Summary
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫における アスペルギルス 感染モデルについて説明する。 アスペルギルス 胞子は幼虫の後脳に微量に注入され、免疫抑制を誘導するために化学的処理が使用されます。感染進行は、毎日のイメージング設定を介して、真菌の成長および免疫応答、ならびにコロニー形成単位めっきによる生きた胞子の列挙を監視する。
Abstract
侵襲性アスペルギルス症(IA)は、免疫不全の個人の間で最も一般的な真菌感染症の1つです。抗真菌薬が利用できるにもかかわらず、IAは感染した免疫不全患者において>50%の死亡率を引き起こす可能性がある。新しい治療法を開発するためには、感染感受性と感染患者の低生存率に寄与する宿主および病原体因子の両方を決定することが重要です。生来の免疫応答は 、アスペルギルス 胞子の認識とクリアランスにおいて極めて重要な役割を果たしますが、正確な細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていません。信頼できるモデルは宿主と病原体の間の詳細な機械相互作用を調査するために必要である。ゼブラフィッシュの幼虫の光学的明瞭さと遺伝的な難解さは、生きている無傷の宿主における複数のヒト細菌および真菌感染症の宿主病原体相互作用を研究する興味深いモデルとなる。このプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュ アスペルギルス 感染モデルを記述する。まず、 アスペルギルス 胞子を単離し、マイクロインジェクションを介してゼブラフィッシュ後脳心室に注入する。次いで、免疫抑制薬などの化学阻害剤を幼虫水に直接添加する。注射された幼虫における感染を監視する2つの方法が記載されており、コロニー形成ユニット(CFU)列挙体および2)繰り返し、毎日のライブイメージングセットアップのための幼虫の均質化を含む。全体的に、これらの技術は、生体内で のアスペルギルス 感染の進行を機械論的に分析するために使用することができ、宿主と病原体の相互作用を尋問するために異なる宿主の背景および アスペルギルス 株に適用することができる。
Introduction
アスペルギルス・フミガトゥスは、ユビキタスな窒息菌であり、その空中胞子は屋内と屋外の両方で見つけることができます1.これらの胞子は、すべての人によって吸入されるが、免疫能力の個人1、2の肺から効果的にクリアされる。しかし、嚢胞性線維症などの肺の状態が変化した人は、肺の真菌発芽のために気管支肺アスペルギルス症を発症する可能性がある3。この感染の最も重篤な形態は、侵襲性アスペルギルス症(IA)、免疫不全の個体に影響を及ぼし、真菌を他の器官2,3に増殖することを伴う。IAは、抗真菌療法の利用可能性にもかかわらず、感染した患者の>50%の死亡につながる4.免疫能力のある個人では、自然免疫応答は吸入胞子1をクリアする上で大きな役割を果たす。しかし、この自然免疫クリアランスに寄与する特定のメカニズムは十分に理解されていない。IAの新しい治療法を見つけるためには、アスペルギルスのクリアランスにおける主要な自然免疫細胞(マクロファージおよび好中球)の細胞および分子メカニズムを理解することが重要です。
哺乳類モデルは真菌性毒性因子および宿主免疫応答の同定に役立っていますが、細胞レベルでの宿主と病原体の相互作用には視覚アクセシビリティが制限されています。組織培養実験では、動物全体に存在する複雑な多細胞環境と相互作用を完全に再現することはできません。したがって、ゼブラフィッシュは、このギャップを埋め、複数日感染8、9を越えて生きている無傷の宿主における宿主間相互作用の研究を容易にする代替モデル生物として人気を集めている。ゼブラフィッシュの自然免疫系は早くも24時間の受精後(hpf)10で発達し、適応体系は11を発症するのに4〜6週間かかり、自然免疫応答を単独で評価できる時間枠を提供する。自然免疫応答は、ヒトとゼブラフィッシュ11の間で十分に保存されている。ゼブラフィッシュは、光学的明瞭さ(無傷の宿主の高解像度のライブイメージングを可能にする)や遺伝的な難易度(分子機械学的研究を容易にする)など、これらの応答の調査を促進する多くの資質を有する。
ここで説明した幼虫ゼブラフィッシュアスペルギルス感染モデルは、もともとKnoxららによって開発されました。最近、我々のグループおよび他の人々によって、宿主免疫機構12、13、宿主病原体相互作用、免疫抑制13、16、17、真菌性毒性18、および抗真菌薬有効性19、20のメカニズムを調査するために拡大されている。このモデルは、ヒトアスペルギルス症の複数の側面を再現します。免疫担当の幼虫は耐性であるが、免疫不全の幼虫は感染に屈することができる12,13,16,17.
