Summary
7 otoantikor testini bir araya getiren basit bir çoklanmış ECL testi modelliyoruz. Tahlil, çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom 1 dahil olmak üzere T1D ve diğer birçok otoimmün hastalığı aynı anda tarayabilir.
Abstract
Adacık otoantikorları (IAbs) tip 1 diyabet (T1D) tanı ve tahmininde yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsülin (IAA), glutamat dekarboksilaz-65 (GADA), insülinoma antijeni-2 (IA-2A) ve çinko taşıyıcı-8 (ZnT8A) olmak üzere dört ana IAb, hastalık tahmininde eşit derecede önemlidir. Halen, T1D tanısı alan hastaların% 40'ına kadarı diğer otoimmün bozuklukları geliştirmeye devam etmektedir. Ne yazık ki, ölçüm için tek bir otoantikor kullanan mevcut tarama yöntemleri, büyük ölçekli tarama çalışmaları için zahmetli ve verimsizdir. Yakın zamanda bu güncel sorunları ele almak için basit bir çoklanmış elektrokemilüminesans (ECL) testi geliştirdik. Tahlil, 7 otoantikor testinin tümünü tek bir kuyuda birleştirir. Her kuyucuk üç IAb (IAA, GADA ve IA-2A), otoimmün tiroid hastalığını tespit etmek için tiroid peroksidaz (TPOA) ve tiroid globuline (ThGA) karşı otoantikorlar, çölyak hastalığı için doku transglutaminazına (TGA) otoantikorlar ve otoimmün poliglandüler sendrom-1 (APS-1) için interferon alfaya (IFN�A) otoantikorlar içerir; bunların hepsi aynı anda T1D ve diğer ilgili otoimmün hastalıkları tarar. Multipleks ECL testi, tek ECL tahlil platformuna dayanır, ancak bunun yerine, 10'a kadar çoklu otoantikor tahlillerini tek bir kuyucukta birleştiren multipleks plakayı kullanır. Tek ECL tahlilinden temel farkı, sıvı fazında oluşan her antikor-antijen kompleksinin, multipleks plaka üzerindeki bir bağlayıcı sistem aracılığıyla her bir kuyucukta belirli bir noktaya tutulmasıdır. Bu çalışmada 7-Plex ECL testi, yeni teşhis edilen T1D hastalarının büyük bir kohortu ve yaşa uygun sağlıklı kontroller kullanılarak standart radyo-bağlayıcı testlere (RBA) ve tek ECL tahlillerine karşı doğrulanmıştır ve bu da mükemmel tahlil duyarlılığı ve özgüllüğü ile sonuçlanmıştır.
Introduction
Tip 1 diyabet (T1D) çocukluk çağında en sık görülen ciddi kronik bir hastalıktır. Şu anda, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 1,4 milyon insan T1D'ye sahiptir; Çarpıcı bir şekilde, T1D insidansı dünya çapında her yıl% 3-5 oranında istikrarlı bir şekilde artmaktadır ve son yirmi yılda, özellikle küçük çocuklarda 1,2 oranında iki katına çıkmıştır. Kan dolaşımındaki adacık otoantikorları (IAbs) şu anda en güvenilir biyobelirteçtir. IAbs, klinik T1D'nin3 gelişmesinden yıllar önce ortaya çıkabilir. Günümüzde T1D tanı ve risk taramasında insülin (IAA), glutamat dekarboksilaz-65 (GADA), insülinoma antijeni-2 (IA-2A) ve çinko taşıyıcı-8'e (ZnT8A) karşı otoantikorlar dahil olmak üzere dört ana IAb yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu dört IAb, T1D gelişiminin tahmininde eşit derecede önemlidir. T1D'nin sınıflandırılması son zamanlarda hastalık evresi 1 4 olarak normal bir glukoz metabolizmasına sahip herhangi bir 4 IAb'nin ≥2'sinin varlığı olarak yeniden tanımlanmıştır.
Gençlerde Diyabet Otoimmünite Çalışmasında (DAISY), T1D riski altındaki dört çocuktan birinin adacık, çölyak, tiroid veya romatoid otoimmüniteye ilerlemesinin muhtemel olduğu ve daha çarpıcı bir şekilde, T1D tanısı alan hastaların yaklaşık% 40'ının sonunda ek bir otoimmün durum geliştirdiği ortaya çıkmıştır 5,6,7 . Otoantikorların tanımlanması bu otoimmün hastalıkların öngörülmesi ve teşhisi için gereklidir ve hastalar için daha iyi klinik bakım sağlamalıdır. Şu anda bu çoklu otoimmün koşulları taramanın kolay ve ucuz bir yolu yoktur. Tek bir otoantikor ölçümü ile standart radyo-bağlayıcı tahlil (RBA) kullanan mevcut tarama yöntemleri, büyük ölçekli bir tarama için zahmetli ve verimsizdir.
Burada, tek bir ECL tahlil platformu 8,9,10,11 kullanarak doğruladığımız yeni geliştirilen basit çoklanmış ECL testini açıklayacağız. Multipleks ECL testi, sadece 15 μL serum kullanarak 7 otoantikor testini tek bir kuyucukta birleştirir ve çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve APS-1 dahil olmak üzere T1D ve çoklu ilgili otoimmün hastalıkları aynı anda tarayabilir. Bir ZnT8A ECL testi o sırada geliştirilmemişti ve çoklanmış tahlilde yer almadı. Multipleks ECL testi, T1D ve çoklu otoimmün hastalıklar için genel popülasyon taramasında yüksek verim için mükemmel bir araç sağlar.
Protocol
Araştırma protokolü Colorado Çoklu Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.
1. Tampon hazırlama
- Etiketleme tamponunu yapın (2x PBS, pH 7,9). 400 mL damıtılmış deiyonize (DD) su kullanarak, 100 mL 10x PBS ekleyin. Çözeltinin pH'ını ayarlamak için, 7.9'a ulaşana kadar NaOH ekleyin.
- 1 mg biyotin'i daha önce oluşturulan 588 μL etiketleme tamponuna çözerek 3 mM biyotin oluşturun. 150 nmol Ru Sulfo-NHS'yi 50 μL etiketleme tamponuna çözerek 3 mM Ru Sulfo-NHS yapın.
