Summary
Vi modellerer en enkel multiplekset ECL-analyse som kombinerer 7 autoantistoffanalyser sammen. Analysen er i stand til screening for T1D og flere andre autoimmune sykdommer, samtidig, inkludert cøliaki, autoimmun skjoldbrusk sykdom og autoimmunt polyglandulært syndrom 1.
Abstract
Islet autoantistoffer (IAbs) er mye brukt i type 1 diabetes (T1D) diagnose og prediksjon. Fire store IAbs til insulin (IAA), glutamat dekarboksylase-65 (GADA), insulinom antigen-2 (IA-2A) og sinktransportør-8 (ZnT8A) er like viktige i sykdomsprediksjon. For tiden fortsetter opptil 40% av pasientene diagnostisert med T1D å utvikle andre autoimmune lidelser. Dessverre er dagens screeningmetoder ved bruk av et enkelt autoantistoff for måling arbeidskrevende og ineffektive for storskala screeningstudier. Vi har nylig utviklet en enkel multiplekset elektrokjemiluminescens (ECL) analyse for å løse disse aktuelle problemene. Analysen kombinerer alle 7 autoantistofftester i en brønn. Hver brønn inkluderer tre IAbs (IAA, GADA og IA-2A), autoantistoffer mot thyroid peroxidase (TPOA) og thyroid globulin (ThGA) for å oppdage autoimmun skjoldbrusk sykdom, autoantistoffer mot vevstransglutaminase (TGA) for cøliaki, og autoantistoffer mot interferon alfa (IFNαA) for autoimmunt polyglandulært syndrom-1 (APS-1); som alle skjermer for T1D og andre relevante autoimmune sykdommer, samtidig. Multiplex ECL-analysen er basert på plattformen for én ECL-analyse, men bruker i stedet multipleksplaten som kombinerer flere autoantistoffanalyser, opptil 10, i én enkelt brønn. Hovedforskjellen fra den enkle ECL-analysen er at hvert antistoff-antigenkompleks dannet i væskefasen holdes fast på et bestemt sted på hver brønn gjennom et linkersystem på multipleksplaten. 7-Plex ECL-analysen er i denne studien validert mot standard radiobindende analyser (RBA) og enkeltECL-analyser, ved bruk av en stor kohorte av nydiagnostiserte T1D-pasienter og alderstilpassede friske kontroller, noe som resulterer i utmerket analysefølsomhet og spesifisitet.
Introduction
Type 1 diabetes (T1D) er en alvorlig kronisk sykdom som er mest vanlig i barndommen. For tiden har rundt 1.4 millioner mennesker T1D i USA; påfallende øker forekomsten av T1D jevnt med 3-5% hvert år over hele verden og har doblet seg de siste to tiårene, spesielt hos små barn 1,2. Islet autoantistoffer (IAbs) i blodsirkulasjonen er den mest pålitelige biomarkøren for tiden. IAbs kan vises år før klinisk T1D utvikler3. For tiden er fire store IAbs mye brukt i T1D-diagnose og risikoscreening, inkludert autoantistoffer mot insulin (IAA), glutamatdekarboksylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og sinktransportør-8 (ZnT8A). Disse fire IAbene er like viktige i prediksjon av T1D-utvikling. Klassifiseringen av T1D har nylig blitt omdefinert som tilstedeværelse av ≥2 av 4 IAbs med normal glukosemetabolisme som sykdomsstadium 14.
I Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) ble det avslørt at ett av fire barn i fare for T1D sannsynligvis ville utvikle seg til øy, cøliaki, skjoldbruskkjertel eller revmatoid autoimmunitet, og mer påfallende utvikler omtrent 40% av pasientene som har blitt diagnostisert med T1D til slutt en ekstra autoimmun tilstand 5,6,7 . Identifisering av autoantistoffer er avgjørende for prediksjon og diagnose av disse autoimmune sykdommene og bør gi bedre klinisk behandling for pasienter. Det er ingen enkel og billig måte for tiden å skjerme for disse flere autoimmune tilstandene. Nåværende screeningmetoder ved bruk av standard radiobindingsanalyse (RBA), med en enkelt autoantistoffmåling, er arbeidskrevende og ineffektive for en storskala screening.
Her vil vi beskrive den nyutviklede enkle multipleksede ECL-analysen, som vi har autentisert ved hjelp av en enkelt ECL-analyseplattform 8,9,10,11. Multiplex ECL-analysen kombinerer 7 autoantistofftester i en enkelt brønn, ved bruk av bare 15 μL serum, og er i stand til screening for T1D og flere relevante autoimmune sykdommer samtidig, inkludert cøliaki, autoimmun skjoldbrusk sykdom og APS-1. En ZnT8A ECL-analyse var ikke utviklet på det tidspunktet og var ikke inkludert i multiplekset analyse. Multiplex ECL-analysen gir et utmerket verktøy for høy gjennomstrømning i generell populasjonsscreening for T1D og flere autoimmune sykdommer.
Protocol
Forskningsprotokollen ble godkjent av Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Forberedelse av buffer
- Lag merkingsbufferen (2x PBS, pH 7,9). Ved å bruke 400 ml destillert avionisert (DD) vann, tilsett 100 ml 10x PBS. For å justere pH i løsningen, tilsett NaOH til den når 7,9.
- Lag 3 mM biotin ved å oppløse 1 mg biotin i 588 μL merkebuffer som tidligere ble opprettet. Lag 3 mM Ru Sulfo-NHS ved å oppløse 150 nmol Ru Sulfo-NHS i 50 μL merkebuffer.
