Summary
यहां, हम एक पिग्गीबैक-आधारित दाता प्लास्मिड और कैस 9 निकेस उत्परिवर्ती का उपयोग करके मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं में सहज जीन संपादन के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ 4) लोकस के एक्सॉन 8 में दो बिंदु उत्परिवर्तन पेश किए गए थे।
Abstract
कस्टम डिज़ाइन किए गए एंडोन्यूक्लिज़, जैसे कि आरएनए-निर्देशित क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर)-सीएएस 9, स्तनधारी कोशिकाओं में कुशल जीनोम संपादन को सक्षम करते हैं। यहां हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं में एक उदाहरण के रूप में हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ 4) लोकस को मूल रूप से जीनोम संपादित करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। दो-चरणीय आनुवंशिक चयन में एक पिगीबैक-आधारित दाता प्लास्मिड और सीआरआईएसपीआर-कैस 9 निकेस उत्परिवर्ती को मिलाकर, हम एचएनएफ 4 के सही और कुशल लक्ष्यीकरण का प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) अनुसंधान या क्लिनिक1 के लिए दैहिक कोशिकाओं के असीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। एचपीएससी में जीन लक्ष्यीकरण सेल विनिर्देश के दौरान जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने और रोग के तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान करता है। यद्यपि कुशल जीनोम संपादन विधियां मौजूद हैं, एचपीएससी में जीन को संशोधित करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। एचपीएससी में समरूप पुनर्संयोजन द्वारा मानक जीन लक्ष्यीकरण कम आवृत्ति पर होता है या कुछजीनों पर भी पता लगाने योग्य नहीं होता है, और डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) उत्तेजित जीन लक्ष्यीकरण (जिसे जीन संपादन कहा जाता है) इसलिए इन कोशिकाओं में आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, एचपीएससी का अभिकर्मक और बाद में एकल-कोशिका क्लोनिंग बहुत कुशल नहीं है, भले ही एकल सेल से जुड़े एपोप्टोसिस को आरएचओ-संबद्ध प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोधक4 के उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है। अंत में, रुचि के जीन पर संभावित ऑन-टारगेट और ऑफ-टारगेट म्यूटेशन भी समस्याग्रस्त हो सकते हैं। इसलिए, एचपीएससी में अनुरूप आनुवंशिक परिवर्तन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल आवश्यक है।
आरएनए-निर्देशित सीआरआईएसपीआर (क्लस्टर्ड रेगुलरी इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट) और सीआरआईएसपीआर से जुड़े प्रोटीन 9 (सीएएस 9) तकनीक अब जीन संपादन में एक अच्छी तरह से स्थापित उपकरण है। ट्रांसक्रिप्टेड सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) और एक ट्रांस-एक्टिविंग आरएनए (ट्रैकआरएनए) एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) बनाते हैं, जो कैस 9 प्रोटीन के साथ मिलकर जीन विशिष्ट दरार5 की अनुमति देता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली प्रोग्राम करने योग्य है, एसजीआरएनए के 20-बीपी गाइड अनुक्रम को बदलकर, जिसका अर्थ है कि प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति (पीएएम) आवश्यकता को पूरा करने वाले लगभग किसी भी स्थान को संपादित किया जा सकता है। हालांकि, जंगली प्रकार कैस 9 अपने गाइड अनुक्रम और डीएनए लक्ष्य के बीच कुछ बेमेल को सहन कर सकता है, जो अवांछित ऑफ-टारगेट प्रभाव पैदा कर सकता है। इसकी विशिष्टता में सुधार करने के लिए, एक निकेस