- 500 mL 1x PBS alarak ve çözeltiye 5 g sığır serum albümini (BSA) ekleyerek antijen tamponunu (% 1 BSA) yapın. 0.5 M asetik asit çözeltisi hazırlayın. Trizma Base kullanarak ve pH'ı 9.0'a ayarlayarak 1 M Tris-HCl tamponu hazırlayın.
- Kaplama tamponu için (%3 Bloker A), 500 mL 1x PBS alın ve 15 g Bloker A ekleyin. 5000 mL 1x PBS'yi 2,5 mL Ara 20 ile karıştırarak yıkama tamponunu (%0,05 Ara 20, PBST) hazırlayın. 500 mL DD su ve 500 mL 4x Yüzey Aktif Maddeli Okuma Arabelleği T ekleyerek okuma tamponu (yüzey aktif madde ile 2x Okuma Arabelleği T) oluşturun.
NOT: Tahliller arasındaki tutarlılığı korumak için, hem biyotin hem de Ru Sulfo-NHS çözeltilerinin etiketleme prosedüründen hemen önce oluşturulması ve gelecekte kullanılmak üzere oluşturulmaması ve saklanmaması önemlidir.
2. Her antijen proteininin biyotin ve Ru Sulfo-NHS ile ayrı ayrı etiketlenmesi
NOT: Daha etkili bir etiketleme reaksiyonuna sahip olmak için, ≥0.5 mg / mL'lik bir antijen protein konsantrasyonu kullanın.
- Her antijen proteininin molar sayısını ve biyotin ve Ru Sulfo-NHS'nin molar sayılarını hesaplayın. Antijen proteininin biyotin veya Ru Sulfo-NHS'ye molar oranına göre reaksiyonu etiketlemek için antijen proteinine uygun miktarda biyotin veya Ru Sulfo-NHS ekleyin.
- Proinsülin proteini gibi daha küçük moleküler ağırlığa (≤10 kDa) sahip antijen için, 1: 5'lik bir molar oran kullanın (antijen: biotin ve Ru Sulfo-NHS). GAD proteini gibi daha büyük moleküler ağırlığa (>50 kDa) sahip antijen için, 1:20'lik bir molar oran kullanın. Orta moleküler ağırlığa (10-50 kDa) sahip antijen için, 1:5-1:20 arasında ayarlanmış bir molar oran kullanın.
- Hem biyotin hem de Ru Sulfo-NHS için, her biri için antijen molar sayısını elde etmek için her antijen ağırlığını karşılık gelen moleküler ağırlıklarına bölün. Biotin hacmini elde etmek için molar sayıyı konsantrasyona bölün. Bunu Ru Sulfo-NHS için tekrarlayın.
- Antijen proteinini, adım 2.2'de belirlenen uygun molar oranı kullanarak biyotin ile karıştırın. O zaman Ru Sulfo-NHS için de aynısını yapın.
NOT: Etiketleme reaksiyonunun etkinliği için, tampon sistemindeki Tris veya glisin gibi indirgeyici kimyasalların, boyutlandırma spin sütunu tarafından 2x PBS tamponuna, pH 7.9'a değiştirilmesi gerekir. Biotin ve Ru Sulfo-NHS için etiketleme protokolleri aynıdır. - Reaksiyon tüplerini alüminyum folyo ile örtün ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. Reaksiyon tüplerinin folyo ile kaplanmasının nedeni, hem biyotin hem de Ru Sulfo-NHS reaktiflerinin ışığa duyarlı olmasıdır.
- Reaksiyon tüpleri inkübe olurken 2 mL veya 5 mL spin kolonunu astarlayın (spin kolonunun boyutu, kolona yüklenen hacimle belirlenir). Döndürme sütununu 2x PBS arabelleğe doldurun ve ardından her seferinde 2 dakika boyunca toplam üç kez 1.000 x g'de santrifüj yapın.
- Reaksiyon tüpleri inkübasyonu bitirdikten sonra etiketleme reaksiyonunu durdurun. Reaksiyonu durdurmak için, etiketli antijen proteinini spin kolonundan bir kez geçirerek saflaştırın. Ardından sütunu 2 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
- Mevcut antijen proteini miktarını nihai hacme bölerek toplam etiketli antijen konsantrasyonunu hesaplayın. Tüp başına saflaştırılmış etiketli antijen proteininin Aliquot 50 μL'si ve uzun süreli kullanım için alikotları -80 ° C'de saklayın.
NOT: Spin kolonunun antijen proteinini her geçtiğinde, yaklaşık% 90-95'lik bir retansiyon oranı olacağının farkında olmak önemlidir.
3. Tahlil için iki etiketli antijen için en iyi konsantrasyonu ve oranları tanımlayın (dama tahtası testi)
NOT: Bu 7-Plex testindeki ECL-IAA testi, serum örneklerinin asit tedavisini gerektirdiğinden, her antijen için dama tahtası testi, etiketli antijen karışımı ile inkübe edilmeden önce bu adımdan geçmelidir.
- Multipleks tahlilini çalıştırmadan önce her antijen için dama tahtası testini ayrı ayrı uygulayın. Adım 3.2-3.6'da örnek olarak GAD65 kullanılacaktır.
- Etiketli GAD65 proteininin seyreltilmesini hesaplayın. Biyotinile GAD65'in ilk karışım çözeltisinin önerilen hedeflenen konsantrasyonu 2000 ng / mL'dir ve GAD65 etiketli Ru Sulfo-NHS 1000 ng / mL'dir. Stok çözeltisinde hem biyotinile edilmiş hem de Ru Sulfo-NHS etiketli GAD65'in konsantrasyonu 1.0 μg / μL ise, 560 μL çalışma çözeltisinde biyotinile GAD65 için gereken hacim 1.12 μL olacak ve 700 μL çalışma çözeltisinde GAD65 etiketli Ru Sulfo-NHS için gereken hacim 0.7 μL olacaktır.
- 1.12 μL biyotinile GAD65 proteinini, bir tüpte 240 μL streptavidin-konjuge bağlayıcı 1 ve 160 μL% 1 BSA ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Tüpe 160 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 30 dakika daha inkübe edin.