- Lag antigenbufferen (1% BSA) ved å ta 500 ml 1x PBS og tilsette 5 g bovint serumalbumin (BSA) til løsningen. Forbered 0,5 M eddiksyreoppløsning. Forbered 1 M Tris-HCl-buffer ved hjelp av Trizma Base og juster pH til 9,0.
- For beleggbufferen (3% blokkering A), ta 500 ml 1x PBS og tilsett 15 g blokkering A. Forbered vaskebufferen (0,05 % Tween 20, PBST) ved å blande 5000 ml 1x PBS med 2,5 ml Tween 20. Opprett lesebuffer (2x lesebuffer T med overflateaktivt middel) ved å tilsette 500 ml DD-vann og 500 ml 4x lesebuffer T med overflateaktivt middel.
MERK: For å holde konsistensen mellom analysene er det viktig at både biotin- og Ru Sulfo-NHS-løsningene opprettes like før merkingsprosedyren og ikke opprettes og lagres for fremtidig bruk.
2. Merking av hvert antigenprotein med biotin og Ru Sulfo-NHS separat
MERK: For å få en mer effektiv merkingsreaksjon, bruk en antigenproteinkonsentrasjon på ≥0,5 mg / ml.
- Beregn molar antall av hvert antigenprotein og molare tall av biotin og Ru Sulfo-NHS. Legg til en riktig mengde biotin eller Ru Sulfo-NHS til antigenprotein for merkingsreaksjon i henhold til molforholdet mellom antigenprotein og biotin eller Ru Sulfo-NHS.
- For antigenet som har mindre molekylvekt (≤10 kDa), slik som proinsulinprotein, bruk et molforhold på 1: 5 (antigen: biotin og Ru Sulfo-NHS). For antigenet som har større molekylvekt (>50 kDa), slik som GAD-protein, bruk et molforhold på 1:20. For antigenet som har en middels molekylvekt (10-50 kDa), bruk et molforholdsforhold justert mellom 1: 5-1: 20.
- For både biotin og Ru Sulfo-NHS, divider hver antigenvekt med deres tilsvarende molekylvekter for å få antigenmolarnummeret for hver enkelt. Del molartallet med konsentrasjonen for å få volumet for biotin. Gjenta dette for Ru Sulfo-NHS.
- Bland antigenproteinet med biotin ved å bruke riktig molar forhold, bestemt i trinn 2.2. Gjør deretter det samme for Ru Sulfo-NHS.
MERK: For effektiviteten av merkingsreaksjonen, må eventuelle reduserende kjemikalier som Tris eller glycin i buffersystemet byttes ut til 2x PBS-buffer, pH 7,9 ved dimensjoneringsspinnkolonnen. Merkingsprotokollene for biotin og Ru Sulfo-NHS er identiske. - Dekk reaksjonsrørene med aluminiumsfolie og inkuber dem ved romtemperatur (RT) i 1 time. Årsaken til å dekke reaksjonsrørene med folie er fordi både biotin og Ru Sulfo-NHS-reagenser er lysfølsomme.
- Prime 2 ml eller 5 ml spinnsøyle mens reaksjonsrørene inkuberer (størrelsen på spinnkolonnen bestemmes av volumet som lastes opp på kolonnen). Fyll spinnkolonnen med 2x PBS-buffer og sentrifuger den deretter ved 1,000 x g i 2 minutter hver gang, totalt tre ganger.
- Stopp merkereaksjonen etter at reaksjonsrørene er ferdig med å inkubere. For å stoppe reaksjonen, rens det merkede antigenproteinet ved å føre det gjennom spinnkolonnen en gang. Sentrifuger deretter kolonnen ved 1000 x g i 2 minutter.
- Beregn den totale merkede antigenkonsentrasjonen ved å dele mengden antigenprotein som er tilstede med sluttvolumet. Aliquot 50 μL av det rensede merkede antigenproteinet per rør og lagre aliquots ved -80 ° C for langvarig bruk.
MERK: Det er viktig å være klar over at for hver gang spinnkolonnen passerer antigenproteinet gjennom, vil det være omtrent 90-95% retensjonsrate.
3. Definer den beste konsentrasjonen og forholdene for de to merkede antigenene for analysen (sjakkbrettanalyse)
MERK: Siden ECL-IAA-analysen i denne 7-Plex-analysen krever syrebehandling av serumprøver, må sjakkbrettanalysen for hvert antigen gå gjennom dette trinnet før den inkuberes med den merkede antigenblandingen.
- Påfør sjakkbrettanalysen for hvert antigen separat før du kjører multipleksanalysen. Trinn 3.2-3.6 vil bruke GAD65 som et eksempel.
- Beregn fortynning av merket GAD65-protein. Den anbefalte målrettede konsentrasjonen av den første blandingsoppløsningen av biotinylert GAD65 er 2000 ng / ml og Ru Sulfo-NHS merket GAD65 er 1000 ng / ml. Hvis konsentrasjonen av både biotinylert og Ru Sulfo-NHS merket GAD65 i lagerløsning er 1,0 μg / μL, vil volumet som trengs for biotinylert GAD65 i 560 μL arbeidsløsning være 1,12 μL, og volumet som trengs for Ru Sulfo-NHS merket GAD65 i 700 μL arbeidsløsning vil være 0,7 μL.
- Bland 1,12 μL biotinylert GAD65-protein med 240 μL streptavidin-konjugert linker 1 i ett rør og 160 μL 1% BSA. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 minutter. Tilsett 160 μL stoppløsning til røret og inkuber blandingen ved romtemperatur i ytterligere 30 minutter.
- Lag en seriell fortynning. Ta 280 μL av blandingen til et nytt rør og tilsett 280 μL stoppløsning for å lage en 1: 2 fortynning. Forbered flere nye rør. Gjenta dette trinnet for å kjøre en horisontal seriell fortynning for biotin merket GAD65-antigen (se forrige publikasjon12).
- Bland 0,7 μL Ru Sulfo-NHS merket GAD65 (1 μg / μL) protein med 700 μL stoppløsning. Ta deretter 350 μL av blandingen til et nytt rør og tilsett 350 μL stoppløsning for å lage en 1: 2 fortynning. Forbered flere nye rør, gjenta dette trinnet for å kjøre en vertikal seriell fortynning for Ru Sulfo-NHS merket GAD65 antigen.
- Forbered to serumprøver, en prøve som er svært positiv for GADA og en prøve negativ for GADA, hver med et volum på 0,75 ml. Aliquot 15 μL positivt serum i hver brønn på venstre halvdel av 96-brønns PCR-platen. Aliquot 15 μL negativt serum i hver brønn på høyre halvdel av PCR-platen med 96 brønner.
- Tilsett 18 μL 0,5 M eddiksyre i hver brønn og bland. Inkuber i 45 min ved RT. Forbered en ny 96-brønns PCR-plate. Tilsett 17,5 μL av biotinmerket antigen og 17,5 μL av Ru Sulfo-NHS merket antigen i hver brønn i henhold til seriefortynningene (se forrige publikasjon12).
- Fortsett resten av analysetrinnene som er beskrevet i trinn 5.2 til og med 9.1.
- Bestem signalforholdet fra de høye positive prøvene mot de tilsvarende negative prøvesignalene. Velg den beste konsentrasjonen for Biotin-merket antigen og Ru Sulfo-NHS-merket antigen ved å identifisere punktet som har det høyeste eller nær det høyeste forholdet mellom positivt og negativt signal. I denne forholdsberegningen vurderer du det lave bakgrunnssignalet som er oppnådd fra de negative prøvene.
MERK: De optimale konsentrasjonene av Ru Sulfo-NHS og biotinmerkede antigenproteiner fra sjakkbrettanalyser er vist nedenfor: 30 ng / ml og 200 ng / ml for GAD65, 120 ng / ml og 120 ng / ml for proinsulin, 10 ng / ml og 42 ng / ml for IA-2, 80 ng / ml og 80 ng / ml for TG, 8 ng / ml og 16 ng / ml for TPO, 31 ng/ml og 31 ng/ml for ThG, og 12 ng/ml og 12 ng/ml for IFNα.
4. Lag den blandede linkerkoblede antigenløsningen
- Velg den optimale konsentrasjonen for hvert antigen basert på sjakkbrettanalysen. Fortynn biotinet og Ru Sulfo-NHS merket antigen til den rasjonelle arbeidskonsentrasjonen.
- Bind forskjellige linkere til hver av de unikt biotinylerte antigenproteinene. For en 96-brønns plateanalyse, bland 4 μL biotinylert GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulin, IFN-α og IA-2-protein med 240 μL streptavidin-konjugert linker 1, 2, 3, 4, 8, 9 og 10 i separat rør (figur 1). Tilsett deretter 156 μL PBS / 1% BSA per rør. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 minutter.
- Tilsett 160 μL stoppløsning i hvert rør og inkuber dem ved romtemperatur i ytterligere 30 minutter. Ta 400 μL linkerkoblet antigen fra hvert rør, og kombiner alle 7 antigenene sammen. Tilsett 1,2 ml stoppoppløsning og tilsett deretter 4 μL Ru Sulfo-NHS merket GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulin, IFN-α og IA-2 antigen til blandingen. Nå er antigenoppløsningen klar til bruk i analysen.
5. Inkuber serumprøver med det merkede antigenet
MERK: Siden ECL-IAA-analysen i denne 7-Plex-analysen krever syrebehandling av serumprøver, krever hvert serum syrebehandlingstrinnet før inkubering med merket antigenblanding for denne 7-Plex-analysen.
- Aliquot 15 μL serum per brønn for en 96-brønns PCR-plate. Tilsett 18 μL 0,5 M eddiksyre i hver brønn og bland. Inkuber i 45 minutter ved RT. Forbered en ny 96-brønns PCR-plate og aliquot 35 μL antigenoppløsning i hver brønn.
- Mens platen fortsatt inkuberer, tilsett 13 μL 1 M Tris pH 9,0 buffer til hver brønn i antigenplaten. Tilsett buffer på siden av hver brønn for å begrense blandingen av Tris-buffer og antigen. Etter at inkubasjonen er fullført, ta 25 μL av det syrebehandlede serumet, og pipetter det umiddelbart inn i hver brønn på antigenplaten. Rør løsningen og dekk platen med PCR-tetningsfolie for å unngå lyseksponering.
- Ved RT, legg platen på en shaker, sett med lav hastighet, i 1 time. Oppbevar deretter platen ved 4 °C og la platen ruge i 18-24 timer.
6. Forbered multipleksplaten
- Ta en multiplexplate fra kjøleskapet på 4 °C og la platen komme til RT. Når multipleksplaten er på RT, tilsett 150 μL 3% blokkering A til hver brønn. Dekk multipleksplaten med tetningsfolie. Inkuber tallerkenen i et 4 °C kjøleskap over natten.
MERK: Analysedag 1 inkluderer trinn 4 til 6.
7. Overfør serum/antigen inkuberer inn i multiplexplaten
- Neste dag legger du papirhåndklær på bordet og tar den rugende multipleksplaten fra kjøleskapet. Tøm hele bufferen ut av platen. For å gjøre dette, snu platen opp ned og klapp den på de forberedte papirhåndklærne til det ikke er noen buffer tilstede i noen av brønnene.
- Vask multipleksplaten ved å tilsette 150 μL PBST i hver brønn. Forkast bufferen, som nevnt i trinn 7.1., og gjenta dette trinnet tre ganger. Tilsett 30 μL serum/antigen inkuberer i hver brønn i multipleksplaten. Dekk platen med folie for å begrense eksponeringen for lys. Plasser platen på en platerister, satt til lav hastighet, ved RT i 1 time.
8. Vask platen og legg til lesebuffer
- Fjern serum/antigen-inkubasjonene fra multipleksplaten ved å holde platen opp ned og flikke ut oppløsningen. Tilsett 150 μL PBST i alle brønnene og fjern bufferen fra platen ved igjen å holde platen opp ned og flikke ut løsningen. Gjenta dette trinnet tre ganger. Etter at den tredje vasken er fullført, tilsett 150 μL avlesningsbuffer i hver brønn.
MERK: Luftbobler forstyrrer platelesermaskinens evne til å analysere platens resultater nøyaktig og bør unngås for enhver pris.
9. Les platen og analyser data
- Tell den forberedte platen på platelesermaskinen, og les alle verdiene i antall per sekund (CPS).
- Beregn den relative indeksen for analysen, ved hjelp av antistoffnivåene oppnådd fra platelesermaskinen, med følgende ligning:
Indeksverdi = [CPS (utvalg) - CPS (negativ standard)] / [CPS (positiv standard) - CPS (negativ standard)]. - Bestem hvilke antistoffresultater som er negative eller positive ved hjelp av avskjæringene som er etablert.
MERK: Analysedag 2 inkluderer trinn 7 til 9.
Representative Results
Analyse av analyseresultater er vist i tabell 1, tabell 2 og tabell 3. Leseverdier kommer fra dataene fra de 10 stedene i samme brønn. Indeksverdier for hvert utvalg ble beregnet mot tilsvarende interne positive og negative kontroller som beskrevet i analyseprotokollen. Eksempler på dårlige duplikater er vist i tabell 1 og forårsaket den endelige indeksberegningsfeilen i tabell 3. Alle rå telleverdier må kontrolleres for å unngå falske positive eller falske negative resultater.
Den 7-multipleksede ECL-analysen ble validert ved hjelp av en stor kohort av prøver fra 1026 nydiagnostiserte pasienter med T1D og 1022 alder og kjønn matchet friske kontrollpersoner. Nivåene av autoantistoffer fra 7-Plex ECL-analyse for 1026 T1D-pasienter ble sammenlignet med nivåene fra hver av våre tilsvarende etablerte enkelt-ECL-analyser som vist i figur 2 og fra hver tilsvarende enkelt standard RBA og ELISA som vist i figur 3. Analysespesifisitetene ble satt opp identiske ved99-prosentiler for alle autoantistoffanalyser bortsett fra tyreoideaautoantistoffer (der 95-prosentilen ble brukt), av 1022 friske kontroller for alle tre analysemetodene (7-Plex ECL, single ECL, RBA eller ELISA) som listet opp i tabell 4. Mellomanalyse-CV-ene til GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA og IFNαA er henholdsvis 6,4 %, 4,5 %, 9,1 %, 4,9 %, 5,7 %, 11,3 % og 5,9 %.
Et lite antall uoverensstemmende prøver for hver av de 7 autoantistoffene ble funnet rundt grensen for avskjæringer for hver analyse (figur 2 og figur 3). Elleve kontrollprøver (11/1022, 1,1 %) ble funnet flere autoantistoffpositive bare i 7-Plex-analysen og negative i hver tilsvarende enkeltanalyse. Tilsvarende skjedde det i 9 prøver av T1D-pasientene (9/1026, 0,9%). I tillegg ble 10 høy positiv TPOA og en ThGA i pasientkohort som ble sett i både enkelt ECL-analyse og RBA savnet i 7-Plex-analysen. Disse prøvene ble konvertert positive i 7-Plex-analysen da de ble ytterligere fortynnet. Generelt ble 100 % av positiviteten i enkelt ECL-analyse eller RBA dekket i 7-Plex ECL-analysen, med samme analysespesifisitet som illustrert i tabell 4.
Figur 1: Illustrasjon av Mutiplex ECL-analysen.
Autoantistoffer i serum vil bygge bro mellom Ru Sulfo-NHSged-antigenet og det biotinylerte antigenet. Dette er kombinert med en spesifikk linker for å danne et kompleks av antigen-antistoff-antigen-linker. Kompleksene fanges opp på platen og holdes tilbake til sine spesifikke flekker gjennom hver enkelt linker. De spesifikt koblede linkertallene, for de 7 forskjellige antigenproteinene, er illustrert. Påvisning av antistoffsignaler oppnås ved bruk av Ru Sulfo-NHS-merkede antigener med elektrokjemiluminescens. Figuren er fra Gu, Y. et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sammenligning av 7 autoantistoffnivåer hos 1026 nyinnsettende pasienter med T1D mellom den enkle ECL-analysen og 7-plex ECL-analysen.
