inoculadas em três tipos diferentes de SVE feito de repolho vermelho, verde e napa. Todas as amostras foram incubadas a 24 °C e o crescimento dos inoculados ao longo de 14 dias foi registrado por revestimento de 5 μL de cada tratamento em placas de ágar MRS ou YPD (n = 5). Os resultados são mostrados na Figura 3A. O pH de cada amostra também foi registrado ao longo da fermentação (Figura 3B) e mostra que as bactérias do ácido láctico eram capazes de acidificar a SVE a níveis abaixo do pH 4 (indicando um fermento seguro para o consumo).
Figura 1: Diagrama da configuração de repolho sem germes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Taxas de crescimento de diferentes bactérias no repolho Napa livre de germes. (A) Crescimento de inoculações únicas na fisfera. (B) Crescimento após inoculação de dois micróbios na filosfera. O crescimento dos micróbios foi medido como unidades formadoras de colônias contadas por g de repolho homogeneado banhado em mídia TSA ou MRS. n = 5. Barras de erro = desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Crescimento de bactérias de ácido láctico e leveduras em extrato vegetal estéril (SVE) feito com repolho vermelho, verde e napa. (A) O crescimento de inoculantes microbianos foi medido pela contagem de unidades formadoras de colônia por mL de SVE banhadas. As leveduras foram banhadas em placas de ágar YPD e bactérias em placas de ágar MRS. (B) Acidificação do extrato vegetal estéril à medida que os micróbios crescem mostrados como queda no pH. n = 5. Barras de erro = desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Phyla/Genera de inoculantes microbianas | Fonte de micróbio |
| Firmicutes Bacillus | Fisfera |
| Firmicutes Lactobacillus | Fermentação |
| Proteobacteria Achromobacter | Fisfera |
| Proteobacteria Rhizobium | Fisfera |
| Proteobacteria Sphingomonas | Fisfera |
Tabela 1: Isolados microbianos inoculados no repolho Napa livre de germes.
Figura Suplementar 1: Crescimento de Brassica rapa var pekinensis: Bilko em condições livres de germes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 2: Diferentes variedades de repolho crescendo em condições livres de germes. (A) B. rapa: Turnip Purple Top, (B) B. oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid, (D) B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid,(E) B. juncea: Mostarda Gigante Vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As plantas de repolho Napa livres de germes têm sido usadas para estudar a limitação dispersa de bactérias de ácido láctico na fisfera de repolho napa17. Repolhos Napa sem germes também podem ser usados para testar o crescimento individual ou par-wise na fisfera (Figura 1). Métodos para a fabricação de extrato vegetal estéril foram testados para três variedades diferentes de repolho: vermelho, verde e napa. Cada uma dessas SVEs atuam como uma mídia de crescimento confiável; micróbios inoculados crescem consistentemente em diferentes mídias. As taxas de crescimento de cepa única em SVE (Figura 2) mostram que o LAB cresce rapidamente e acidifica a mídia da mesma forma que seria antecipada em um fermento17.
Plantas livres de germes e extrato vegetal estéril podem ser usados em combinação para abordar uma série de questões ecológicas diferentes, como efeitos prioritários e sucessão na fisfera ou dentro de um fermento. Uma comunidade sintética de micróbios é simples de construir através de repolhos homogeneizados para obter isolados da filosfera, ou chucrute para obter bactérias de ácido láctico16. Interações em pares ou experimentos de saída com mais membros da comunidade podem ser realizados na fisfera ou na SVE para avaliar a importância ou função dos membros da comunidade. Estudos de seleção ambiental podem ser realizados na SVE, onde o impacto da vegetais fermentados pode ser avaliado. Há também o potencial de usar os repolhos livres de germes e a SVE para quantificar a diversificação de espécies microbianas e comunidades usando evolução experimental.
Uma limitação deste sistema de repolho sem germes é a pequena escala de tempo dos experimentos. Devido aos pequenos tubos de vidro utilizados, os repolhos não são capazes de crescer por períodos maiores que um mês, pois suas folhas são confinadas pela borda dos tubos. Recipientes de cultivo maiores, como caixas de cultura de tecidos vegetais (Tabela de Materiais) poderiam ser usados, mas estes ainda não produzirão uma planta de repolho em tamanho real. Também tentamos cultivar repolhos em 0,75% de ágar contendo caldo ms, mas descobrimos que isso produziu crescimento inconsistente das mudas de repolho. Usar argila calcinada como um substrato crescente com caldo ms suficiente para saturar, mas não inundar os grãos de argila é o método ideal para cultivar repolhos saudáveis.
Existem algumas medidas críticas para garantir o crescimento bem sucedido de repolhos sem germes. Garantir que a argila calcinada esteja totalmente seca ao adicionar caldo MS permite que a argila absorva completamente o caldo MS durante o ciclo de autoclave. No entanto, se houver algum caldo de MS sobre o nível da argila, ele deve ser removido antes de adicionar as sementes; sementes não vão germinar se eles estão sentados no caldo MS. Outro passo importante para monitorar é a esterilização de sementes. As sementes mais velhas (>1 ano de idade) não germinarão tão rapidamente ou tão confiável quanto as sementes jovens. Alterar o tamanho do tubo usado para esterilizar ou encher demais os tubos também pode afetar a esterilização. A etapa de esterilização também ajuda a suavizar e remover o casaco de sementes para que as sementes germinam rapidamente. Observe aqui que reutilizar as garrafas de spray da bomba após o uso com culturas microbianas não é recomendado, pois é difícil remover biofilmes do componente da bomba. Note-se, deve-se ter cuidado com as espécies bacilos, pois elas são particularmente resistentes à autoclavagem. As garrafas de bomba que entraram em contato com o Bacillus spp não são reutilizadas.
Embora o extrato vegetal estéril não tenha a estruturação espacial presente em um vaso de fermentação, a dinâmica de crescimento do LAB sugere que ele imita o progresso da fermentação com uma rápida queda no pH e um aumento no crescimento de bactérias de ácido láctico ao longo dos 14 dias de fermentação. Os mesenteroides leuconostoc são importantes no início da fermentação e aumentaram em abundância mais rapidamente do que os Lactobacillus e Pediococcus spp, tendência observada em outras pesquisas de sucessão de chucrute20,21. O trabalho no laboratório também explorou o uso de espectrofotômetro para obter leituras de densidade óptica (OD) para medir o crescimento do LAB em SVE dispensado em 96 placas de poços. Os resultados iniciais com extrato de repolho Napa pareciam promissores, mas o SVE feito com extrato de repolho vermelho mudou de cor à medida que o pH caiu resultando em leituras confusas de DD. Além disso, o uso de leituras de OD para enumerar o crescimento limita o uso deste sistema para inoculações de tensão única. Juntas, essas limitações nos levaram a abandonar o uso de leituras de OD para medir o crescimento microbiano.
Testar interações ecológicas na fissófera é atual, pois há evidências de que a filosfera afeta a saúde e a produtividade das plantas22. Nosso sistema modelo só foi desenvolvido para trabalhar com repolho Napa, mas bactérias da fisia Proteobactérias, Firmicutes e Actinobacteria são comuns na fistosfera de muitas espécies vegetais13,23. Embora apenas três variedades diferentes de repolho tenham sido testadas, a SVE pode ser feita com outras plantas agrícolas importantes. Por exemplo, estudos que investigam a montagem da comunidade microbiana durante a fermentação de suco de cenoura24 ou colonização microbiana da raiz de milho25 podem ser replicados usando os protocolos descritos neste artigo.
O acoplamento do repolho sem germes com o SVE para estudar a montagem comunitária na fermentação pode mostrar como as mudanças no microbioma da fisfera podem influenciar o sucesso da fermentação. A deterioração dos fermentos ou a falha em atingir um pH suficientemente baixo pode resultar se não houver uma acidificação inicial rápida26. Esses fermentos estragados podem ser devido aos processos de fabricação, mas a variação dos microbiomas filosferas também pode ter uma influência importante no sucesso dos fermentos vegetais17. O sistema descrito é um modelo útil para determinar quais processos de montagem de microbiomas podem impactar o sucesso da fermentação vegetal.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela subvenção do USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport e Claire Fogan forneceram suporte técnico e Ruby Ye e Casey Cosetta fornecem comentários úteis sobre as primeiras versões deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
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