- Seri seyreltme yapın. Karışımın 280 μL'sini yeni bir tüpe alın ve 1:2 seyreltme yapmak için 280 μL durdurma çözeltisi ekleyin. Birkaç yeni tüp hazırlayın. GAD65 antijeni etiketli biyotin için yatay seri seyreltme çalıştırmak üzere bu adımı tekrarlayın (önceki yayın12'ye bakın).
- 0.7 μL Ru Sulfo-NHS etiketli GAD65 (1 μg / μL) proteinini 700 μL durdurma çözeltisi ile karıştırın. Daha sonra karışımın 350 μL'sini yeni bir tüpe alın ve 1: 2 seyreltme yapmak için 350 μL durdurma çözeltisi ekleyin. Birkaç yeni tüp hazırlayın, GAD65 antijeni etiketli Ru Sulfo-NHS için dikey bir seri seyreltme çalıştırmak için bu adımı tekrarlayın.
- Her biri 0.75 mL'lik bir hacme sahip olan GADA için bir numune yüksek pozitif ve GADA için bir numune negatif olmak üzere iki serum örneği hazırlayın. Aliquot 15 μL pozitif serum, 96 kuyucuklu PCR plakasının sol yarısındaki her bir kuyucuğa. Aliquot 15 μL negatif serum, 96 kuyucuklu PCR plakasının sağ yarısındaki her bir kuyucuğa.
- Her bir kuyucuğa 18 μL 0,5 M asetik asit ekleyin ve karıştırın. RT'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Yeni bir 96 delikli PCR plakası hazırlayın. Seri seyreltmelere göre her bir kuyucuğa biyotin etiketli antijenin 17.5 μL'sini ve Ru Sulfo-NHS etiketli antijenin 17.5 μL'sini ekleyin (önceki yayın12'ye bakınız).
- Adım 5.2 ile 9.1 arasındaki adımlarda açıklanan diğer tahlil adımlarına devam edin.
- Yüksek pozitif numunelerden gelen sinyal oranını, karşılık gelen negatif numune sinyallerine karşı belirleyin. Biotin etiketli antijen ve Ru Sulfo-NHS etiketli antijen için en iyi konsantrasyonu, pozitif-negatif sinyalin en yüksek veya en yüksek oranına yakın olan noktayı tanımlayarak seçin. Bu oran hesaplamasında, negatif numunelerden elde edilen düşük arka plan sinyalini göz önünde bulundurun.
NOT: Dama tahtası testlerinden Ru Sulfo-NHS ve biotin etiketli antijen proteinlerinin optimal konsantrasyonları aşağıda gösterilmiştir: GAD65 için 30 ng/mL ve 200 ng/mL, proinsülin için 120 ng/mL ve 120 ng/mL, IA-2 için 10 ng/mL ve 42 ng/mL, TG için 80 ng/mL ve 80 ng/mL, TPO için 8 ng/mL ve 16 ng/mL, ThG için 31 ng/mL ve 31 ng/mL ve IFNα için 12 ng/mL ve 12 ng/mL.
4. Karışık bağlayıcı bağlantılı antijen çözeltisini oluşturun
- Dama tahtası testine dayanarak her antijen için en uygun konsantrasyonu seçin. Biyotin ve Ru Sulfo-NHS etiketli antijeni rasyonel çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
- Benzersiz biyotinile antijen proteinlerinin her birine farklı bağlayıcılar bağlayın. Bir 96 kuyucuklu plaka testi için, 4 μL biyotinile GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsülin, IFN-α ve IA-2 proteinini 240 μL streptavidin-konjuge bağlayıcı 1, 2, 3, 4, 8, 9 ve 10 ile ayrı bir tüpe karıştırın (Şekil 1). Daha sonra tüp başına 156 μL PBS / % 1 BSA ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Her tüpe 160 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve 30 dakika daha oda sıcaklığında inkübe edin. Her tüpten 400 μL bağlayıcı antijen alın ve 7 antijenin tümünü bir araya getirin. 1.2 mL durdurma çözeltisi ekleyin ve ardından karışıma GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsülin, IFN-α ve IA-2 antijeni etiketli 4 μL Ru Sulfo-NHS ekleyin. Şimdi antijen çözeltisi tahlilde kullanılmaya hazır.
5. Serum örneklerini etiketli antijenle inkübe edin
NOT: Bu 7-Plex tahlilindeki ECL-IAA testi, serum örneklerinin asit muamelesini gerektirdiğinden, her serum, bu 7-Plex testi için etiketli antijen karışımı ile inkübe edilmeden önce asit tedavi adımını gerektirir.
- 96 kuyucuklu bir PCR plakası için kuyucuk başına 15 μL serum aliquot. Her bir kuyucuğa 18 μL 0,5 M asetik asit ekleyin ve karıştırın. RT'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Her bir kuyucuğa yeni bir 96 delikli PCR plakası ve aliquot 35 μL antijen çözeltisi hazırlayın.
- Plaka hala inkübe halindeyken, antijen plakasındaki her kuyucuğa 13 μL 1 M Tris pH 9.0 tamponu ekleyin. Tris tamponu ve antijenin karışmasını sınırlamak için her bir kuyucuğun yanına tampon ekleyin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, asitle muamele edilmiş serumun 25 μL'sini alın ve hemen antijen plakasındaki her bir oyuğa pipetleyin. Çözeltiyi çalkalayın ve ışığa maruz kalmayı önlemek için plakayı PCR sızdırmazlık folyosu ile örtün.
- RT'de, plakayı 1 saat boyunca düşük bir hızda ayarlanmış bir çalkalayıcıya koyun. Daha sonra, plakayı 4 ° C'de saklayın ve plakanın 18-24 saat kuluçkaya yatmasına izin verin.
6. Multipleks plakayı hazırlayın
- 4 °C buzdolabından bir multipleks plaka alın ve plakanın RT'ye gelmesine izin verin. Multipleks plaka RT'ye ulaştığında, her bir kuyucuğa 150 μL% 3 Bloker A ekleyin. Multipleks plakayı sızdırmazlık folyosu ile örtün. Plakayı gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında kuluçkaya yatırın.
NOT: Tahlil Günü 1, 4 ile 6 arasındaki adımları içerir.
7. Serum/antijen inkübatörlerini multipleks plakaya aktarın
- Ertesi gün, kağıt havluları masaya yerleştirin ve inkübasyon multipleks plakasını buzdolabından alın. Arabelleğin tamamını plakadan boşaltın. Bunu yapmak için, plakayı baş aşağı çevirin ve kuyucukların hiçbirinde tampon bulunmayana kadar hazırlanan kağıt havluların üzerine yerleştirin.
- Multipleks plakayı her kuyucuğa 150 μL PBST ekleyerek yıkayın. Adım 7.1.'de belirtildiği gibi arabelleği atın ve bu adımı üç kez yineleyin. Multipleks plakadaki her kuyucuğa 30 μL serum/antijen inkübe ekleyin. Işığa maruz kalmasını sınırlamak için plakayı folyo ile örtün. Plakayı, RT'de 1 saat boyunca düşük bir hıza ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin.
8. Plakayı yıkayın ve okuma tamponu ekleyin
- Serum/antijen inkübatlarını multipleks plakadan plakayı baş aşağı tutarak ve çözeltiyi dışarı doğru iterek çıkarın. Tüm kuyucuklara 150 μL PBST ekleyin ve plakayı tekrar baş aşağı tutarak ve çözeltiyi dışarı atarak tamponu plakadan çıkarın. Bu adımı üç kez yineleyin. Üçüncü yıkama tamamlandıktan sonra, her bir oyuğa 150 μL Okuma tamponu ekleyin.
NOT: Hava kabarcıkları, plaka okuyucu makinesinin plakanın sonuçlarını doğru bir şekilde analiz etme yeteneğine müdahale eder ve ne pahasına olursa olsun kaçınılmalıdır.
9. Plakayı okuyun ve verileri analiz edin
- Hazırlanan plakayı plaka okuyucu makinesinde sayın, tüm değerleri saniye başına sayım (CPS) cinsinden okuyun.
- Plaka okuyucu makinesinden elde edilen antikor seviyelerini kullanarak tahlil için göreceli indeksi aşağıdaki denklemle hesaplayın:
Dizin değeri = [CPS (örnek) - CPS (negatif standart)] / [CPS (pozitif standart) - CPS (negatif standart)]. - Oluşturulan kesikleri kullanarak hangi antikor sonuçlarının negatif veya pozitif olduğunu belirleyin.
NOT: Tahlil Günü 2, 7'den 9'a kadar olan adımları içerir.
Representative Results
Tahlil sonuçlarının analizi Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3'te gösterilmiştir. Okuma değerleri, aynı kuyu içindeki 10 noktadan gelen verilerden gelir. Her numune için indeks değerleri, tahlil protokolünde açıklandığı gibi karşılık gelen iç pozitif ve negatif kontrollere karşı hesaplanmıştır. Hatalı yineleme örnekleri Tablo 1'de gösterilmiştir ve Tablo 3'te son dizin hesaplama hatasına neden olmuştur. Yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlardan kaçınmak için tüm ham sayım değerleri kontrol edilmelidir.
7-multipleks ECL testi, T1D'li 1026 yeni tanı konmuş hastadan alınan örneklerin büyük bir kohortu kullanılarak doğrulandı ve 1022 yaş ve cinsiyet uyumlu sağlıklı kontrol denekleri. 1026 T1D hastaları için 7-Plex ECL testinden elde edilen otoantikorların seviyeleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi karşılık gelen tek ECL tahlillerimizin her birinden ve Şekil 3'te gösterildiği gibi karşılık gelen her bir standart RBA ve ELISA'dan alınan seviyelerle karşılaştırılmıştır. Tahlil özgüllükleri, tiroid otoantikorları (95. persentilin kullanıldığı yerlerde) dışındaki tüm otoantikor tahlilleri için 99. persentillerde, Tablo 4'te listelenen üç tahlil yönteminin (7-Plex ECL, tek ECL, RBA veya ELISA) 1022 sağlıklı kontrolünün aynısı olarak ayarlanmıştır. GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA ve IFN�A'nın tahliller arası özgeçmişleri sırasıyla %6.4, %4.5, %9.1, %4.9, %5.7, %11.3 ve %5.9'dur.
7 otoantikorun her biri için az sayıda uyumsuz örnek, her tahlil için kesiklerin sınır çizgisi etrafında bulundu (Şekil 2 ve Şekil 3). On bir kontrol örneğinde (11/1022, %1.1) sadece 7-Plex testinde çoklu otoantikor pozitif, karşılık gelen her bir testte negatif bulundu. Benzer şekilde, T1D hastalarının 9 örneğinde de görüldü (9/1026,% 0.9). Ek olarak, 7-Plex testinde hem de RBA'da görülen hasta kohortunda 10 yüksek pozitif TPOA ve bir ThGA kaçırıldı. Bu örnekler, daha fazla seyreltildiğinde 7-Plex testinde pozitif olarak dönüştürüldü. Genel olarak, tek ECL tahlilinde veya RBA'da pozitifliğin% 100'ü, Tablo 4'te gösterildiği gibi aynı tahlil özgüllüğü ile 7-Plex ECL testinde ele alınmıştır.
Resim 1: Mutiplex ECL testinin çizimi.
Serumdaki otoantikorlar Ru Sulfo-NHSged antijenini biyotinile antijene bağlayacaktır. Bu, bir antijen-antikor-antijen-bağlayıcı kompleksi oluşturmak için spesifik bir bağlayıcı ile birleştirilir. Kompleksler plakaya yakalanır ve her bir özel bağlayıcı aracılığıyla belirli noktalarına kadar tutulur. 7 farklı antijen proteini için özel olarak bağlanmış bağlayıcı sayıları gösterilmiştir. Antikor sinyallerinin tespiti, elektrokemilüminesanslı Ru Sulfo-NHS etiketli antijenler kullanılarak gerçekleştirilir. Şekil Gu, Y. ve ark.13'tendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: T1D'li 1026 yeni başlangıçlı hastada 7 otoantikor düzeyinin tek EKL testi ile 7-Plex EKL testi arasında karşılaştırılması.