このモデルでは、幼虫の後脳心室に胞子を注入することにより局所感染が確立され、食細胞が少ない領域、および食細胞の採用と行動を評価することができる12、13。マクロファージは、ヒト1および哺乳類モデル6,21におけるアスペルギルス胞子に対する第一線の防御線として作用すると考えられている。同様に、ゼブラフィッシュモデルでは、マクロファージは、注入されたアスペルギルス胞子にリクルートされ、一方で好中球は、催眠成長12、13、22に応答して二次的に募集される。このモデルから、アスペルギルスは、感染の7日以上後に野生型免疫能力幼虫に持続できることも知られた。さらに、感染の全経過は、毎日の共焦点イメージングによって同じ生きた動物に続くことができる。
このプロトコルは、受精後2日間の後脳心室に胞子を注入する微小注入の技術を記述する(2dpf)幼虫。ゼブラフィッシュの幼虫は餌を与えずに最大10dpfまで生きることができるので、感染は最大7日間監視されます。免疫抑制は薬物治療によって誘発され得るが、幼虫への薬物の適用も記載されている。最後に、個々の幼虫からのCFUsの定量化および毎日のライブイメージング設定を含む、感染進行に従う2つの方法が記載される。
Protocol
研究者は、適切な動物のケアと使用委員会からすべての動物実験の承認を得る必要があります。この記事に示す代表的なデータは、クレムソン大学の制度的動物の世話と使用委員会(AUP2018-070、AUP2019-012)によって承認されたプロトコルの下で行われた実験からのものです。
1. インジェクション用 アスペルギルス 胞子の調製
- アスペルギルス胞子懸濁液から、1 x 106の胞子を得るために必要な体積を計算する。ボリュームは20~100μLにする必要があります。ない場合は、0.01%(v /v)滅菌Tween-20(トゥイーン水)で10倍希釈を生成します。資料一覧。たとえば、計算された体積が5μLの場合、10倍の希釈液を生成し、希釈溶液の50μLを使用します。
注:2つのプレート/歪みは、より多くの胞子を収集したり、汚染の場合にはスペアとして準備することができます。 - 1 x 106アスペルギルス 胞子を1つのグルコース最小培地(GMM)プレート(材料表)に、生物安全キャビネットに無菌の使い捨てL字型スプレッダーを広げます。プレートの余白まで広がらないようにしてください。37°Cで3~4日間インキュベートし、プレートを逆さまにします。
- コレクションの日には、滅菌ミラクロスと50 mL円錐形チューブ(1株あたり2本)、無菌Tween水の新鮮なボトル(1株あたり1つ)、無菌使い捨て可能なL字型スプレッダーをバイオセーフティキャビネットに持参してください。
注:ミラクロスは、ホイルで包み、滅菌するためにオートクレーブで、6個で〜8にカットすることができます。 - 50 mL円錐形チューブにミラクロスを1個ずつ入れ、キャップを再キャップします。残りのミラクロスパケットをフードから取り出します。
- バイオセーフティキャビネットにプレートを持ち込みます。1つのプレートを開き、上にトゥイーン水を注ぎ、プレートの約4分の3を覆います。
- 使い捨てのL字型スプレッダーを使用して、カ真菌培養物の表面を前後の動きでそっと削り取り、もう一方の手を使ってプレートを回転させます。ほとんどすべての胞子がトゥイーン水に均質化されるまで擦り傷をする。
注:疎水性が高いため、スポールはトゥイーン水を加えたり、スクレイピング中に「パフ」を作り出すことができます。近くのチューブやプレートの汚染を避けるために細心の注意を払う必要があります。手袋を交換し、異なる株の抽出の間に70%エタノールで表面を拭き取ることをお勧めします。 - 50 mL円錐形チューブを1つ取り、ミラクロスの破片を取り除きます。半分に折り、50 mL円錐形の管の上部に挿入されたフィルターにそれを作る。
- プレートからミラクロスの上に真菌ホモゲネートをチューブに注ぎます。
注:1つの歪みの2つのプレートが準備されている場合は、両方のプレートを削り、同じ円錐形のチューブに注ぎます。 - ツイーン水を注ぎ、円錐管の総体積を50mLにします。
- 900 x g で 10 分間スピンします。遠心分離機にはエアロゾル化防止キャップを使用してください。
- 上清を約10%漂白液に注ぎ、除染します。50 mLの滅菌1x PBSを円錐管に注ぎ、次に渦または振ってペレットを再懸濁させる。