उत्परिवर्ती (Cas9n) विकसित किया गया है। डी 10 ए या एन 863 ए उत्परिवर्तन युक्त कैस 9 एन में केवल एक कार्यात्मक न्यूक्लियस डोमेन होता है और परिणामस्वरूप केवल एक स्ट्रैंड पर डीएनए निकल सकता है। कैस 9 एन की एक जोड़ी उचित रूप से अंतरिक्ष और उन्मुख डीएनए डीएसबी को प्रभावी ढंग से प्रेरित कर सकती है और ऑफ-टारगेट प्रभाव नाटकीय रूप से कम होजाते हैं। कुशल कैस 9 एन संशोधन सुनिश्चित करने के लिए, यह दिखाया गया है कि दो कैस 9 एन-एसजीआरएनए को आदर्श रूप से -4 से 20 बीपी ऑफसेट के साथ रखा जाना चाहिए और हमेशा 5 'ओवरहैंग6 बनाना चाहिए।
Cas9(n)-sgRNA प्रेरित DSB का उपयोग hPSCs 7,8 में जीनोम संपादन के लिए किया जा सकता है। यह गैर-समरूप अंत जुड़ने की मरम्मत के माध्यम से जीन नॉकआउट बना सकता है, या यदि दाता डीएनए टेम्पलेट मौजूद है तो होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के माध्यम से जीन संशोधन पेश कर सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एचडीआर के लिए एक पिगीबैक ट्रांसपोसन-आधारित दाता प्लास्मिड (या लक्ष्यीकरण वेक्टर) का उपयोग करता है, जिसमें एक दवा प्रतिरोध मार्कर ट्रांसपोसन उल्टे दोहराव से घिरा होता है। इस दृष्टिकोण के लाभ में कुशल स्क्रीनिंग और सहज जीन संपादन शामिल है जैसा कि सबसे पहले युसा एट अल.9,10 द्वारा प्रदर्शित किया गया था। दवा चयन कैसेट एकीकृत वेक्टर के साथ कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति देता है, जिसे बाद में एचडीआर द्वारा प्राप्त लोगों की पहचान करने के लिए जंक्शन पीसीआर द्वारा जांच की जाती है। इसके अलावा, दवा चयन कैसेट को कैस 9 (एन) दरार के लिए लक्ष्य अनुक्रमों को बदलने के लिए तैनात किया जा सकता है, इसलिए एचडीआर के बाद कोई और डीएनए टूटना नहीं होता है, इस प्रकार कैस 9 (एन) पुन: दरार के परिणामस्वरूप 'ऑन' लक्ष्य उत्परिवर्तन समाप्त हो जाता है। इसके अलावा, पिगीबैक ट्रांसपोसेस द्वारा उत्प्रेरित सटीक छांटने का फायदा उठाकर, चयन मार्कर को तब निशान छोड़े बिना जीनोम से निकाला जाता है। दवा चयन मार्कर 9 को हटाने के बाद पिगीबैक सम्मिलन के लिए केवल मूल अंतर्जातटीटीएए अनुक्रम रहता है। यहां तक कि अगर टीटीएए साइटों को प्रतिस्थापन पेश करके बनाया जाना है, तो अन्य तरीकों की तुलना में नियामक तत्वों को परेशान करने की संभावना कम होजाती है।
यहां हम एचपीएससी में निर्बाध जीनोम संपादन को लागू करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। दो-चरणीय आनुवंशिक चयन में एक पिगीबैक-आधारित दाता प्लास्मिड और सीआरआईएसपीआर-कैस 9 निकेस उत्परिवर्ती को मिलाकर, हमने हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ 4) जीन11 में दो पूर्वनिर्धारित बिंदु उत्परिवर्तन पेश किए। यह दृष्टिकोण विश्वसनीय और कुशल है, और मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से एंडोडर्म और हेपेटोसाइट विनिर्देश में एचएनएफ 4 द्वारा निभाई गई महत्वपूर्ण भूमिकाओं के गहन विश्लेषणकी अनुमति दी है।
Protocol
1. CRISPR/ Cas9n-sgRNA अभिव्यक्ति प्लास्मिड का डिजाइन और निर्माण
- संशोधित किए जाने के लिए साइट के पास किसी भी 5'-एनजीजी के सीधे अपस्ट्रीम में 20-बीपी गाइड अनुक्रमों की खोज करें। एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) की एक जोड़ी की आवश्यकता होती है जब स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस से कैस 9 निकेज (कैस 9 एन) का उपयोग किया जाता है। एसजीआरएनए की जोड़ी को -4 से 20 बीपी ऑफसेट6 के साथ निकिंग पर 5 'ओवरहैंग उत्पन्न करने में सक्षम होना चाहिए।