A, b, c, d, e, f ve g panelleri sırasıyla GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA ve IFNαA için otoantikor seviyelerinin karşılaştırmalarını gösterir. Noktalı çizgiler, her otoantikor testi için tahlil kesiklerini temsil eder. Kesikler, Tablo4'te gösterildiği gibi, her bir tahlil için 1022 yaş uyumlu sağlıklı kontrolün 99. yüzdelik dilimine (95. yüzdelik dilime ayarlanmış TPOA ve ThGA hariç), hem tek hem de multipleks ECL testleri için 1022 yaş eşleştirilmiş sağlıklı kontrollerden ayarlanmıştır. Kırmızı kapalı elmaslar, incelenen kohortun% <1'i olan 7-Plex ECL testinde 'yanlış' pozitifler olarak işaretlenmiştir ve hem tek ECL hem de RBA'da negatif olarak doğrulanmıştır. Kırmızı yakın kareler, 'prozon' fenomeninin neden olduğu 7-Plex ECL testinde, esas olarak incelenen kohortun% <1'inde TPOA testinde meydana gelen 'yanlış' negatifler olarak işaretlenmiştir. Bu yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçların her ikisi de tartışma bölümünde tartışılmaktadır. Şekil Gu, Y. ve ark.13'tendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: T1D'li 1026 yeni başlangıçlı hastada RBA (IFNαA için ELISA) ve 7-Plex ECL testi arasında 7 otoantikor seviyesinin karşılaştırılması.
Panel a, b, c, d, e, f ve g sırasıyla GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA ve IFNαA için otoantikor düzeylerinin karşılaştırmalarını sunar. Noktalı çizgiler, her otoantikor testi için tahlil kesiklerini, hem RBA hem de 7-Plex ECL testi için ayarlanan aynı özgüllüğü, Tablo 4'te gösterildiği gibi, 1022 yaş uyumlu sağlıklı kontrollerden temsil eder. Kırmızı kapalı elmaslar ve kareler, 7-Plex ECL testinde görünen 'yanlış' pozitifleri ve 'yanlış' negatifleri temsil eder, aynısı Şekil 2'de gösterilmiştir. Şekil Gu, Y. ve ark.13'tendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| A | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | bağlayıcı-1 |
| 100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | bağlayıcı-2 | |
| 115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | bağlayıcı-3 | |
| 67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | bağlayıcı-4 | |
| 89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | bağlayıcı-5 | |
| 87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | bağlayıcı-6 | |
| 94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | bağlayıcı-7 | |
| 75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | bağlayıcı-8 | |
| 98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | bağlayıcı-9 | |
| 102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | bağlayıcı-10 | |
| B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | bağlayıcı-1 |
| 101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | bağlayıcı-2 | |
| 111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | bağlayıcı-3 | |
| 72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | bağlayıcı-4 | |
| 81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | bağlayıcı-5 | |
| 90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | bağlayıcı-6 | |
| 101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | bağlayıcı-7 | |
| 82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | bağlayıcı-8 | |
| 92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | bağlayıcı-9 | |
| 83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | bağlayıcı-10 | |
| C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | bağlayıcı-1 |
| 5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | bağlayıcı-2 | |
| 114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | bağlayıcı-3 | |
| 64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | bağlayıcı-4 | |
| 94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | bağlayıcı-5 | |
| 77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | bağlayıcı-6 | |
| 77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | bağlayıcı-7 | |
| 73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | bağlayıcı-8 | |
| 86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | bağlayıcı-9 | |
| 105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | bağlayıcı-10 | |
| D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | bağlayıcı-1 |
| 288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | bağlayıcı-2 | |
| 109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | bağlayıcı-3 | |
| 78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | bağlayıcı-4 | |
| 79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | bağlayıcı-5 | |
| 83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | bağlayıcı-6 | |
| 87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | bağlayıcı-7 | |
| 74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | bağlayıcı-8 | |
| 68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | bağlayıcı-9 | |
| 86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | bağlayıcı-10 | |
| E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | bağlayıcı-1 |
| 101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | bağlayıcı-2 | |
| 6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | bağlayıcı-3 | |
| 66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | bağlayıcı-4 | |
| 102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | bağlayıcı-5 | |
| 82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | bağlayıcı-6 | |
| 85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | bağlayıcı-7 | |
| 72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | bağlayıcı-8 | |
| 77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | bağlayıcı-9 | |
| 114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | bağlayıcı-10 | |
| F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | bağlayıcı-1 |
| 101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | bağlayıcı-2 | |
| 406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | bağlayıcı-3 | |
| 72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | bağlayıcı-4 | |
| 76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | bağlayıcı-5 | |
| 88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | bağlayıcı-6 | |
| 104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | bağlayıcı-7 | |
| 76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | bağlayıcı-8 | |
| 85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | bağlayıcı-9 | |
| 131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | bağlayıcı-10 | |
| G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | bağlayıcı-1 |
| 99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | bağlayıcı-2 | |
| 119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | bağlayıcı-3 | |
| 76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | bağlayıcı-4 | |
| 88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | bağlayıcı-5 | |
| 73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | bağlayıcı-6 | |
| 5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | bağlayıcı-7 | |
| 80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | bağlayıcı-8 | |
| 96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | bağlayıcı-9 | |
| 98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | bağlayıcı-10 | |
| H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | bağlayıcı-1 |
| 107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | bağlayıcı-2 | |
| 114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | bağlayıcı-3 | |
| 77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | bağlayıcı-4 | |
| 92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | bağlayıcı-5 | |
| 87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | bağlayıcı-6 | |
| 328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | bağlayıcı-7 | |
| 75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | bağlayıcı-8 | |
| 73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | bağlayıcı-9 | |
| 113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | bağlayıcı-10 | |
Tablo 1: 7-plex ECL testinin analizi: ham CPS sayıları (plakanın sol yarısı). Ham CPS sayımları bir tahlil plakasından (plakanın sol yarısı) elde edilir ve her numune çift olarak gerçekleştirilir. Plakanın her satırının (A-H) altında, aynı kuyucuk içindeki 10 noktadan gelen verileri temsil eden ve işaretlenmiş her bağlayıcı numarasına karşılık gelen 10 satır okuma değeri vardır. Hatalı yineleme örnekleri, satır F-bağlayıcı 3-sütun 5 ve 6'da görüldüğü gibi gri renkle vurgulanır.
