Detta protokoll beskriver en Aspergillus infektion modell i zebrafisk larver. Aspergillus sporer mikroin injiceras i hindbrain av larver, och kemisk behandling används för att inducera immunsuppression. Infektionsprogression övervakas via en daglig bildbehandlingsinställning för att övervaka svamptillväxt och immunsvar samt uppräkning av levande sporer genom koloniformningsenhetsplätering.
Invasiv aspergillos (IA) är en av de vanligaste svampinfektionerna bland immunkomprometterade individer. Trots tillgången på svampdödande läkemedel kan IA orsaka >50% dödlighet hos infekterade immunkomprometterade patienter. Det är viktigt att bestämma både värd- och patogenfaktorer som bidrar till infektionskänslighet och låg överlevnad hos infekterade patienter för att utveckla nya terapier. Medfödda immunsvar spelar en central roll i erkännande och clearance av Aspergillus sporer, även om lite är känt om de exakta cellulära och molekylära mekanismerna. Tillförlitliga modeller krävs för att undersöka detaljerade mekanistiska interaktioner mellan värden och patogenen. Zebrafisklarvernas optiska klarhet och genetiska dragbarhet gör dem till en spännande modell för att studera värdpatogena interaktioner av flera mänskliga bakterie- och svampinfektioner i en levande och intakt värd. Detta protokoll beskriver en larv zebrafish Aspergillus infektion modell. Först isoleras Aspergillus sporer och injiceras i zebrafisken bakbrain ventrikel via mikroinjektion. Sedan tillsätts kemiska hämmare som immunsuppressiva läkemedel direkt till larvvattnet. Två metoder för att övervaka infektionen injicerade larver beskrivs, inklusive 1) homogenisering av larver för koloniformningsenhet (CFU) uppräkning och 2) en upprepad, daglig live imaging setup. Sammantaget kan dessa tekniker användas för att mekanistiskt analysera utvecklingen av Aspergillus infektion in vivo och kan tillämpas på olika värd bakgrunder och Aspergillus stammar för att förhöra värd-patogen interaktioner.
Aspergillus fumigatus är en allestädes närvarande saprofytisk svamp, och dess luftburna sporer finns både inomhus och utomhus1. Dessa sporer inandas av alla men blir effektivt rensade från lungorna hos immunkompetenta individer1,2. Personer med förändrade lungsjukdomar som cystisk fibros kan dock utveckla bronkopulmonell aspergillos på grund av svampspiration i lungorna3. Den allvarligaste formen av denna infektion, invasiv aspergillos (IA), påverkar immunkomprometterade individer och innebär tillväxt av svampen till andra organ2,3. IA leder > 50% död av smittade patienter trots tillgången på svampdödande behandlingar4. Hos immunkompetenta individer spelar medfödda immunsvar en viktig roll för att rensa de inhalerade sporerna1. De specifika mekanismer som bidrar till detta medfödda immuntillstånd är dock inte väl förstådda. Det är viktigt att förstå de cellulära och molekylära mekanismerna hos stora medfödda immunceller (dvs. makrofager och neutrofiler) i clearance av Aspergillus för att hitta nya terapeutiska strategier för IA.
Medan däggdjursmodeller har varit avgörande för att identifiera svampvirulensfaktorer och vara värd förimmunsvar 5,6, är visuell tillgänglighet begränsad för värdpatogeninteraktioner på cellnivå. Vävnadskulturexperiment kan inte helt rekapitulera den komplexa multicellulära miljön och interaktioner som finns hos hela djur7. Därför har zebrafisk blivit populär som en alternativ modellorganism för att fylla detta gap och underlätta studien av värdpatogeninteraktioner i en levande, intakt värd över en flerdagarsinfektion8,9. Zebrafiskens medfödda immunsystem utvecklas så tidigt som 24 timmar efter befruktning (hpf)10, och det adaptiva systemet tar 4-6 veckor att utveckla11, vilket ger ett tidsfönster där medfödda immunsvar kan bedömas isolerat. Medfödda immunsvar är väl bevarade mellan människor och zebrafisk11. Zebrafisk har många egenskaper som underlättar undersökningen av dessa svar, inklusive optisk klarhet (vilket möjliggör högupplöst levande avbildning av intakta värdar) och genetisk dragbarhet (vilket underlättar molekylära mekanistiska studier).