Panelene a, b, c, d, e, f og g viser sammenligninger av autoantistoffnivåer for henholdsvis GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA og IFNαA. De stiplede linjene representerer analyseavskjæringene for hver autoantistoffanalyse. Grenseverdiene ble satt til 99-prosentilen av 1022 aldersmatchede friske kontroller for hver analyse (unntatt TPOA og ThGA som ble satt til 95-prosentilen), som vist i tabell 4, fra 1022 aldersmatchede friske kontroller for både enkelt- og multipleks-ECL-analyser. Røde lukkede diamanter er merket som "falske" positive i 7-Plex ECL-analysen, <1% av kohorten som ble studert, og de ble validert som negative i både enkelt ECL og RBA. Røde nære firkanter er merket som "falske" negativer i 7-Plex ECL-analysen forårsaket av "prozone" -fenomenet, hovedsakelig forekommende i TPOA-analysen i <1% av kohorten som ble studert. Begge disse falske positive og falske negative resultatene diskuteres i diskusjonsdelen. Figuren er fra Gu, Y. et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sammenligning av 7 autoantistoffnivåer hos 1026 nyoppståtte pasienter med T1D mellom RBA (ELISA for IFNαA) og 7-Plex ECL-analysen.
Panelene a, b, c, d, e, f og g presenterer sammenligninger av autoantistoffnivåer for henholdsvis GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA og IFNαA. De stiplede linjene representerer analyseavskjæringene for hver autoantistoffanalyse, det samme spesifisitetssettet for både RBA- og 7-Plex ECL-analysen, som vist i tabell 4, fra 1022 aldersmatchede sunne kontroller. Røde lukkede diamanter og firkanter representerer "falske" positiver og "falske" negativer som vises i 7-Plex ECL-analysen, det samme er vist i figur 2. Figuren er fra Gu, Y. et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| En | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | linker-1 |
| 100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | linker-2 | |
| 115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | Linker-3 | |
| 67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | Linker-4 | |
| 89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | linker-5 | |
| 87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | Linker-6 | |
| 94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | Linker-7 | |
| 75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | Linker-8 | |
| 98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | Linker-9 | |
| 102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | linker-10 | |
| B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | linker-1 |
| 101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | linker-2 | |
| 111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | Linker-3 | |
| 72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | Linker-4 | |
| 81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | linker-5 | |
| 90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | Linker-6 | |
| 101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | Linker-7 | |
| 82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | Linker-8 | |
| 92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | Linker-9 | |
| 83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | linker-10 | |
| C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | linker-1 |
| 5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | linker-2 | |
| 114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | Linker-3 | |
| 64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | Linker-4 | |
| 94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | linker-5 | |
| 77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | Linker-6 | |
| 77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | Linker-7 | |
| 73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | Linker-8 | |
| 86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | Linker-9 | |
| 105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | linker-10 | |
| D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | linker-1 |
| 288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | linker-2 | |
| 109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | Linker-3 | |
| 78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | Linker-4 | |
| 79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | linker-5 | |
| 83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | Linker-6 | |
| 87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | Linker-7 | |
| 74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | Linker-8 | |
| 68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | Linker-9 | |
| 86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | linker-10 | |
| E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | linker-1 |
| 101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | linker-2 | |
| 6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | Linker-3 | |
| 66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | Linker-4 | |
| 102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | linker-5 | |
| 82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | Linker-6 | |
| 85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | Linker-7 | |
| 72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | Linker-8 | |
| 77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | Linker-9 | |
| 114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | linker-10 | |
| F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | linker-1 |
| 101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | linker-2 | |
| 406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | Linker-3 | |
| 72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | Linker-4 | |
| 76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | linker-5 | |
| 88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | Linker-6 | |
| 104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | Linker-7 | |
| 76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | Linker-8 | |
| 85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | Linker-9 | |
| 131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | linker-10 | |
| G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | linker-1 |
| 99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | linker-2 | |
| 119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | Linker-3 | |
| 76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | Linker-4 | |
| 88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | linker-5 | |
| 73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | Linker-6 | |
| 5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | Linker-7 | |
| 80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | Linker-8 | |
| 96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | Linker-9 | |
| 98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | linker-10 | |
| H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | linker-1 |
| 107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | linker-2 | |
| 114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | Linker-3 | |
| 77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | Linker-4 | |
| 92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | linker-5 | |
| 87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | Linker-6 | |
| 328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | Linker-7 | |
| 75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | Linker-8 | |
| 73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | Linker-9 | |
| 113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | linker-10 | |
Tabell 1: Analyse av 7-plex ECL-analyse: rå CPS-tall (venstre halvdel av platen). Rå CPS-tellinger hentes fra en analyseplate (venstre halvdel av platen), og hver prøve utføres i duplikat. Under hver rad på platen (A-H) er det 10 linjer med leseverdier som representerer dataene fra de 10 stedene i samme brønn, tilsvarende hvert koblingsnummer som merket. Eksempler på dårlige duplikater er uthevet i grått, som vist i rad F-linker 3-kolonne 5 og 6.
| Raden i tabell 1A | Kolonne i tabell 1A | linker 1 | linker 2 | linker 3 | linker 7 | linker 8 | linker 9 | linker 10 | |
| En | 1-2 | GADA PC | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
| B | 1-2 | GADA lav PC | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
| C | 1-2 | TPOA PC | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
| D | 1-2 | TPOA lav PC | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
| E | 1-2 | TGA PC | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
| F | 1-2 | TG Lav PC | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
| G | 1-2 | ThGA PC | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
| H | 1-2 | ThGA Lav PC | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
| En | 3-4 | IAA PC | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
| B | 3-4 | IAA lav PC | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
| C | 3-4 | IFNaA PC | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
| D | 3-4 | IFNaA lav PC | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
| E | 3-4 | IA-2A PC | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
| F | 3-4 | IA-2A lav PC | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
| G | 3-4 | NC | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
| H | 3-4 | NC | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
| En | 5-6 | utvalg1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
| B | 5-6 | utvalg2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
| C | 5-6 | utvalg3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
| D | 5-6 | Utvalg 4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
| E | 5-6 | Utvalg5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
| F | 5-6 | Utvalg6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
| G | 5-6 | utvalg7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
| H | 5-6 | Utvalg8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
Tabell 2: Analyse av 7-plex ECL-analyse: arrangement av tabell 1-dataene, merket som 7 linkere. Dataene fra tabell 1 ble omorganisert, med lenkene 4 til 6 (ikke brukt) slettet, og gjennomsnittsverdier ble beregnet ut fra hver duplikatavlesning fra tabell 1. Verdiene av den interne standarden høye og lave positive kontroller, tilsvarende hver autoantistoffanalyse, begrenset av en bestemt linker, er i mørk fet skrift. PC, positiv kontroll. NC, normal kontroll.
| GAD-indeks | TPOA-indeks | TGA-indeks | ThGA-indeksen | IAA-indeks | IFNaA-indeks | IA-2A-indeks | |
| GADA PC | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
| GADA lav PC | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
| IAA PC | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
| IAA lav PC | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
| IA-2A PC | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
| IA-2A lav PC | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
| TGA PC | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
| TG Lav PC | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
| TPOA PC | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
| TPOA lav PC | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
| ThGA PC | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
| ThGA Lav PC | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
| IFNaA PC | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
| IFNaA lav PC | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
| NC | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| NC | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
| utvalg1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
| utvalg2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
| utvalg3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
| Utvalg 4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
| Utvalg5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
| Utvalg6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
| utvalg7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
| Utvalg8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
Tabell 3: Analyse av 7-plex ECL-analyse: resultater av indeksverdier. Indeksverdier for hver prøve for alle de 7 autoantistoffanalysene ble beregnet mot tilsvarende interne positive og negative kontroller som beskrevet i analyseprotokollen. Alle indeksverdier som var større enn grenseverdien, ble definert som et positivt resultat, vist med fet skrift. TGA-indeksverdien for utvalg6 ble uthevet i grått da det er en feil forårsaket av dårlige duplikater vist i rad F-linker 3-kolonne 5 og 6 i tabell 1.
| GADA | IA-2A | IAA | .TGA | TPOA | ThGA | IFNαA* | ||||||||
| Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | |
| RBA | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
| Enkel ECL | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
| 7-plex ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
Tabell 4: Analysesensitivitet og spesifisitet blant 1026 T1D-pasienter og 1022 kontroller, matchet for både alder og kjønn, i en 7-plex ECL-analyse, sammenlignet med den tilsvarende enkeltECL-analysen og RBA eller ELISA*. Ulikeanalyser (RBA, enkelt ECL og 7-Plex ECL) for hvert autoantistoff ble satt til lignende spesifisiteter ved bruk av 1022 alder og kjønn matchet sunne kontroller. Spesifisitetsresultatet fra kontrollkohorten som ble studert ble satt til rundt 95 % for TPOA og ThGA og til 99 % for de 5 andre analysene. * Stjerne markerer IFNαA-analysen for ELISA, mens andre er RBA.
Discussion
I en rekke nasjonale og internasjonale kliniske studier for type 1 diabetes har ytelsen til den eneste ECL-analysen for å oppdage holmeautoantistoffer og autoantistoffer mot transglutaminase (TGA) for cøliaki, blitt underbygget 8,9,10,11. Gjennom disse sporene har denne analysen økt følsomheten og spesifisiteten for autoantigendeteksjon når den vurderes mot den eksisterende "gull" -standarden RBA. Den forbedrede sykdomsspesifisiteten kan ses ved diskriminering av autoantistoffer med høy affinitet og høyrisiko øyer fra signaler med lav risiko og lav affinitet, mellom den enkelte ECL-analysen og RBA 14,15,16,17. Basert på den enkle ECL-analysen utgjør vi en ny high throughput multiplekset ECL autoantistoffanalyse, slik at vi kan screene for T1D samt flere aktuelle autoimmune sykdommer samtidig.