| Tablo 1A Satırı | Tablo 1A Sütunu | bağlayıcı 1 | bağlayıcı 2 | bağlayıcı 3 | bağlayıcı 7 | bağlayıcı 8 | bağlayıcı 9 | bağlayıcı 10 | |
| A | 1-2 | GADA PC | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
| B | 1-2 | GADA Düşük PC | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
| C | 1-2 | TPOA Bilgisayar | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
| D | 1-2 | TPOA Düşük PC | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
| E | 1-2 | TGA Bilgisayar | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
| F | 1-2 | TG Düşük PC | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
| G | 1-2 | ThGA Bilgisayar | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
| H | 1-2 | ThGA Düşük PC | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
| A | 3-4 | IAA Bilgisayar | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
| B | 3-4 | IAA Düşük PC | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
| C | 3-4 | IFNaA Bilgisayar | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
| D | 3-4 | IFNaA Düşük PC | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
| E | 3-4 | IA-2A Bilgisayar | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
| F | 3-4 | IA-2A Düşük PC | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
| G | 3-4 | NC | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
| H | 3-4 | NC | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
| A | 5-6 | örnek1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
| B | 5-6 | örnek2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
| C | 5-6 | örnek3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
| D | 5-6 | örnek4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
| E | 5-6 | örnek5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
| F | 5-6 | örnek6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
| G | 5-6 | örnek7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
| H | 5-6 | örnek8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
Tablo 2: 7-plex ECL testinin analizi: 7 bağlayıcı olarak işaretlenmiş Tablo 1 verilerinin düzenlenmesi. Tablo 1'deki veriler yeniden düzenlendi, 4 ile 6 arasındaki bağlayıcılar (kullanılmadı) silindi ve Tablo 1'deki her yinelenen okumadan ortalama değerler hesaplandı. Belirli bir bağlayıcı tarafından kısıtlanan her otoantikor testine karşılık gelen dahili standart yüksek ve düşük pozitif kontrollerin değerleri koyu renklidir. PC, pozitif kontrol. NC, normal kontrol.
| GAD-İndeks | TPOA-İndeks | TGA-İndeks | ThGA-İndeksi | IAA-Endeksi | IFNaA-Endeksi | IA-2A-İndeksi | |
| GADA PC | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
| GADA Düşük PC | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
| IAA Bilgisayar | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
| IAA Düşük PC | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
| IA-2A Bilgisayar | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
| IA-2A Düşük PC | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
| TGA Bilgisayar | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
| TG Düşük PC | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
| TPOA Bilgisayar | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
| TPOA Düşük PC | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
| ThGA Bilgisayar | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
| ThGA Düşük PC | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
| IFNaA Bilgisayar | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
| IFNaA Düşük PC | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
| NC | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| NC | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
| örnek1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
| örnek2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
| örnek3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
| örnek4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
| örnek5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
| örnek6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
| örnek7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
| örnek8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
Tablo 3: 7-plex ECL testinin analizi: indeks değerlerinin sonuçları. 7 otoantikor testinin tümü için her numunenin indeks değerleri, tahlil protokolünde açıklandığı gibi karşılık gelen iç pozitif ve negatif kontrollere karşı hesaplanmıştır. Kesme değerinden daha büyük olan herhangi bir endeks değeri, koyu kalın olarak gösterilen pozitif bir sonuç olarak tanımlanmıştır. Örnek6'nın TGA dizini değeri, Tablo 1'deki satır F-bağlayıcı 3-sütun 5 ve 6'da gösterilen hatalı yinelemelerin neden olduğu bir hata olduğu için gri renkle vurgulanmıştır.
| cesaret | IA-2A | IAA | .TGA | TPOA | ThGA | IFNαA* | ||||||||
| Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | Şili | Spec | |
| RBA (Mali İşler T | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
| Tek ECL | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
| 7-Plex ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
Tablo 4: 1026 T1D hastası ve 1022 kontrol arasında, 7 pleks ECL testinde, karşılık gelen tek EKL testi ve RBA veya ELISA* ile karşılaştırıldığında, hem yaş hem de cinsiyet için eşleştirilen tahlil duyarlılığı ve özgüllüğü. Her otoantikoriçin farklı tahliller (RBA, tek ECL ve 7-Plex ECL), 1022 yaş ve cinsiyet uyumlu sağlıklı kontroller kullanılarak benzer özgüllüklere ayarlandı. İncelenen kontrol kohortunun özgüllük sonucu, TPOA ve ThGA için% 95 civarında ve diğer 5 tahlil için% 99 olarak belirlenmiştir. *Yıldız işareti, ELISA için IFNαA testini işaretlerken, diğerleri RBA'dır.
Discussion
Tip 1 diyabet için çok sayıda ulusal ve uluslararası klinik çalışmada, çölyak hastalığı için adacık otoantikorlarını ve transglutaminaza (TGA) otoantikorlarını tespit etmek için tek ECL testinin performansı 8,9,10,11 olarak kanıtlanmıştır. Bu izler boyunca, bu tahlil, mevcut 'altın' standart RBA'ya göre değerlendirildiğinde otoantijen tespiti için duyarlılığı ve özgüllüğü arttırmıştır. Geliştirilmiş hastalık özgüllüğü, tek ECL testi ile RBA14,15,16,17 arasında, düşük riskli, düşük afiniteli sinyallerden yüksek afiniteli ve yüksek riskli adacık otoantikorları ayırt edildiğinde görülebilir. Tek ECL testine dayanarak, T1D'nin yanı sıra aynı anda uygulanabilir birkaç otoimmün hastalığı taramamızı sağlamak için yeni bir yüksek verimli çoklanmış ECL otoantikor testi sunuyoruz.