- 900 x g で再び 10 分間スピンします。上清を注ぎ、滅菌1x PBSの5mLでペレットを再懸濁します。新鮮な50 mL円錐形のチューブにミラクロスの新鮮な部分を通してフィルター。
- 1.7 mL遠心分離管で真菌ホモゲネートの10倍の連続希釈液(10x、1000x)を作ります(例えば、10x溶液の場合は、真菌ホモゲネートの100 μLをTween-waterの900 μLと混合します)。
- 胞子がトゥイーン水に排出されるときに見えない最初の希釈液を選択し、この希釈を使用して、ヘモサイトメーターを使用して胞子の数を数えます。
- 次の式を使用して、調製された真菌ホモジネート(水懸濁液)中の胞毛濃度を計算します。
濃度(胞子/mL)=中25箱x希釈係数x104中の胞子の数 - 1.7 mLマイクロ遠心チューブで滅菌1x PBSで1.5 x 108 胞子/mLの1 mLストックを準備します。この胞毛製剤は、4°Cで~4週間保存することができます。
- 注射に使用する前に、胞子調製物の20 μLを1.7 mL遠心分離チューブに1%無菌フェノールレッドの10 μLと混合し、1 x 108 の胞子/mLの最終的な胞子濃度を達成します。注入の前に徹底的に渦。
注:1%フェノール赤溶液は、フィルター滅菌され、アリコートに保存する必要があります。 - 模擬注射の場合は、1x PBSの20 μLを1%無菌フェノールレッドの10 μLと混合します。
2. インジェクション用寒天プレートの準備
- E3培地で2%アガロースを調製し、電子レンジで溶かします。
- 100 mm x 15 mm のペトリ皿(プレートあたり 25 mL)に注ぎ、皿を均等に覆い、冷まします。
- パラフィンフィルムでプレートを包み、4°Cで逆に保管します。
- 射出前に、プレートを室温(RT)にしてください。
- プレートに滅菌された2%のウシ血清アルブミン(BSA)のフィルター1mLを注ぎ、プレートを傾けて底全体を広げて覆い、E3ですすぎます。
注:2%BSA溶液は、フィルター滅菌し、-20°Cで1 mLアリコートとして保存することができます 2% BSA前処理は、幼虫がアガロースの表面に付着するのを防ぎます。 - バッファーに入れたトリケーヌを入れたE3をプレートに注ぎ、注射まで座らせます。
3. ゼブラフィッシュ幼虫後脳心室マイクロインジェクション
- 手動でペトリ皿の2 dpfで鉗子で幼虫をデコールする。
注意:デコールリオネーションは、1.5 dpfから注射の時間までいつでも行うことができます。 - ペトリ皿からできるだけ多くのE3を取り出し、E3に300μg/mLトリカインを詰め込んで幼虫を麻酔します。
注:E3でバッファされた4 mg/mLトリカインのストック溶液を調製し、4°Cで保存することができます。この作業ソリューションは、E3で最大50 mLのストック溶液の4 mLを希釈することによって行うことができます。 - 圧力インジェクタ、背圧ユニット、フットスイッチ、マイクロピペットホルダー、マイクロマニピュレータ、磁気スタンドとプレートに付属するマイクロインジェクションセットアップを使用して、すべて圧縮空気の供給源に接続されている(材料表)。
- 圧縮空気バルブを開き、マイクロインジェクタをオンにします。圧力を~25 PSI、パルス持続時間を60 ms、バックプレッシャユニットを1 PSIに設定します。
- マイクロローダーピペットチップ(材料表)を使用してマイクロインジェクションニードルをロードし、約3〜5μLの準備済みPBSまたは胞胞ストールをフェノールレッドで使用します。マイクロマニピュレーターに針を取り付けます。
注:マイクロインジェクション針は、前述の23のように調製することができます。マイクロインジェクションに使用されるステレオ顕微鏡は、マイクロインジェクション針を校正するための眼球レチクルを持っている必要があります。レチクルは、段階マイクロメーターで校正する必要があり、レチクルスケール(μm)の長さを決定する必要があります。針から排出される胞胞の懸濁液の直径は、ドロップと重なる(レチクルの)ハッシュの数に応じて測定されます。 - マイクロマニピュレーターを、ステレオ顕微鏡の下で最も低い倍率で針の端が見ることができるように配置します。4倍の倍率にズームし、針を視界に入れ続けます。
- 鋭い鉗子を使用して、針の端をクリップします。インジェクションペダルを押すと、出てくる液滴のサイズを視覚化できます。胞毛懸濁液の〜3 nLが注入されるまでクリッピングバックを続けます(ここでは、これは5つのハッシュです)。
- 幼虫が注射プレートに配置されている間に誤って針を打つことを避けるために、マイクロマニピュレーターと針を邪魔しないように移動します。
- 注入プレートからE3-Tricaineを注ぎ、次に、トランスファーピペットを使用して可能な限り少ないE3で〜24の麻酔幼虫を注入プレートに移します。
- ゼブラフィッシュの幼虫(すなわち、毛輪ツールまたはまつげツール)を操作するための小さなツールを使用して、彼らが直面している方向に従って幼虫を配置します。具体的には、すべての面を右に 1 行に配置し、左に向けて下の行に配置します。
注:この配置は、幼虫が場を外れるので、プレート上にあまりにも多くの液体がある場合は困難です。しかし、幼虫が乾燥したり麻酔が消耗したりする可能性がありますので、注射に時間がかかる場合は、あまりにも少ない液体も問題になります。したがって、マイクロインジェクションプロセス全体を通してプレート上の液体の量に注意が払われるべきです。 - 顕微鏡ズームを最低倍率に調整します。マイクロマニピュレーターを戻し、針が幼虫に近づくように、視野の中央に〜30°~60°の角度になるように配置します。
- 最高の倍率にズームインし、さらに針の位置を調整するために微調整ノブを使用しています。幼虫の横にあるプレートの液体に胞子懸濁液を注入して、~30~70個の胞子が針から出ているか確認します。必要に応じて、射出設定の時間と圧力を調整します。
注:この検査は、針から出てくる胞子の数が時間の経過とともに増加または減少する可能性があるため、5〜6匹の幼虫ごとに繰り返す必要があります。 - 幼虫が針に向いている列から始めて、針が最初の幼虫の近くに置かるようにプレートを動かします。
- マイクロマニピュレーターで針を移動し、耳小胞の周りの組織を通して針を挿入して後脳心室に突き刺す。必要に応じてもう一方の手でプレートを動かして、針の角度で幼虫の正しい向きを得ます。
- 針の端点が後脳心室の中央にあることを視覚的に確認し、足のペダルを押して胞子を注入し、針を穏やかに引き込みます。
注:フェノールの赤色染料は、主に後脳心室内に留まる必要があります。少量は中脳に入るかもしれませんが、前脳や脳の外に到達すべきではありません。もしそうであれば、注入される容積は大きすぎて、圧力と時間はそれに応じて減らされるべきか、新しい針を較正すべきである。 - プレートを下に移動し、その列のすべての幼虫を注入します。その後、プレートを回し、他の列にすべての幼虫を注入します。
注:正常に注射または誤って損傷した幼虫は、1)黄身に数回注入して赤いマークを作成するか、2)幼虫を針で列から引きずり出すことでマークすることができます。 - 針をもう一度上下に動かします。顕微鏡の下倍率にズームアウトします。フェノール赤色染料は、各幼虫の後脳にまだ見えるはずです。
- まず、ヘアループツールとピペットを引き離して、注射に失敗した幼虫を処分します。残りの幼虫を新しいペトリ皿に移し、新鮮な滅菌E3とトランスファーピペットでプレートを洗い流します。
- 必要に応じて、必要に応じて最終実験サンプル数を繰り返します。
- 幼虫をE3で少なくとも2倍すすいで、麻酔からの回復を確実にする。
- それ以上の治療を行わずに生存を定量化するには、移管ピペットを使用して、幼虫をE3の96ウェルプレート(1ウェル当たり1回の幼虫)に移す。
4. 注入され、実行可能な胞状の数の確立
- 注射直後に、移管ピペットを使用して、注入された幼虫の約8匹を無作為に選び、1.7 mL遠心管(1本の幼虫/チューブ)に移す。
- トリケーヌで、または4°Cで0.5〜2.0時間の幼虫を安楽死させる。
- 1 mg/mL アンピシリン 1 mL と 0.5 mg/mL カナマイシン抗生物質溶液を無菌 1x PBS で調製します。残った溶液は4°Cで保存し、後で使用することができます。
注:100mg/mLおよびカナマイシン50mg/mLのアンピシリンのストック溶液は、事前に作られ、フィルター滅菌され、-20°Cのアリコートに保存することができます。 1x PBSでこれらを100倍希釈して、働く溶液を得る。 - ピペットを使用して、遠心分離管からできるだけ多くの液体を取り出し、幼虫を後ろに残し、抗生物質で1x PBSの90 μLを加えます。