Multiplex ECL-analysen bruker multipleksplaten, som kan kombinere opptil 10 autoantistoffanalyser i en enkelt brønn. For denne studien er 7 autoantistoffanalyser kombinert sammen. Autoantistoffene består av 3 IAbs (IAA, GADA og IA-2A), 2 autoimmune thyroid disease autoantistoffer (TPOA og ThGA), cøliaki autoantistoffer (TGA) og APS-1 autoantistoffer mot interferon alfa (IFNαA). Analysemekanismen er generelt basert på en enkelt ECL-analyse som tidligere publisert 9,10,12,18 med noen modifikasjoner. Hovedforskjellen i en multipleks ECL-analyse fra en enkelt ECL-analyse er at hvert antistoff-antigenkompleks dannet i væskefasen er begrenset til en spesifikk linker (figur 1). Biotinmerket antigen inkuberes med Streptavidin-konjugert, en linker som brukes til å danne et spesifikt antigenlinkerkompleks. Antistoff-antigen immunkompleks dannes etter inkubasjon med pasientserum og fanges på et bestemt sted gjennom det spesifikke linkersystemet på hver brønn i multiplexplaten. Ru Sulfo-NHS merket antigen fanget av antistoffer gir samtidig signalet med elektrokjemiluminescens. Platelesermaskinen kan oppdage opptil 10 forskjellige signaler fra spotkildene i hver brønn. For å holde autoantistoffanalyser konsistente mellom plater og mens du utfører langsiktige studier, foreslår vi at samme linker brukes.
Før du konfigurerer en multipleks-ECL-analyse, må enkle ECL-analyser for hvert autoantistoff optimaliseres på henholdsvis en multipleksplate og valideres mot både RBA- og enkeltECL-analyser på en vanlig ECL-plate. For å forbedre sjakkbrettanalysen, til den relaterte autoantistoffanalysen på multiplexplaten, ble det brukt en høy positiv pasient og en negativ pasientprøve. Etter at sjakkbrettanalysen ble utført, ble de mest ideelle konsentrasjonene for Ru Sulfo-NHS og biotin merket antigen beregnet for hver av de 7 autoantistoffanalysene. Følgende viser disse konsentrasjonene: 30 ng / ml og 200 ng / ml for GAD65, 120 ng / ml og 120 ng / ml for proinsulin, 10 ng / ml og 42 ng / ml for IA-2, 80 ng / ml og 80 ng / ml for TG, 8 ng / ml og 16 ng / ml for TPO, 31 ng / ml og 31 ng / ml for ThG, og henholdsvis 12 ng/ml og 12 ng/ml for IFNα13. Konsentrasjonene av noen av antigenene fra sjakkbrettanalysen må kanskje justeres ytterligere i henhold til resultatene i den faktiske multipleksanalysen etter å ha kombinert alle analysene sammen.
Siden IAA er inkludert i den foreliggende multipleks-ECL-analysen, er syrebehandling av serumprøver obligatorisk før seruminkubering med antigen, som rapportert i forrige studie12. Vanligvis, når et ekstra autoantistoff legges til en multipleksanalyse, påvirkes analysebakgrunnen, og et ekstremt høyt signal fra ett sted, i brønnen, kan hindre resultatene av nærliggende flekker via crosstalk. Derfor må maksimal CPS begrenses til 20 000 tellinger for hvert autoantistoff, eller lavere, for de høyeste positive prøvene. Fra vår kunnskap, for å redusere mengden crosstalk involvert, bør autoantistoffer som har lavere bakgrunn skilles når du designer spotkartet, langt fra flekker med høyere frekvens av teller.
Høye positive og negative kontroller ble brukt internt i hver analyse for å beregne en nøyaktig indeks for de ukjente prøvene som ble testet. For å nøyaktig vurdere og overvåke analysens følsomhet ble det brukt lave positive kontroller, satt nær analysens øvre grense. Disse standard positive og negative kontrollene ble opprettet i bulk og aliquot for langvarig bruk og lagret ved -20 ° C eller under, for konsistens mellom analyser. For kvalitetssikringsformål ble prøvene kjørt to ganger i hver analyse, og hvert positive resultat ble reran og bekreftet ved å kjøre prøven i en ny ECL-analyse neste dag. Hvis det var uenighet med den første og andre bekreftende analysen, var en tredje analyse nødvendig. Av de tre analysene som ble utført, bestemte resultatene av de to analysene som er enige (f.eks. +, + eller -,-), det endelige resultatet (positivt eller negativt) av prøven.
I løpet av det siste tiåret søker mange studiegrupper en høy gjennomstrømningsanalyse ved å bruke multiplex-metoden for å kombinere flere autoantistoffanalyser sammen i en brønn for å skjerme store populasjoner. Det er noen få studier som bruker forskjellige typer teknologier for å utføre multiplex autoantistoffanalyser 19,20,21,22, men det er ingen sammenligning for noen av disse analysene i følsomhet og spesifisitet mot den nåværende 'gull' standarden RBA, når man studerer T1D. Disse forskjellige typer plattformer som brukes, valideres ikke gjennom det internasjonale Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) verkstedet eller gjennom testing av store kohorter i kliniske studier. I en nylig generell populasjonsbasert screening i Tyskland blir en kombinert analyse med høy gjennomstrømning, 3 Screen ICATM ELISA distribuert av Kronus, brukt som et verktøy for førstelinjescreening for å oppdage tre IAbs, GADA, IA-2A og ZnT8A, for å oppnå tidlig diagnose av barndommen T1D23. 3-Screen ELISA-analysen måler 3 autoantistoffer enten i 3 separerte brønner, forbruker et stort volum serum, eller i en enkelt brønn med alle 3 analysene blandet. Hvis en brønn i 3-Screen ELISA-analysen er positiv, er man ikke i stand til å skille hvilken av tre autoantistoffer som er tilstede. Den største ulempen med denne analysen er dens manglende evne til å inkludere IAA-måling. Alle IAA-resultater utført av ELISA, som bevist i IASP-workshops, har ikke en akseptabel følsomhet og spesifisitet24. IAA er vanligvis den første IAb som vises og har en høy prevalens blant små barn. IAb-screening, med IAA, er nødvendig for barn, og det anses ikke akseptabelt å gjennomføre denne screeningen uten IAA for å vurdere T1D-risiko i samfunnet. I tillegg er det ingen publiserte studier eller data som viser at Kronus IAb-settanalysen er mer T1D-sykdomsspesifikk og i stand til å diskriminere høy risiko fra lavrisiko IAbs. 7-Plex ECL-analysen ble i denne studien validert ved hjelp av en stor kohort av nydiagnostiserte pasienter med T1D13. Sammenlignet med dagens standard RBA og veletablerte enkelt ECL-analyse, er 7-Plex-analysen i stand til å beholde 100% positivitet med samme analysespesifisitet (tabell 4). For tiden blir 4-Plex ECL-analysen, parallelt med standard RBA, brukt på en pågående stor klinisk studie: Autoimmunity Screening for Kids (ASK) studie. Denne rettssaken skjermer barn i befolkningen generelt, i Denver storbyområdet, for T1D og cøliaki. Sammenlignet med standard RBA brukt i ASK-studien, viser multipleks-ECL-analysen utmerket sensitivitet og høyere sykdomsspesifisitet, identisk med våre tidligere rapporter ved bruk av enkelt ECL-studie25. Videre viste vår 4-plex ECL-analyse en uttalt reduksjon i arbeidskraft, kostnader og serumvolum med 70%, sammenlignet med de tilsvarende 4 enkeltanalysene for ECL og RBA. Ved hjelp av den multipleksede ECL-analysen kan vi tilpasse hver brønn med forskjellige tall, som representerer forskjellige autoantistoffer (opptil 10), for å teste for forskjellige autoimmune sykdommer som er spesifikke for behovene til et bestemt klinisk sted.
Det er observert noen begrensninger, vist i denne studien, for en multiplekset ECL-analyse ved bruk av multipleksplaten. Den endelige fortynningen av serum, inkubert med antigen, kan ikke justeres for å gi de mest optimale forholdene for hver enkelt autoantistoffanalyse som kombineres i en enkelt brønn. Ni prøver (9/1026), fra T1D-pasienter, ble observert å ha et falskt negativt resultat for bestemte autoantistoffer. 7 av de falske negativene var for TPOA og 2 var for ThGA, i 7-Plex ECL-analysen, men høye positive resultater ble vist i både enkelt ECL-analyse og RBA (figur 2 & 3). Etter ytterligere fortynning av alle 9 prøvene ble de positive på multiplexplaten. Dette resultatet er forårsaket av, hva vi beskriver som "prozone" fenomenet. Dette fenomenet fører til at prøven viser et falskt negativt resultat fordi de høye antistofftiterne påvirker dannelsen av antigenantistoffgitter. Ved oppsett av en multipleksanalyse anbefales det at prøver med svært høye titere for hvert av de kombinerte autoantistoffene kjøres forhåndstester for å identifisere valgfri fortynning av serum for antigeninkubasjon. Alternativt bør autoantistoffanalyser med lignende optimaliserte forhold velges for å danne en kombinert analyse hvorfra den beste analysefølsomheten og spesifisiteten oppnås for hvert autoantistoff. I denne studien resulterte 7 prøver (7/1022), fra friske normale kontroller, i falske positiver for flere autoantistoffer i 7-Plex-analysen, men etter å ha kjørt en enkelt ECL-analyse og RBA (figur 2 & 3) ble disse autoantistoffene funnet å være negative i begge analysene. Årsakene bak disse falske positive resultatene som forekommer på multiplexplaten, for disse små delmengdene av prøver, er foreløpig ukjente. For den nåværende anvendelsen av multipleks-ECL-analysen gjentas alle positive prøver med den tilsvarende enkelt-ECL-analysen for å bekrefte positivitet, noe som fjerner denne falske positive feilen fra multipleks-ECL-analysen.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd DK32083, JDRF Grants 2-SRA-2015-51-Q-R og 2-SRA-2018-533-S-B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 °C refrigerator | |||
| –80 °C and -20 °C freezers | |||
| 96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Acetic acid solution | Fisher | ||
| Aluminum foil | |||
| Antigen proteins | |||
| Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
| Human ThG full length protein | BioMart | ||
| Human TPO full length protein | BioMart | ||
| IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
| IFN-α protein | Abcam | ||
| Proinsulin protein | AmideBio | ||
| tTG protein | DiaRect | ||
| Biotin | Sigma | ||
| Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| Distilled deionized (DD) water | |||
| HCl | Fisher | ||
| Ice maker | |||
| Ice trays | |||
| MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
| Multi-channel pipette | |||
| NaOH | |||
| Paper tower | |||
| PBS | |||
| pH meter | |||
| Pipette-Aid | |||
| Pipettes/tips | |||
| Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| Uplex Development Kit | MSD | ||
| 96-well UPlex plate | MSD | ||
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Linker-Streptavidin | MSD | ||
| Read buffer | MSD | R92TC | |
| Stop Solution | MSD | ||
| Vortex mixer | |||
| ZeBa Column | Pierce | 89892 |
References
- Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
- Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
- Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
- Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).
- Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
- Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
- Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
- Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
- Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
- Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).
- Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
- Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
- Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
- Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
- Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
- Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
- Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).