Multipleks ECL testi, 10 adede kadar otoantikor testini tek bir kuyucukta birleştirebilen multipleks plakayı kullanır. Bu çalışmada 7 otoantikor testi bir araya getirilmiştir. Otoantikorlar 3 IAbs (IAA, GADA ve IA-2A), 2 otoimmün tiroid hastalığı otoantikorları (TPOA ve ThGA), çölyak hastalığı otoantikorları (TGA) ve interferon alfaya (IFNαA) karşı APS-1 otoantikorlarından oluşur. Tahlil mekanizması, genel olarak, daha önce yayınlanmışolan 9,10,12,18 gibi bazı değişikliklerle tek bir ECL testine dayanmaktadır. Multipleks ECL testinin tek bir ECL tahlilinden temel farkı, sıvı fazında oluşan her bir antikor-antijen kompleksinin spesifik bir bağlayıcıya kısıtlanmasıdır (Şekil 1). Biyotin etiketli antijen, spesifik bir antijen-bağlayıcı kompleksi oluşturmak için kullanılan bir bağlayıcı olan Streptavidin konjuge ile inkübe edilir. Antikor-antijen immün kompleksi, hasta serumu ile inkübasyondan sonra oluşur ve multipleks plakanın her bir kuyucuğundaki spesifik bağlayıcı sistem aracılığıyla belirli bir noktaya yakalanır. Aynı zamanda antikorlar tarafından yakalanan Ru Sulfo-NHS etiketli antijen, elektrokemilüminesans ile sinyal sağlar. Plaka okuyucu makinesi, her bir kuyuda bulunan nokta kaynaklarından 10 adede kadar farklı sinyal algılayabilir. Otoantikor tahlillerini plakalar arasında tutarlı tutmak için ve uzun süreli çalışmalar yürütürken, aynı bağlayıcının kullanılmasını öneriyoruz.
Bir multipleks ECL testi yapmadan önce, her otoantikor için tek ECL tahlillerinin sırasıyla bir multipleks plaka üzerinde optimize edilmesi ve normal bir ECL plakasında hem RBA hem de tek ECL tahlillerine karşı doğrulanması gerekir. Dama tahtası testini arttırmak için, multipleks plaka üzerindeki ilgili otoantikor tahliline, yüksek pozitif hasta ve negatif hasta örneği kullanıldı. Dama tahtası testi yapıldıktan sonra, Ru Sulfo-NHS için en ideal konsantrasyonlar ve 7 otoantikor testinin her biri için hesaplanan biyotin etiketli antijen. Aşağıdaki konsantrasyonlar bu konsantrasyonları göstermektedir: GAD65 için 30 ng/mL ve 200 ng/mL, proinsülin için 120 ng/mL ve 120 ng/mL, IA-2 için 10 ng/mL ve 42 ng/mL, TG için 80 ng/mL ve 80 ng/mL, TPO için 8 ng/mL ve 16 ng/mL, ThG için 31 ng/mL ve 31 ng/mL, ve IFNα 13 için sırasıyla 12 ng / mL ve12 ng / mL. Dama tahtası tahlilinden bazı antijenlerin konsantrasyonlarının, tüm tahlilleri bir araya getirdikten sonra gerçek multipleks testindeki sonuçlara göre daha da ayarlanması gerekebilir.
IAA mevcut multipleks ECL testine dahil edildiğinden, önceki çalışmada bildirildiği gibi serum antijen ile inkübe edilmeden önce serum örneklerinin asit tedavisi zorunludur12. Genel olarak, bir multipleks testine ekstra bir otoantikor eklendiğinde, tahlil arka planı etkilenir ve kuyudaki bir noktadan gelen son derece yüksek bir sinyal, çapraz konuşma yoluyla yakındaki noktaların sonuçlarını engelleyebilir. Bu nedenle, maksimum CPS'nin her bir otoantikor için 20.000 sayımla veya en yüksek pozitif numuneler için daha düşük sayımla sınırlandırılması gerekir. Bildiğimiz kadarıyla, ilgili çapraz konuşma miktarını azaltmak için, nokta haritasını tasarlarken, daha yüksek sayım sıklığına sahip noktalardan uzak, daha düşük bir arka plana sahip otoantikorlar ayrılmalıdır.
Test edilen bilinmeyen numuneler için doğru bir indeks hesaplamak için her tahlilde dahili olarak yüksek pozitifler ve negatif kontroller kullanılmıştır. Tahlilin duyarlılığını doğru bir şekilde değerlendirmek ve izlemek için, tahlilin üst sınırına yakın ayarlanmış düşük pozitif kontroller kullanılmıştır. Bu standart pozitif ve negatif kontroller, uzun süreli kullanım için toplu ve aliquot olarak oluşturulmuş ve tahliller arasındaki tutarlılık için -20 °C veya altında saklanmıştır. Kalite güvencesi amacıyla, numuneler her tahlilde iki kez çalıştırıldı ve her olumlu sonuç tekrar çalıştırıldı ve numune ertesi gün yeni bir ECL tahlilinde çalıştırılarak doğrulandı. Birinci ve ikinci doğrulayıcı tahlil ile herhangi bir anlaşmazlık varsa, üçüncü bir tahlil gerekliydi. Yapılan üç tahlilden, aynı fikirde olan iki tahlilin sonuçları (örneğin, +, + veya -,-), numunenin nihai sonucunu (pozitif veya negatif) belirledi.