Larv zebrafish Aspergillus infektion modell beskrivs här utvecklades ursprungligen av Knox et al.12. Det har nyligen utökats av vår grupp och andra för att undersöka värdimmunmekanismer 12,13,värdpatogena interaktioner13,14,15, mekanismer för immunsuppression13,16,17,svamp virulens18, och anti-svamp läkemedel effekt19,20. Denna modell rekapitulerar flera aspekter av mänskliga aspergillos. Medan immunkompetenta larver är resistenta, kan immunkomprometterade larver duka underför infektion 12,13,16,17.
I denna modell etableras en lokaliserad infektion genom att injicera sporer i hindbrain ventrikeln i larva, ett område mindre befolkat med fagocyter, och fagocyt rekrytering och beteende kan utvärderas12,13. Man tror att makrofager fungerar som den första försvarslinjen mot Aspergillus sporer hos människor1 och däggdjursmodeller6,21. På samma sätt rekryteras makrofager i zebrafiskmodellen till de injicerade Aspergillus-sporerna, medan neutrofiler rekryteras i andra hand som svar på hyphaltillväxt12,13,22. Från denna modell har man också lärt sig att Aspergillus kan kvarstå i vildtyp immunocompetent larver efter mer än 7 dagars infektion. Dessutom kan hela infektionsföringen följas i samma levande djur genom daglig konfokal avbildning.
Detta protokoll beskriver tekniken för microinjection att injicera sporer i hindbrain ventrikel av 2 dagar efter befruktning (2 dpf) larver. Infektionen övervakas sedan i upp till 7 dagar, eftersom zebrafisklarver kan leva upp till 10 dpf utan utfodring. Immunsuppression kan induceras genom läkemedelsbehandling, och applicering av läkemedel på larverna beskrivs också. Slutligen beskrivs två metoder för att följa infektionsprogression, inklusive kvantifiering av CFUs från enskilda larver och en daglig live imaging setup.
Infektionsmodellen som beskrivs här är fördelaktig för att analysera värdens immunsvar, värdpatogeninteraktioner och svamppatogenes12,13,14,15. Denna information kan härledas från högupplösta avbildningar av fluorescerande märkta patogener och värdceller13,larv överlevnad och CFU persistens över tiden.
Mikroinjektionstekniken är avgörande för protokollets framgång och kan behöva justeras vid användning av olika mikroinjektionsutrustning och inställningar. I synnerhet är trycket och injektionstiden två huvudvariabler och kan justeras för att säkerställa att volymen som matas ut av nålen är ~ 3 nL. Nålens storlek som bestäms genom att klippa den med tång reglerar också antalet sporer som injiceras; även om en större öppning kan orsaka vävnadsskador på larven. Å andra sidan kommer för liten öppning inte att tillåta de relativt stora sporerna (>2 μm) ut och kan leda till nålpropp. Om detta inträffar kan nålen relipped för att ha en något större öppning.
Andra protokoll för mikroinjektion av bakterier använder PVP-40 för att upprätthålla en homogen injektionsblandning, men vi har inte funnit någon fördel med att använda denna bärare med Aspergillus sporer. Igensättning av nålen kan mildras genom att vifta med svampberedningen noggrant för att bryta eventuella klumpar innan nålen laddas. Ibland kan en täppa i nålen också lossnas genom att tillfälligt öka trycket eller injektionstiden och utlösa mikroinjektorn medan nålen är i vätskan som omger larverna. Tryck- och injektionstiden bör sedan minskas igen till tidigare nivåer. I andra fall kan en täppa inte tas bort, och en ny nål måste laddas och omkalibreras.
Detta protokoll är utformat för att injicera ~ 30-70 sporer per larva. Det är känt att baserat på koncentrationen av sporberedningen och volymen injicerad är detta antal ganska lågt. Det har dock empiriskt visat sig att detta är antalet sporer som injiceras under dessa förhållanden. Varför denna skillnad uppstår är okänd, men det kan bero på sporklumpning i nålen. Våra egna försök att injicera ett större antal sporer har till stor del misslyckats.