- आवश्यक ऑलिगोस और pSpCas9n-2A-puro वेक्टर ऑर्डर करें।
- प्रकाशित प्रोटोकॉल12 के बाद कैस 9 एन के साथ सह-अभिव्यक्ति के लिए पीएसपीसीएएस 9 एन वेक्टर में एसजीआरएनए क्लोन करें।
2. पिग्गीबैक-आधारित लक्ष्यीकरण वेक्टर का डिजाइन और निर्माण
- लक्ष्य जीन अनुक्रम डाउनलोड करें और संशोधित होने वाली साइट के पास टीटीएए साइट की खोज करें।
नोट: टीटीएए साइट और संशोधित साइट के बीच की दूरी जितना संभव हो उतनी छोटी होनी चाहिए। यदि कोडिंग अनुक्रम के भीतर और 100-बीपी दूरी के भीतर कोई टीटीएए साइट मौजूद नहीं है, तो समानार्थी न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन बनाकर एक को पेश करना आवश्यक है। - होमोलॉजी आर्म्स (एचए) डिजाइन करें और एचए में वांछित बिंदु उत्परिवर्तन को शामिल करें। एचए की इष्टतम लंबाई लगभग 500 - 1200 बीपी होनी चाहिए।
नोट: संभावित कैस 9 एन पुन: दरार से बचने के लिए पीएएम अनुक्रम को उत्परिवर्तित करने के लिए समानार्थी न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन पेश करने की सिफारिश की जाती है। - एक स्थापित प्रोटोकॉल10 का पालन करते हुए अंतिम लक्ष्यीकरण वेक्टर का निर्माण करें।
नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले लक्ष्यीकरण वेक्टर में, एक पीजीके प्रमोटर संचालित प्यूरो-डेल्टाटीके चयन कैसेट ट्रांसपोसन उल्टे दोहराव से घिरा हुआ है।
3. मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का आनुवंशिक संपादन
- मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) को एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर और पुनः संयोजक लैमिनिन521-लेपित सतहों (5 μg / mL) पर 5%CO2 बनाए रखें। कोशिकाओं को 1: 3 विभाजन अनुपात के बाद 72 घंटों के बाद 70-85% स्थिरता तक पहुंचना चाहिए।
नोट: यदि मौजूद है, तो दैनिक माध्यम परिवर्तन से पहले सहज रूप से विभेदित कोशिकाओं को धीरे-धीरे दूर करके हटा दें। - अभिकर्मक के दिन, कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 300 μL लैमिनिन 521 घोल (5 μg / mL) के साथ 24-वेल प्लेट के पर्याप्त कुओं को कोट करें।
- कोटिंग घोल को धीरे से हटा दें और प्रत्येक कुएं में 10 μM रॉक अवरोधक के साथ पूरक ताजा mTeSR1 माध्यम के 300 μL जोड़ें, और फिर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें।
नोट: लैमिनिन कोटिंग समाधान हटाए जाने पर प्लेटों को किसी भी बिंदु पर सूखने की अनुमति न दें। - स्टॉक एचपीएससी को इनक्यूबेटर से स्थानांतरित करें, खर्च किए गए माध्यम को हटा दें, और फिर 1 एमएल बाँझ 1x DPBS का उपयोग करके कोशिकाओं को एक बार धो लें।
- 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल कोमल सेल पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 6-8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: धीरे से प्लेट को टैप करें और जांचें कि क्या कोशिकाएं यह तय करने के लिए आसानी से अलग हो सकती हैं कि पाचन काफी लंबा है या नहीं। - सभी एचपीएससी को उठाने के लिए पी 1000 टिप का उपयोग करके धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- सेल निलंबन में 10 μM रॉक इनहिबिटर (Y-27632) के साथ पूरक ताजा mTeSR1 माध्यम के 2 एमएल जोड़कर पृथक्करण समाप्त करें।
- अच्छी तरह से मिलाएं और सिंगल-सेल सस्पेंशन को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और कोशिकाओं को 2 एमएल ताजा एमटीईएसआर 1 माध्यम में अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें, जो 10 एसएम रॉक अवरोधक के साथ पूरक है।
- हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। मृत कोशिकाओं को दागने और बाहर करने के लिए ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करें।
- प्रत्येक न्यूक्लियोफेक्शन प्रतिक्रिया के लिए 8 x 105 से 1 x 106 जीवित कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर सुपरनैटेंट को ध्यान से एस्पिरेट करें।
- मानव स्टेम सेल न्यूक्लियोफेक्शन किट से मिश्रित न्यूक्लियोफेक्शन समाधान/पूरक के 100 μL में युग्मित Cas9n-sgRNA अभिव्यक्ति प्लास्मिड के 3 μg और वेक्टर प्लास्मिड को लक्षित करने के 5 μg को मिलाएं। किट से जीएफपी नियंत्रण प्लास्मिड का उपयोग करें और जीएफपी नियंत्रण प्लास्मिड मिश्रण भी तैयार करें।
नोट: न्यूक्लियोफेक्शन से पहले एंडोटॉक्सिन संदूषण को कम करने के लिए सभी प्लास्मिड की अधिकतम तैयारी करना महत्वपूर्ण है। प्लास्मिड की एकाग्रता लगभग 1 μg / μL होनी चाहिए। - तैयार कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए डीएनए मिश्रण (वॉल्यूम ~ 111 μL) का उपयोग करें और इसे इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट (न्यूक्लियोफेक्शन किट के साथ प्रदान किया गया) में स्थानांतरित करें, किसी भी बुलबुले से बचें।
- मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के लिए अनुकूलित स्थितियों का चयन करके न्यूक्लियोफेक्शन डिवाइस का उपयोग करके कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करें।
नोट: यदि पहली बार मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के लिए न्यूक्लियोफेक्शन किट का उपयोग कर रहे हैं, तो इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोग्राम का परीक्षण करना और सबसे कुशल चुनना आवश्यक है। - तुरंत इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं में 10 μM रॉक अवरोधक के साथ पूरक 37 °C mTeSR1 माध्यम में 500 μL ताजा और गर्म जोड़ें। चरण 3.2 और 3.3 से तैयार 24-वेल प्लेट के 2 कुओं में मिश्रण को स्थानांतरित करें।
- जल्दी से प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें और कोशिकाओं को ठीक होने की अनुमति दें।
- 12-16 घंटे बाद, सेल रखरखाव माध्यम बदलें। यदि कोशिकाओं ने सेल-सेल संपर्क स्थापित किया है, तो रॉक अवरोधक को वापस लें, यदि नहीं, तो अवरोधक के साथ माध्यम को पूरक करना जारी रखें।
- 24-48 घंटे के बीच, नियंत्रण कोशिकाओं में जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करके न्यूक्लियोफेक्शन दक्षता की जांच करें। जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाएं कम से कम 30 प्रतिशत होनी चाहिए।
- न्यूक्लियोफेक्शन के 48 घंटे बाद, एमटीईएसआर 1 माध्यम को 1 μg / mL puromycin के साथ पूरक करके कोशिकाओं का चयन करना शुरू करें।
- न्यूक्लियोफेक्शन के 72 घंटे बाद, एमटीईएसआर 1 माध्यम को 0.5 μg / mL puromycin के साथ पूरक करें। यदि सेल कंफ्लुएंसी 30% से कम है, तो माध्यम को 10 μM रॉक अवरोधक के साथ पूरक भी करें।
- न्यूक्लियोफैक्शन के 4-6 दिनों के बाद, प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी कोशिकाओं को 0.8 कोशिकाओं / कुएं की एकाग्रता पर 10-15 x 96-वेल प्लेटों में पारित करें।
नोट: 10 μM रॉक अवरोधक और 0.5 μg / mL puromycin के साथ माध्यम को पूरक करना आवश्यक है। - एकल सेल-व्युत्पन्न कॉलोनियों को बनाने के लिए 10-12 दिनों के लिए उन कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस / 10% सीओ 2 पर बनाए रखें। बीज बोने के 7 दिन बाद एक बार मध्यम को टॉप अप करें।