Son on yılda, birçok çalışma grubu, büyük popülasyonları taramak için çoklu otoantikor tahlillerini tek bir kuyuda birleştirmek için multipleks yöntemini kullanarak yüksek verimli bir tahlil aramaktadır. Multipleks otoantikor tahlilleri 19,20,21,22 yapmak için farklı teknolojiler kullanan birkaç çalışma vardır, ancak T1D'yi incelerken mevcut 'altın' standart RBA'ya karşı duyarlılık ve özgüllük açısından bu testlerin hiçbiri için bir karşılaştırma yoktur. Kullanılan bu farklı platform türleri, uluslararası Islet Autoantibody Standardizasyon Programı (IASP) çalıştayı veya klinik çalışmalarda büyük kohortların test edilmesi yoluyla doğrulanmamıştır. Almanya'da yakın zamanda yapılan genel popülasyon tabanlı bir taramada, Kronus tarafından dağıtılan yüksek verimli kombine bir tahlil, 3 Ekran ICATM ELISA, çocukluk T1D23'ün erken teşhisini sağlamak için üç IAb, GADA, IA-2A ve ZnT8A'yı tespit etmek için birinci basamak tarama aracı olarak kullanılmaktadır. 3 Ekranlı ELISA testi, 3 ayrı kuyuda, büyük miktarda serum tüketen veya 3 tahlilin hepsinin karıştırıldığı tek bir kuyucukta 3 otoantikoru ölçer. 3 Ekranlı ELISA testinde bir kuyu pozitifse, üç otoantikordan hangisinin mevcut olduğunu ayırt edemez. Bu tahlilin en büyük dezavantajı IAA ölçümünü dahil edememesidir. ELISA tarafından gerçekleştirilen tüm IAA sonuçları, IASP atölyelerinde kanıtlandığı gibi, kabul edilebilir bir duyarlılığa ve özgüllüğe sahip değildir24. IAA genellikle ortaya çıkan ilk IAb'dir ve küçük çocuklar arasında yüksek prevalansı vardır. IAA ile IAb taraması çocuklar için gereklidir ve toplumdaki T1D riskini değerlendirmek için IAA olmadan bu taramanın yapılması kabul edilemez. Ek olarak, Kronus IAb kit testinin daha T1D hastalığına özgü olduğunu ve yüksek riski düşük riskli IAb'lerden ayırt edebildiğini gösteren yayınlanmış bir çalışma veya veri yoktur. Bu çalışmada 7-Plex ECL testi, T1D13'lü yeni tanı konmuş hastaların büyük bir kohortu kullanılarak doğrulandı. Mevcut standart RBA ve köklü tek ECL testi ile karşılaştırıldığında, 7-Plex testi aynı tahlil özgüllüğü ile% 100 pozitifliği koruyabilir (Tablo 4). Şu anda, standart RBA'ya paralel olarak 4-Plex ECL testi, devam eden büyük bir klinik araştırmaya uygulanmaktadır: Çocuklar için Otoimmünite Taraması (ASK) çalışması. Bu çalışma, Denver metropol bölgesinin genel popülasyonundaki çocukları T1D ve çölyak hastalığı açısından taramaktadır. ASK çalışmasında kullanılan standart RBA ile karşılaştırıldığında, multipleks ECL testi, tek ECL çalışması25'i kullanan önceki raporlarımızla aynı olan mükemmel duyarlılık ve daha yüksek bir hastalık özgüllüğü göstermektedir. Ayrıca, 4-Plex ECL tahlilimiz, ECL ve RBA için karşılık gelen 4 tek tahlille karşılaştırıldığında, işçilik, maliyet ve serum hacminde% 70 oranında belirgin bir azalma olduğunu göstermiştir. Çoklanmış ECL testini kullanarak, belirli bir klinik konumun ihtiyaçlarına özgü farklı otoimmün hastalıkları test etmek için her bir kuyuyu farklı otoantikorları (10'a kadar) temsil eden farklı sayılarla özelleştirebiliriz.
Bu çalışmada, multipleks plakayı kullanan çoklanmış bir ECL testi için gözlemlenen bazı sınırlamalar vardır. Antijenle inkübe edilen serumun son seyreltilmesi, tek bir kuyuda birleştirilen her bir otoantikor testi için en uygun koşulları sağlayacak şekilde ayarlanamaz. T1D hastalarından alınan dokuz numunenin (9/1026), belirli otoantikorlar için yanlış negatif bir sonuca sahip olduğu gözlendi. Yanlış negatiflerin 7'si TPOA ve 2'si 7-Plex ECL testinde ThGA içindi, ancak hem tek ECL testinde hem de RBA'da yüksek pozitif sonuçlar sergilendi (Şekil 2 ve 3). 9 numunenin tümünün daha fazla seyreltilmesinden sonra, multipleks plakada pozitif hale geldiler. Bu sonuç, 'prozon' fenomeni olarak tanımladığımız şeyden kaynaklanır. Bu fenomen, numunenin yanlış bir negatif sonuç göstermesine neden olur, çünkü yüksek antikor titreleri antijen-antikor kafeslerinin oluşumunu etkiler. Multipleks bir test hazırlarken, kombine otoantikorların her biri için çok yüksek titrelere sahip numunelerin, antijen inkübasyonu için serumun isteğe bağlı seyreltilmesini tanımlamak için ön testlerin yapılması önerilir. Alternatif olarak, benzer optimize edilmiş koşullara sahip otoantikor testleri, her otoantikor için en iyi tahlil duyarlılığının ve özgüllüğünün elde edildiği kombine bir tahlil oluşturmak üzere seçilmelidir. Bu çalışmada, sağlıklı normal kontrollerden 7 örnek (7/1022), 7-Plex testinde çoklu otoantikorlar için yanlış pozitiflerle sonuçlandı, ancak tek bir ECL testi ve RBA (Şekil 2 ve 3) çalıştırıldıktan sonra bu otoantikorların her iki tahlilde de negatif olduğu bulundu. Bu küçük numune alt kümesi için multipleks plakada meydana gelen bu yanlış pozitif sonuçların arkasındaki nedenler şu anda bilinmemektedir. Multipleks ECL testinin mevcut uygulaması için, pozitifliği doğrulamak için tüm pozitif numuneler, bu yanlış pozitif hatayı multipleks ECL testinden kaldıran karşılık gelen tek ECL testi ile tekrarlanır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe DK32083, JDRF Hibeleri 2-SRA-2015-51-Q-R ve 2-SRA-2018-533-S-B tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 °C refrigerator | |||
| –80 °C and -20 °C freezers | |||
| 96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Acetic acid solution | Fisher | ||
| Aluminum foil | |||
| Antigen proteins | |||
| Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
| Human ThG full length protein | BioMart | ||
| Human TPO full length protein | BioMart | ||
| IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
| IFN-α protein | Abcam | ||
| Proinsulin protein | AmideBio | ||
| tTG protein | DiaRect | ||
| Biotin | Sigma | ||
| Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| Distilled deionized (DD) water | |||
| HCl | Fisher | ||
| Ice maker | |||
| Ice trays | |||
| MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
| Multi-channel pipette | |||
| NaOH | |||
| Paper tower | |||
| PBS | |||
| pH meter | |||
| Pipette-Aid | |||
| Pipettes/tips | |||
| Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| Uplex Development Kit | MSD | ||
| 96-well UPlex plate | MSD | ||
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Linker-Streptavidin | MSD | ||
| Read buffer | MSD | R92TC | |
| Stop Solution | MSD | ||
| Vortex mixer | |||
| ZeBa Column | Pierce | 89892 |
References
- Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
- Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
- Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
- Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).
- Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
- Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
- Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
- Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
- Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
- Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).
- Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
- Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
- Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
- Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
- Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
- Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
- Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).