注:抗生物質は、 アスペルギルス コロニーのカウントを妨げる可能性のあるGMMプレートの細菌増殖を防ぐために使用されます。 - 1,800振動/分(30Hz)で組織ライザー中の幼虫を6分間均質化します。30 sの場合は17,000 x g でスピンダウンします。
- ラベルGMMプレート(均質化幼虫あたり1プレート)。ブンゼンバーナーを使用して滅菌環境を作り出し、均質化された懸濁液を1本のチューブからGMMプレートの中央にピペットし、次に使い捨てのL字型スプレッダーを使用して広げる。ホモジネートをリムに広げるのは避けてください。
- プレートを37°Cで2~3日間逆さまにインキュベートし、形成されたコロニー数(CFU)を数えます。
- 感染期間中に生きている胞子の数を測定するには、注射後1〜7日(dpi)で96ウェルプレートから幼虫を摘み取り、遠心管に移します。ステップ 4.1 ~ 4.5 で説明されているように、幼虫を安楽死させ、GMM プレートに広げます。
5. 注射された幼虫の薬物治療
- セクション4の後、残りの注射された幼虫を2つの3.5mm皿(薬物治療用とコントロール用)に分割します。1つの状態で約24の感染した幼虫を使用してください。
注:3.5mmの皿は水の2%の無脂肪の乾燥したミルクと処理し、すすいで、空気乾燥し、RTで事前に貯えることができる。乳を塗ると、幼虫がプラスチックに付着するのを防ぎます。 - 必要な最終濃度に従って円錐管にメチレンブルーなしでE3に所望の薬物溶液と車両を調製し、その後よく混合します。例えば、デキサメタゾンにさらされた幼虫の生存を監視するには、デキサメタゾンに24の幼虫(複製)を用い、DMSOなどの車両制御に24を使用する。必要な濃度で5mLの薬剤溶液を調製する。ここでは、5 mLのDMSOと10 μMデキサメタゾンを使用し、24の幼虫/状態を車両/薬物溶液/幼虫の〜200 μLに移しました。
- 転送ピペットで1皿からできるだけ多くの液体を取り出し、車両制御を含むプレミックスE3を追加します。他の皿に関心のある処理を含むプレミックスE3で繰り返します。
- ピペットを使用して、幼虫を96のウェルプレート(井戸あたり1つの幼虫)に移します。注射された幼虫の生存を7日間監視または薬物に曝露。
注:薬物は感染日にのみ適用され、実験全体のために幼虫に保管するか、毎日リフレッシュすることができます。
6. 成長およびイメージング用のゼブラフィッシュの創傷および捕捉装置を用いた感染した幼虫の毎日の画像化(zWEDGI)
- 幼虫は、色素沈着を防ぐために24 hpfで100μM N-フェニルチオウラ(PTU)で治療され、PTUが実験全体のために幼虫に保たれていることを確認してください。
注:75-100 μMのPTUは、大きな発達上の欠陥がない幼虫の色素沈着を防ぎます。しかし、PTUは、いくつかの生物学的プロセス25を妨害することができ、研究者は、薬物が調査中のプロセスに影響を与える可能性があるかどうかを事前に判断する必要があります。 - トランスジェニック幼虫に2dpfで目的の標識された細胞集団を感染させる、 ア スペルギルス 胞子は、第3項に記載されているように、蛍光タンパク質を発現するように設計された胞子を用いられます。その後、感染した幼虫をメチレンブルーなしでE3の約500 μL/wellの48ウェルプレートのウェルに移します。
注:48ウェルプレートは、毎日のイメージングを繰り返す間に幼虫を出入りさせる方が簡単であるため、ここで使用されています。 - イメージングの日には、100 μM PTU と E3 トリケーヌの 2 つの 3.5 mm ペトリ皿を準備します。
- ZWEDGIデバイス26、27のチャンバーにE3-トリカインを追加します。ステレオ顕微鏡の下で、P100マイクロピペットを使用してチャンバーと拘束チャネルから気泡を取り除きます。余分なE3-トリケーヌをすべて取り除き、チャンバー内でのみ行います。
- 移管ピペットを使用してプレートから1つの幼虫をピペットアップ。液体を多く使用して取り除いた場合は、E3-PTUを含む3.5mm皿にピペットを入れます。次いで、ピペットを再び上げ、できるだけ少ない液体を使用し、E3-トリケーヌに移す。
- 麻酔のために〜30sを待ってから、創傷および封じ込め装置(例えば、zWEDGI)のローディングチャンバーに移す。
- 立体顕微鏡の下で、幼虫を配置します。P100マイクロピペットを使用して、創傷室からE3-tricaineを除去し、ローディングチャンバーに放出して幼虫の尾部を制限チャネルに移動します。幼虫が横、後ろ、または後方側に配置されていることを確認し、後脳を逆向きの対物レンズで画像化できるようにします。
- 共焦点顕微鏡による画像幼虫。
- イメージング後、P100ピペットを使用して、E3-トリケーヌを創傷室に放出し、幼虫を拘束チャネルからローディングチャンバーに押し込みます。
- トランスファーピペットを使用して、幼虫をピックアップし、E3-トリケーヌでペトリ皿に戻します。できるだけ少ない液体を使用して、E3-PTUでペトリ皿に転送します。PTUですすいで、48ウェルプレートに戻します。
Representative Results
アスペルギルス胞子をゼブラフィッシュ幼虫の後脳に微小注射した後、感染結果は生存、CFUs、ライブイメージングを含む複数のアッセイを続けることができます。生存アッセイでは、1~7dpiで生き残った感染した幼虫の数を監視した。野生型の幼虫を治療せずに放置すると、死はほとんど見られず、幼虫の約80~100%が実験全体を生き延びていた(図1)。幼虫が免疫抑制された場合、例えばコルチコステロイド薬デキサメタゾン(10μM)への曝露により、有意に減少した生存率が観察された(図1)。
CfUsをA.フミガトゥス胞子に感染した野生型幼虫からの7日間の実験を通して定量化した場合、胞子の持続性が観察され、時間の経過とともにクリアランスが遅かった(図2A)。1、2、3、5、および7 dpiで生存する胞子の数を、0 dpiで注入された胞子の数に正規化して、反復間の持続性とクリアランスを比較した(図2B)。
白血球中の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック魚株は、蛍光タンパク質発現 アスペルギルス 胞子と共に、白血球の形成および行動、ならびに真菌発芽および発育13の両方を可視化するために使用することができる。マクロファージに標識を付けた場合(例えば、Tg(mpeg1:H2B-GFP))、幼虫の50%程度のマクロファージクラスタリングが一般的に観察され、2~3dpiから始まる(図3A)。好中球(Tg(lyz:BFP))の採用は、典型的には遅延し、主に真菌発芽が起こった後に起こる(図3A)。幼虫の大部分の実験全体に対して真菌の負担が持続する一方で(図3A)、クリアランスが観察された(図3B)。一部の幼虫では、後に感染で後に後に、マクロファージで真菌の播種のために真菌の負担が観察された。
オティックベシクル周辺は、この普及が見つかる可能性のある場所の1つです(図3C)。これらの観測は、実験全体の過程で複数の個々の幼虫で定量化された(図4)。典型的には、発芽は5dpiによって幼虫の60%〜60%で見られた(図4A)。食細胞クラスター領域、マクロファージの採用、および好中球の採用は、時間の経過と共に変化し、幼虫全体で変化し、実験を通じていくつかの傾向があり、時間の経過とともに解決します(図4B,C,D)。
図1:感染した幼虫の代表的な生存率分析アスペルギルス感染幼虫は、車両制御(DMSO)またはデキサメタゾン(Dex)にさらされ、生存を監視した。データは、3 つのプールされたレプリケートを表します。平均注入CFUs:DMSO = 30、Dex = 29(p値およびハザード比は、Cox比例ハザード回帰分析、****p<0.0001)によって計算された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:代表的なCFUは、注射直後(0dpi)および感染経過時(2、3、5、および7 dpi)の感染幼虫から数える。感染した幼虫8匹を均質化し、各時点でCFUを数え、複製するためにメッキした。(A) 1 つのレプリケートからのデータの例。各点は1つの幼虫を表し、棒は各時間ポイントの平均を表す。(B) CFU カウントは、レプリケートごとに 0 dpi の CFU カウントに正規化され、3 つのレプリケートがプールされました。分散分析を用いて実験条件間でデータを比較し、推定限界平均と標準誤差の観点から要約した。Asterix は、0 dpi の CFU と比較して統計的有意性を表します (*p < 0.05、**p < 0.01、****p < 0.0001)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:感染実験からの代表的な画像。蛍光マクロファージを有するPTU処理幼虫(mpeg1:H2B-GFP)および好中球(lyz:BFP)をRFP発現 A.フミガトゥスを注射した。共焦点顕微鏡上で2、3、および5dpiで、生きた、感染した幼虫を繰り返し画像化した。最大強度 Z 投影イメージが表示されます。幼虫の模式図は、各パネルのイメージングの位置を示しています。全てのスケールバーは100μmを表し、25μmのスケールバーを除き(A)画像は2、3、5 dpiで撮影された単一の幼虫から、典型的な感染進行を表します。インセットは3日目と5日目に真菌発芽を示す。(B) 感染をクリアできる幼虫のサブセットの代表的な画像であり、真菌の負担が低く、5 dpiではあまり炎症を起こさない。(C) 後の時点で感染が後脳から広がる幼虫のサブセットの代表的な画像。この画像では、真菌、マクロファージ、好中球は、オチクジクのベシクルの周りと下に見つけることができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:画像化実験の代表的な定量化。図3の実験セットアップからの画像を、真菌発芽および白血球の採用について分析した。(A)幼虫は、毎日発芽胞子の存在のために採点され、発芽を伴う幼虫の割合を計算した。(B,C,D)個々の幼虫は異なる色の線として表されます。食細胞クラスターの出現および大きさ(B)、マクロファージ募集(C)、および好中球募集(D)は、各幼虫に対する5日間の実験の過程で続いた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここで説明する感染モデルは、宿主の免疫応答、宿主病原体相互作用、および真菌病原体12、13、14、15を分析するために有益である。この情報は、蛍光標識病原体および宿主細胞13の高解像画像化、幼虫生存、およびCFU持続性を経て得ることができる。
マイクロインジェクション技術は、このプロトコルの成功に不可欠であり、異なるマイクロインジェクション装置およびセットアップを使用する場合に調整する必要があります。特に、射出の圧力と時間は2つの主要な変数であり、針によって排出される容積が〜3nLであることを確認するために調節することができる。鉗子でそれを切り取ることによって決定される針のサイズはまた注入される胞子の数を調節する;しかし、大きな開口部は、幼虫に組織損傷を引き起こす可能性があります。一方、開口部が小さすぎると、比較的大きな胞子(>2 μm)が外に出て、針詰まりを引き起こす可能性があります。この場合、針は、わずかに大きな開口部を持つようにクリップすることができます。
細菌のマイクロインジェクションのための他のプロトコルは、均質な注入混合物を維持するためにPVP-40を利用するが、我々は アスペルギルス 胞子とこのキャリアを使用する上で任意の利点を発見していない。針の詰まりは、真菌製剤を徹底的にボルテックスして、針をロードする前に塊を壊すことによって軽減することができます。時には、針の詰まりは、一時的に圧力または注射時間を増加させ、針が幼虫を取り巻く液体中にある間にマイクロインジェクターを引き起こすことによって取り除かれる。圧力と射出時間は、前のレベルに再び減少する必要があります。他のケースでは、詰まりを除去することができず、新しい針をロードし、再調整する必要があります。
このプロトコルは、幼虫あたり〜30~70個の胞子を注入するように設計されています。胞毛調製物の濃度と注入される体積に基づいて、この数はかなり低いことが知られている。しかし、これはこれらの条件下で注入された胞子の数であることを経験的に発見されています。なぜこの違いが起こったのかは不明ですが、針の胞毛が凝集している可能性があります。より多くの胞子を注入しようとする私たち自身の試みは、ほとんど失敗しています。
約30~70個の胞子が注入され、すべての幼虫を通して注射の一貫性を維持するために、幼虫を取り巻くE3に注入して胞子の数を確認してください。すべての注射を通して5〜6匹の幼虫ごとにこれを繰り返します。胞子数が変化すると思われる場合は、圧力および/または注入時間を調整して、複数の幼虫に一貫した数の胞子を注入することができます。しかし, 注意してください注射用量は、主に後脳に残り、中脳と前脳を埋めないことを.
局所感染を確実にするために、胞毛懸濁液は後脳心室内に含まれるべきです。これは、注射直後のフェノールレッド染色によって視覚化することができますが、赤い色は時間とともに拡散します。注射の場合、オティックベシクルの周りの領域を貫通し、45°~65°の角度で心室に到達します。この領域は、主要な血管を持っていない、より少ない組織の損傷を引き起こし、瞬時に治癒します。心室の皮膚が突き刺さると、 アスペルギルス 胞子注射に使用しなければならない針が細菌懸濁液よりも大きいため、胞子懸濁液が漏出する可能性があります。誤って注射または誤って損傷した幼虫は、黄身に数回注入して赤いマークを作成するか、または針で列から幼虫をドラッグすることによってマークすることができます。一連の注射が完了した後、これらの幼虫は、残りの部分がプレートから洗い流される前に除去され、処分されるべきである。メチレンブルーのないE3は、注射前に幼虫を麻酔し、注射後も幼虫を保つために使用されます。
注射時に、CFUカウントは感染した宿主内の生存可能な胞子の数を表す。しかし、胞子が催眠術に発芽する場合、これらは均質化中に別々の生存可能な「真菌単位」に分かれて、複数のコロニーを生じさせることができる。または、切れ目のない多細胞性催眠術は、単一のコロニーを生じさせ、真菌の負担の平均値を示すが不正確である。これは、CFUカウントと個々の幼虫の縦方向顕微鏡を組み合わせることで緩和することができ、注入された胞子の運命の視覚的データを提供する。
哺乳類系と比較して、ゼブラフィッシュ幼虫感染モデルは、その光学的なアクセシビリティのために特に重要である。自然免疫細胞の徴生と応答は、生きた無傷の宿主の中で視覚化することができる。これは、分子標的の遺伝的または化学的阻害と組み込まれ、各標的が生きている動物の アスペルギルス 胞子に対するマクロファージまたは好中球反応にどのように影響するかを分析することができる。
ゼブラフィッシュ幼虫アスペルギルス感染モデルは、IA12、13、14、15、16、17、18、19、20、22の異なる側面を記述するのに役立ち続けていますが、他の拡大領域があります。宿主側からは、細胞レベルの免疫応答を記述するために使用されますが、標的モルフォリーノ、CRISPR、安定した突然変異線、または化学的暴露と組み合わせることによって、分子レベルで免疫メカニズムを分析するために拡張することができます。1つの注意点は、すべての既知の哺乳類の自然免疫経路成分のホモログはゼブラフィッシュで同定されていないということです。
病原体側からは、異なる種および株の病原性が記載されている。将来の研究の有望な道は、特定の遺伝子またはタンパク質が毒性因子としてどのように寄与するかをテストするために変異ア スペルギルス 株を使用することです。それにより、新規抗真菌薬を開発して、これらのタンパク質を標的とすることができる。現在の抗真菌薬は、ヒト患者の有効性が低く、真菌28でこれらの薬剤に対する耐性が高まっている。このin vivoモデルは、これらの薬物が失敗した理由を調査するために使用することができ、新しい抗真菌薬の有効性をテストするための中間モデルとして使用することができます。全体として、このモデルを用いて発見された知見は、 アスペルギルス感染患者に対する効果的な治療法の将来の開発を促進することができる。
Disclosures
開示する紛争や財政的利益はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所の国立アレルギー・感染症研究所が受賞番号K22AI134677の下で支援しました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
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