Summary

Un sistema gnotobiótico para el estudio del ensamblaje del microbioma en la filosfera y en la fermentación vegetal

Published: June 03, 2020
doi:

Summary

Se ha desarrollado un método para cultivar coles Napa libres de gérmenes que permite a los investigadores evaluar cómo interactúan las especies microbianas individuales o las comunidades microbianas multiespecie en las superficies de las hojas de repollo. También se presenta un extracto vegetal estéril que se puede utilizar para medir los cambios en la composición de la comunidad durante la fermentación vegetal.

Abstract

La filosfera, la parte sobre el suelo de la planta que puede ser colonizada por microbios, es un sistema modelo útil para identificar procesos de ensamblaje comunitario microbiano. Este protocolo describe un sistema para estudiar la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera de las plantas de repollo de Napa. Describe cómo cultivar plantas libres de gérmenes en tubos de ensayo con un sustrato de arcilla calcinada y caldo de nutrientes. La inoculación de plantas libres de gérmenes con cultivos microbianos específicos ofrece oportunidades para medir el crecimiento microbiano y la dinámica comunitaria en la filosfera. A través del uso de extracto vegetal estéril producido a partir de coles cambios en las comunidades microbianas que se producen durante la fermentación también se puede evaluar. Este sistema es relativamente simple y barato de configurar en el laboratorio y se puede utilizar para abordar cuestiones ecológicas clave en el ensamblaje de la comunidad microbiana. También ofrece oportunidades para entender cómo la composición de la comunidad filosfera puede afectar la diversidad microbiana y la calidad de las fermentaciones vegetales. Este enfoque para el desarrollo de comunidades filosfera de repollo gnotobiótico podría aplicarse a otras especies de plantas silvestres y agrícolas.

Introduction

La diversidad microbiana de la filosfera juega un papel importante en el mantenimiento de la salud de la planta y también puede influir en la capacidad de las plantas para soportar el estrés ambiental1,2,3,4,5. A su vez, la salud de los cultivos afecta directamente a la inocuidad y calidad de los alimentos6,,7. Las plantas desempeñan un papel en el funcionamiento del ecosistema y sus microbiomas asociados afectan a la capacidad de las plantas para llevar a cabo estas actividades, así como influyen directamente en el entorno en sí8. Mientras que los científicos han comenzado a descifrar la función y composición de la filosfera, los procesos ecológicos que influyen en la asamblea comunitaria microbiana filosfera no se entienden completamente9,,10. El microbioma filosfera es un excelente sistema experimental para estudiar la ecología de los microbiomas11. Estas comunidades son relativamente simples y muchos de los miembros de la comunidad se pueden cultivar en los medios de laboratorio estándar10,,12,,13.

Las hortalizas fermentadas son un sistema en el que la estructura comunitaria de la filosfera tiene importantes consecuencias. Tanto en el chucrut como en el kimchi, los microbios que se producen naturalmente en las hojas vegetales (la filosfera de las especies de Brassica) sirve como el inóculo para la fermentación14,15. Las bacterias del ácido láctico (LAB) se consideran miembros ubicuos de los microbiomas vegetales, sin embargo pueden estar en baja abundancia en la filosfera16. Una fuerte selección abiótica durante la fermentación impulsa un cambio en la composición de la comunidad microbiana que permite que las bacterias del ácido láctico aumenten en abundancia. A medida que LAB crece, producen ácido láctico que crea el ambiente ácido de los productos vegetales fermentados17. El vínculo entre la filosfera y el fermento proporciona la oportunidad de utilizar las verduras como modelo para entender cómo se estructuran los microbiomas.

Hemos desarrollado métodos para cultivar coles Napa libres de gérmenes y para inocularlas con comunidades microbianas específicas utilizando botellas de aerosol. Este es un método barato y confiable de inocular uniformemente el repollo con microbios individuales o comunidades mixtas. También se ha desarrollado un extracto vegetal estéril (SVE) a partir de tres tipos/variedades diferentes de col: repollo rojo y verde (Brassica oleracea) y repollo Napa (B. rapa). La adición de sal a estas SVEs replica el entorno de fermentación y permite estudios experimentales a pequeña escala y relativamente de alto rendimiento del ensamblaje del microbioma de fermentación. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar el ensamblaje de la comunidad microbiana en la filosfera y cómo la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera puede estar relacionada con el éxito de la fermentación vegetal.

Protocol

1. Cultivo de coles libres de gérmenes Equipos de preparación para el cultivo de coles libres de gérmenes Limpieza de la arcilla calcinada para eliminar las partículas de polvo fino Enjuagar arcilla calcinada (Tabla de Materiales) al menos 3x con agua del grifo; drenar el agua.ADVERTENCIA: La arcilla calcinada produce polvo muy fino y se recomienda llevar una máscara protectora(Tabla de materiales)al lavar. Esparce la arcilla calcinada como …

Representative Results

Tasas de crecimiento de las coles NapaEl método de esterilización de semillas fue probado con varias coles Napa diferentes (B. rapa var pekinese; Figura suplementaria 1) de un número de diferentes proveedores y todos crecieron consistentemente con tasas de crecimiento similares. Sin embargo, probando los métodos con diferentes especies de Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Gi…

Discussion

Las plantas de repollo Napa libres de gérmenes se han utilizado para estudiar la limitación de dispersión de las bacterias del ácido láctico en la filosfera de repollo Napa17. Las coles Napa libres de gérmenes también se pueden utilizar para probar el crecimiento individual o par en la filosfera (Figura 1). Los métodos para la elaboración de extracto vegetal estéril han sido probados para tres variedades diferentes de repollo: rojo, verde y Napa. Cada una de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la subvención USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport y Claire Fogan proporcionaron soporte técnico y Ruby Ye y Casey Cosetta proporcionan comentarios útiles sobre las primeras versiones de este manuscrito.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 20170-650
15 mL conical tubes Falcon 352096
7-way tray tray Sigma Magenta T8654
Amber Round Boston Glass Bottle GPS 712OZSPPK12BR Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters If you care (unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free) Austin's 50-010-45
Borosilicate Glass tubes VWR 47729-586
Calcined clay Turface MVP Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender Cuisinart Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors 7-389-A American Educational Products Ordered on Amazon.com
Ethanol VWR 89125-172
Forceps Aven 18434 Ordered on Amazon.com
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
KleenGuard M10 Kimberley-Clark 64240
Large plastic container Rubbermaid Ordered on Amazon.com
Light racks Gardner's Supply 39-357 full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps Millipore Sigma C1934
Man, Rogosa, and Sharpe Fisher Scientific DF0881-17-5 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP
Micropestle Carolina 215828 Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth Millipore Sigma M5519 Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl Sigma Aldrich S9888
Napa cabbage seeds Johnny's Select Seeds 2814G B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 Used to make agar plates
Phosphate buffer saline Fisher Scientific 50-842-941 Teknova
Plant tissue culture box Sigma Magenta GA-7
Serologial pipettes VWR 89130-900
Sterile dowel Puritan 10805-018 Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter Nalgene 974103
Tryptic soy agar Fisher Scientific DF0370-17-3 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips Rainin 17007102
Yeast, peptone and dextrose Fisher Scientific DF0428-17-5 This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates

References

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Cite This Article
Miller, E. R., O’Mara Schwartz, J., Cox, G., Wolfe, B. E. A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation. J. Vis. Exp. (160), e61149, doi:10.3791/61149 (2020).

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