नोट: बढ़े हुए सीओ2 स्तर हमारे अनुभव से कॉलोनियों को बनाने के लिए एकल एचपीएससी में मदद करते हैं। - एक एकल कॉलोनी वाले कुओं को चिह्नित करें और माध्यम को ताजा mTeSR1 माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें 0.5 μg / mL puromycin होता है लेकिन कोई रॉक अवरोधक नहीं होता है।
नोट: इस बिंदु से, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 के तहत उगाया जाएगा। - दो दिन बाद, अविभाजित कॉलोनियों वाले कुओं के लिए माध्यम बदलें। माध्यम को 10 μM रॉक अवरोधक और 0.5 μg / mL puromycin के साथ पूरक करें।
नोट: कुछ कुओं में, कोशिकाओं ने विभेदित किया हो सकता है और उन्हें त्यागने की आवश्यकता हो सकती है। - कॉलोनियों को धीरे-धीरे खुरचने के लिए पी 2 पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। एक कॉलोनी से प्राप्त सेल सस्पेंशन को अलग-अलग 96-वेल प्लेटों पर 2 नए कुओं में स्थानांतरित करें, और जीनोटाइपिंग के लिए एक का उपयोग करें और एक को बनाए रखने के लिए।
नोट: कॉलोनियों को सावधानीपूर्वक बनाए रखना और सहज भेदभाव स्तर को न्यूनतम रखना महत्वपूर्ण है। - अधिकांश कुओं में 50% या उससे अधिक की मात्रा तक पहुंचने के बाद जीनोटाइपिंग के लिए कोशिकाओं वाली प्लेट लें। खर्च किए गए माध्यम को डंप करें और फिर डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें।
- ब्रैडली लाइसिस बफर का उपयोग करके कोशिकाओं को अच्छी तरह से देखें और संबंधित प्रोटोकॉल (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate) का पालन करते हुए प्लेट में प्रत्येक कुएं से जीनोमिक डीएनए को अलग करें।
- स्वतंत्र रूप से बाएं और दाएं होमोलॉजी आर्म्स दोनों को जीनोटाइप करने के लिए तीन-प्राइमर जंक्शन पीसीआर विधि का उपयोग करें।
नोट: पीसीआर विधि दिखाने वाली एक योजना चित्रा 2 में प्रस्तुत की गई है। - सेंगर अनुक्रमण के लिए 4-5 कॉलोनियों से दोनों होमोलॉजी हथियारों के लिए जंक्शन पीसीआर उत्पादों को भेजें और अनुक्रम प्राप्त करें।
नोट: 2 स्थापित कॉलोनियों का अनुक्रमण परिणाम चित्रा 3ए में दिखाया गया है। - सही जीनोटाइप के साथ कॉलोनियां रखें और बाकी को त्याग दें।
- निरंतर प्यूरोमाइसिन चयन के तहत सही कॉलोनियों का विस्तार करें और उन्हें जल्द से जल्द फ्रीज करें।
4. लक्षित मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से ट्रांसपोसन को हटाना
- 0.5 μg / mL puromycin चयन के तहत सही जीनोटाइप के साथ एक कॉलोनी बनाए रखें।
- न्यूक्लियोफेक्ट 8 x 105 से 1 x 106 कोशिकाएं 5 μg हाइपरएक्टिव ट्रांसपोसेस (pCMV-hyPBase) के साथ जैसा कि ऊपर वर्णित है (धारा 3, चरण 3.4-3.18)। समानांतर में एक जीएफपी नियंत्रण न्यूक्लियोफेक्शन करें।
नोट: इन कोशिकाओं को न्यूक्लियोइफेक्ट करने के तुरंत बाद प्यूरोमाइसिन को एमटीईएसआर 1 माध्यम से हटा दिया जाना चाहिए। - प्रकाशित प्रक्रियाओं10 के बाद हटाए गए प्यूरो-डेल्टाटीके चयन कैसेट के साथ कोशिकाओं के लिए बढ़ें और स्क्रीन करें।
नोट: मूल प्रक्रियाओं का सावधानीपूर्वक पालन करना महत्वपूर्ण है। एफआईएयू, या 1-(2-डीऑक्सी-2-फ्लोरो-β-डी-अरबिनोफ्यूरानोसिल)-5-आयोडोरासिल), का उपयोग हर्पीस सिम्प्लेक्स वायरस-व्युत्पन्न थाइमिडाइन काइनेज (एचएसवी-टीके) -आधारित नकारात्मक चयन के लिए थाइमिडीन एनालॉग के रूप में किया गया था। - ट्रांसपोसन को हटाने की पुष्टि करने के लिए संशोधित क्षेत्र को अनुक्रमित करें।
नोट: 3 स्थापित कॉलोनियों का अनुक्रमण परिणाम चित्रा 3बी में दिखाया गया है। - सही जीनोटाइप के साथ कॉलोनियों को रखें और आगे के उपयोग के लिए विस्तार करें।
- आगे के विश्लेषण के लिए उनका उपयोग करने से पहले चुनी गई कॉलोनियों में प्लूरिपोटेंसी मार्करों का लक्षण वर्णन करें।
नोट: दो स्थापित कॉलोनियों का लक्षण वर्णन चित्रा 4 में दिखाया गया है।
Representative Results
वेक्टर-आधारित नॉक-इन रणनीति को लक्षित करना
हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ 4) जीन को एक्सॉन 8 में दो बिंदु उत्परिवर्तन पेश करने के लिए लक्षित जीनोम संपादन के लिए चुना गया था। 11 बीपी ऑफसेट के साथ कैस 9 एन-एसजीआरएनए की एक जोड़ी को संशोधित करने के लिए साइट के करीब डिज़ाइन किया गया था। पिगीबैक-आधारित लक्ष्यीकरण वेक्टर ने वांछित बिंदु उत्परिवर्तन पेश करने के लिए होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट के रूप में काम किया। एक 967 बीपी 5'-एचए और एक 1142 बीपी 3'-एचए जिसमें समानार्थी न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन या वांछित बिंदु उत्परिवर्तन शामिल थे, को अंतिम लक्ष्यीकरण वेक्टर में प्रवर्धित और क्लोन किया गया था। पिगीबैक सम्मिलन साइट दो वांछित बिंदु उत्परिवर्तन से 16 बीपी और 22 बीपी दूर थी। पहले दौर में प्यूरोमाइसिन के साथ प्यूरो-डेल्टाटीके चयन कैसेट वाली कॉलोनियों का चयन किया गया था। एक बार जब चयन कैसेट को दूसरे दौर में ट्रांसपोसेज एक्सिशन द्वारा हटा दिया गया था, तो लक्षित साइट को जीन में शामिल केवल वांछित बिंदु उत्परिवर्तन के साथ मूल रूप से संशोधित किया गया था (चित्रा 1)।
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं में आनुवंशिक संपादन
सही ढंग से लक्षित कोशिकाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए, जीनोटाइपिंग के लिए तीन प्राइमर-आधारित पीसीआर विधि का उपयोग किया गया था (चित्रा 2)। पीसीआर परिणामों की पुष्टि करने के लिए सेंगर अनुक्रमण किया गया था (चित्रा 3ए)। चयन कैसेट को हटाने के बाद, वांछित बिंदु उत्परिवर्तन (चित्रा 3बी) के सही परिचय की पुष्टि करने के लिए संशोधित क्षेत्र को फिर से अनुक्रमित किया गया था।
कॉलोनी स्थापना और संपादित मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का लक्षण वर्णन
सही जीनोटाइप वाली कॉलोनियों का चयन किया गया और आवश्यकतानुसार विस्तार किया गया। आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने से पहले स्थापित उपनिवेशों की विशेषता होनी चाहिए। संपादित कोशिकाओं में माता-पिता की कोशिकाओं के समान आकृति विज्ञान होता है (चित्रा 4ए)। वे प्रतिनिधि मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल मार्करों को भी व्यक्त करते हैं, जिसमें प्रतिलेखन कारक नैनोजी और ओसीटी 4 (चित्रा 4बी), साथ ही सेल सतह मार्कर एसएसईए 4 और टीआरए -1-60 (चित्रा 4सी) शामिल हैं।
चित्रा 1: वेक्टर-आधारित नॉक-इन रणनीति को लक्षितकरना 11. सीएएस 9 एन-एसजीआरएनए अभिव्यक्ति प्लास्मिड की एक जोड़ी का उपयोग एचएनएफ 4 जीन के एक्सॉन 8 में डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित करने के लिए किया गया था। चयन कैसेट के साथ एक लक्ष्यीकरण वेक्टर का उपयोग 16 बीपी और 22 बीपी दूर स्थित पूर्व निर्धारित बिंदु उत्परिवर्तन को पेश करने के लिए किया गया था। यह चयन कैसेट पिगीबैक ट्रांसपोसन के भीतर निहित था, जिसमें एक सकारात्मक-नकारात्मक चयन मार्कर (प्यूरो-डेल्टाटीके) शामिल था, जो एक संवैधानिक रूप से सक्रिय प्रमोटर (पीजीके) द्वारा संचालित था। होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत मार्ग के माध्यम से, लक्षित कोशिकाओं ने चयन कैसेट को शामिल किया। ट्रांसपोसेज द्वारा मध्यस्थता में ट्रांसपोसन एक्सिशन के परिणामस्वरूप केवल बिंदु उत्परिवर्तन मौजूद होने के साथ एक सहज संशोधन होता है। रेड क्रॉस वांछित बिंदु उत्परिवर्तन के स्थान को इंगित करता है। एचए = होमोलॉजी आर्म; पीबी = पिगीबैक; पीएम = बिंदु उत्परिवर्तन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: तीन प्राइमर-आधारित पीसीआर विधि। जीन लक्षित कोशिकाओं को स्क्रीन करने के लिए, पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग का उपयोग किया गया था। तीन प्राइमरों, एलए-एफ 1, -आर 1 और -आर 2 का उपयोग बाएं होमोलॉजी आर्म क्षेत्र को बढ़ाने के लिए किया गया था। स्वतंत्र रूप से, आरए-एफ 1, -एफ 2 और -आर 1 का उपयोग दाएं होमोलॉजी आर्म क्षेत्र को बढ़ाने के लिए किया गया था। जेल वैद्युतकणसंचलन परिणाम के आधार पर, गैर-लक्षित कोशिकाओं, और विषमयुग्मी और होमोजीगोस कोशिकाओं को एक दूसरे से अलग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के अनुक्रमण परिणाम11. दो क्लोनों से पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमित किया गया और लक्षित लोकस (ए) पर चयन कैसेट के सही सम्मिलन की पुष्टि की गई। 5' और 3' पिगीबैक इनवर्टेड टर्मिनल रिपीट (आईटीआर) टीटीएए प्रत्यक्ष दोहराव से घिरे हुए थे। तीन क्लोनों को ट्रांसपोसन एक्सिशन (बी) के बाद अनुक्रमित किया गया था। डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक पेश करने के लिए 11 बीपी ऑफसेट के साथ कैस 9 एन-एसजीआरएनए की एक जोड़ी का उपयोग किया गया था। जीन में दो पूर्व निर्धारित बिंदु उत्परिवर्तन (ए से जी और ए से सी) पेश किए गए थे। एक समानार्थी उत्परिवर्तन प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति (पीएएम) को उत्परिवर्तित करने के लिए पेश किया गया था, और दूसरा पिग्गीबैक एक्सिशन के लिए आवश्यक टीटीएए साइट बनाने के लिए पेश किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: संपादित मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का लक्षण वर्णन। दो संपादित सेल लाइनों और पैतृक कोशिकाओं (ए) की आकृति विज्ञान, स्केल बार = 100 μm। प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल मार्कर NANOG और OCT4 की अभिव्यक्ति की जांच इम्यूनोस्टेनिंग (B, स्केल बार = 50 μm) द्वारा की जाती है, इसके अलावा एसएसईए 4 और टीआरए -1-60 के अलावा दो संशोधित सेल लाइनों और पैतृक कोशिकाओं में फ्लो साइटोमेट्री (सी)। आईजीजी को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। नाभिक को दागने के लिए DAPI का उपयोग किया गया था। प्रतिशत की गणना तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत के रूप में की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग एचपीएससी में एक अंतर्जात स्थान में पूर्व निर्धारित बिंदु उत्परिवर्तन पेश करने के लिए किया जा सकता है। एक पिगीबैक-आधारित लक्ष्यीकरण वेक्टर और युग्मित सीआरआईएसपीआर / कैस 9 एन अभिव्यक्ति प्लास्मिडका संयोजन विश्वसनीय और कुशल साबित हुआ। एचएनएफ 4 जीन संपादन के बाद, 43 विश्लेषण क्लोनों में से 12 को जंक्शन पीसीआर स्क्रीनिंग द्वारा निर्धारित सही ढंग से लक्षित किया गया था। विशेष रूप से, बाइएलील लक्ष्यीकरण दक्षता लगभग 21% (9/43) थी और मोनोएलील लक्ष्यीकरण दक्षता लगभग 7% (3/43) थी।
लक्ष्यीकरण प्रयोगों के बाद, स्क्रीनिंग के पहले दौर के दौरान पिग्गीबैक ट्रांसपोसेस के लिए लक्षित स्थान को सुलभ रखने के लिए प्यूरोमाइसिन चयन को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यह पीजीके प्रमोटर-संचालित प्यूरो-डेल्टाटीके चयन कैसेट को चुप कराने को कम करेगा और स्क्रीनिंग10 के दूसरे दौर में पृष्ठभूमि को कम करेगा। हाल ही में एक रिपोर्ट से पता चला है कि कैग प्रमोटर एचपीएससी14 में पीजीके प्रमोटर की तुलना में चुप कराने के लिए अधिक प्रतिरोधी है। चयन कैसेट के लिए प्रमोटर को बदलने से भविष्य में इस प्रणाली में सुधार हो सकता है। एचआईपीबेस- और जीएफपी-ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं से प्रतिरोधी कॉलोनियों की संख्या की तुलना करना भी महत्वपूर्ण है। ट्रांसपोसन को सफलतापूर्वक हटाने पर, जीएफपी-ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं की तुलना में एचआईपीबेस से अधिक जीवित कॉलोनियां होनी चाहिए। ट्रांसपोसन एक्सिशन के पीसीआर विश्लेषण के अलावा, एक्सिशन फिडेलिटी की पुष्टि करने के लिए संशोधित क्षेत्र के प्रत्यक्ष अनुक्रमण की आवश्यकता होती है।
युसा की पिग्गीबैक ट्रांसपोसन-आधारित लक्ष्यीकरण वेक्टर रणनीति 9,10 के आधार पर, ऊपर दी गई प्रक्रियाओं ने एचपीएससी न्यूक्लियोफेक्शन और एकल सेल क्लोनिंग दक्षता में सुधार पर ध्यान केंद्रित किया। विषम कॉलोनी गठन की संभावना को कम करने के लिए सेल सीडिंग घनत्व को अनुकूलित किया गया था। हमने जीनोटाइप स्क्रीनिंग के लिए कॉलोनी उत्पादन बढ़ाने के लिए 10% सीओ2 के तहत 10-12 दिनों की संस्कृति को भी नियोजित किया। हमारे अनुभव में, प्रत्येक 96-वेल प्लेट से लगभग 20 कॉलोनियां प्राप्त की जा सकती हैं। यद्यपि इस कदम में अन्य तरीकों की तुलना में अधिक समय लग सकता है, यह विश्वसनीय और अत्यधिक कुशल है।
आवश्यकता के आधार पर, लक्ष्यीकरण वैक्टर को रिपोर्टर सेल लाइनों, साथ ही नॉकआउट जीन अभिव्यक्ति बनाने के लिए बिंदु उत्परिवर्तन को पेश करने या सही करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। निष्कर्ष में, CRISPR / Cas9 (n) प्रणाली और एक लक्ष्यीकरण वेक्टर का संयोजन विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक रूप से संशोधित hPSCs को वितरित करने का एक कुशल तरीका है।
Disclosures
डीसीएच स्टेमनोवेट लिमिटेड के सह-संस्थापक, शेयरधारक और निदेशक हैं।
Acknowledgments
हम पीएमसीएस-AAT_PB-पीजीकेपुरोटीके और पीएमवी-एचवाईपीबेस प्लास्मिड साझा करने के लिए कोसुके युसा को धन्यवाद देते हैं। हम जीनोम एडिटिंग पर उपयोगी चर्चा के लिए जिया-यिन यांग और करमजीत सिंह-डोल्ट को धन्यवाद देते हैं। डीसीएच प्रयोगशाला मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय (टीसी / 16/37) और यूके पुनर्योजी चिकित्सा मंच (एमआर / एल 022974/1) से एक पुरस्कार द्वारा समर्थित है। वाईडब्ल्यू को चीनी छात्रवृत्ति परिषद और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
| Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| FIAU | Moravek | M251 | |
| Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
| H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
| Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
| Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
| Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
| Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
| mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
| pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
| pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
| pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
| Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
| QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |
References
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