För att säkerställa att cirka 30-70 sporer injiceras och bibehålla konsistensen av injektionerna i alla larver, kontrollera antalet sporer genom att injicera på E3 som omger larverna. Upprepa detta var femte till sjätte larver under alla injektioner. Om sporräkningen verkar förändras kan trycket och/ eller injektionstiden justeras för att injicera ett konsekvent antal sporer över flera larver. Man bör dock vara försiktig så att injektionsdosen i första hand förblir i bakhjärnan och inte fyller midbrain och förhjärna.
För att säkerställa en lokaliserad infektion bör sporupphängningen hållas i bakbrain ventrikeln. Detta kan visualiseras av fenolröd färgning strax efter injektionen, även om den röda färgen doftar med tiden. För injektioner används regionen runt otic vesicle för att genomborra genom och nå ventrikeln i en 45°-65° vinkel. Detta område har inga huvudsakliga blodkärl, orsakar mindre vävnadsskador och läker omedelbart. Om huden över ventrikeln genomborras kan sporupphängningen läcka ut, eftersom nålen som måste användas för Aspergillus sporinjektioner är större än den som används för bakteriella suspensioner. Utan framgång injiceras eller oavsiktligt skadade larver kan markeras genom att injicera i äggulan ett par gånger för att skapa ett rött märke eller genom att dra larven ut ur raden med nålen. När en uppsättning injektioner är klar bör dessa larver avlägsnas och kasseras innan resten tvättas bort från plattan. E3 utan metylenblått används för att bedöva larver före injektion och även hålla larven efter injektionerna, eftersom metylenblått är antisvamp.
Vid injektions tidpunkten för injektionen representerar CFU-räkningar antalet livskraftiga sporer i den infekterade värden. Men om sporerna gror till hyphae, kan dessa delas upp i separata livskraftiga “svampenheter” under homogenisering och kan ge upphov till flera kolonier. Eller, en obruten multicellulär hypha kan ge upphov till en enda koloni, vilket resulterar i en genomsnittlig, men oprecis, representation av svampbördan. Detta kan mildras genom att kombinera CFU-räkningarna med längsgående mikroskopi av enskilda larver, vilket ger visuella data om ödet för injicerade sporer.
Jämfört med däggdjurssystemet är zebrafisk larva infektionsmodellen särskilt signifikant på grund av dess optiska tillgänglighet. Rekrytering och svar av medfödda immunceller kan visualiseras inom en levande intakt värd. Detta kan införlivas med genetisk eller kemisk hämning av molekylära mål för att analysera hur varje mål påverkar makrofag- eller neutrofilreaktionen mot Aspergillus sporer hos ett levande djur.
Medan zebrafisk larva Aspergillus infektion modell fortsätter att vara avgörande för att beskriva olika aspekter av IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, det finns andra expansionsområden. Från värdsidan används det för att beskriva immunsvar på cellnivå, men detta kan utökas för att analysera immunmekanismer på molekylär nivå genom att kombinera det med riktad morpholino, CRISPR, stabila mutantlinjer eller kemisk exponering. En varning är att homologer för alla kända däggdjur medfödda immunväg komponenter inte har identifierats i zebrafisk.
Från patogensidan har virulens av olika arter och stammar beskrivits. En lovande väg för framtida forskning är användningen av mutanta Aspergillus-stammar för att testa hur specifika gener eller proteiner bidrar som virulensfaktorer. Därmed kan nya svampläkemedel utvecklas för att rikta in sig på dessa proteiner. Nuvarande svampläkemedel har låg effekt hos mänskliga patienter och det finns växande resistens mot dessa läkemedel isvampar 28. Denna in vivo-modell kan användas för att undersöka varför dessa läkemedel misslyckas och som en mellanmodell för att testa effekten av nya svampläkemedel. Sammantaget kan de fynd som upptäcks med hjälp av denna modell underlätta framtida utveckling av effektiva behandlingar för Aspergillus-infekteradepatienter.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institute of Allergy And Infectious Diseases vid National Institutes of Health under Award Number K22AI134677. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |