Summary
Ett protokoll för att blockera lymfa flöde genom kirurgiska suturering av afferent lymfkärl presenteras.
Abstract
Lymfkärl är avgörande för att upprätthålla vävnadsvätskan balans och optimera immunskydd genom att transportera antigener, cytokiner, och celler till dränerande lymfkörtlar (LNs). Avbrott i lymfflödet är en viktig metod när man studerar funktionen av lymfkärl. De afferenta lymfkärlen från murin footpad till popliteal lymfkörtlarna (pLNs) är väldefinierade som de enda vägarna för lymfdränage in i pLNs. Suturering dessa afferenta lymfkärl kan selektivt förhindra lymfflödet till pLNs. Denna metod möjliggör störningar i lymfflödet med minimal skada på lymfatiska endotelceller i dränerande pLN, de afferenta lymfkärlen, liksom andra lymfkärl runt området. Denna metod har använts för att studera hur lymfa påverkar höga endoteliala venules (HEV) och chemokine uttryck i LN, och hur lymfa flyter genom fettvävnaden kring LN i avsaknad av funktionella lymfkärl. Med det växande erkännandet av betydelsen av lymffunktionen kommer denna metod att ha bredare tillämpningar för att ytterligare riva upp funktionen av lymfkärl i regleringen av LN-mikromiljö och immunsvar.
Introduction
Den rumsliga organisationen av det lymfatiska systemet ger strukturella och funktionella stöd för att effektivt ta bort extracellulära vätska och transportera antigener och antigen-presentera celler (APCs) till den dränerande LNs. De inledande lymfkärl (även namngivna lymfatiska kapillärer) är mycket genomsläpplig på grund av deras diskontinuerliga intercellulära korsningar, som underlättar effektiv insamling av vätskor, celler, och andra material från omgivande extracellulära utrymmen1. De inledande lymfkärlen slås samman till att samla lymfkärl, som har snäva intercellulära korsningar, en kontinuerlig källare membran, och lymfatisk muskel täckning. Samla lymfkärl är ansvariga för transport av insamlade lymfa till dränerande LNs och så småningom återvänder lymfantill cirkulationen 2,3. De samlande lymfkärlen som driver lymfan in i den dränerande LN är de afferentalymfkärlen 4,5,6,7. Obstruktion av afferenta lymfkärl kan blockera lymfflödet i LNs, vilket är en användbar teknik när man studerar funktionen av lymfflödet.
Tidigare studier har visat att lymfflödet spelar en viktig roll i transporten av antigener och APC, samt upprätthålla LN homeostas. Det är väl underförstått att vävnadsbaserade APC-enheter, typiskt aktiverade migrerande dendritiska celler (DCs), färdas genom de afferenta lymfkärlen till LN för att aktivera T-celler8. Tanken att friform antigener, såsom mikrober eller lösliga antigener, passivt flöde med lymfa till LN för att aktivera LN-resident APC har fått acceptans under det senaste decenniet9,10,11,12. Fritt form antigener reser med lymfa ta minuter efter infektionen att resa till LN, och LN-resident cell aktivering kan ske inom 20 min efter stimuleringen. Detta är mycket snabbare än aktiveringen av migrerande DCs, som tar mer än 8 h för att komma in i dränerande LN9. Förutom att transportera antigener för att initiera immunskydd, bär lymfa också cytokiner och DCs till LN för att behålla sin mikromiljö, och för att stödja immuncell homeostas13,14. Tidigare, blockerande lymfflödet genom suturering de afferenta lymfkärl visat att lymfan krävs för att upprätthålla HEV fenotyp som krävs för att stödja homeostatiska T-cell och B-cell homing till LN15,16,17. CCL21 är en kritisk chemokine som leder DC och T cell positionering i LN8,18. Blockerande lymfflöde avbryter CCL21-uttrycket i LN och avbryter potentiellt DC- och T-cellpositionering och/eller interaktion i LN19. Blockerande lymfflöde kan således direkt eller indirekt upphäva antigen/DC-åtkomst till den dränerande LN genom att störa LN-mikromiljö som reglerar immunsvar i LN. För att bättre undersöka funktionen av lymfflödet presenteras ett experimentellt protokoll (Figur 1) för att blockera lymfflödet hos möss genom suturering av de afferenta lymfkärlen från fotplattan till pLN. Denna metod kan vara en viktig teknik för framtida studier om lymffunktion i friska och sjuka tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt djurarbete behöver godkännas av den institutionella och statliga etik- och djurhanteringskommittén. Detta är en icke-överlevnad kirurgi.
1. Beredning av material
- Förbered 100 mL av 70% etanol genom att blanda 70 mL av 100% etanol med 30 mL sterilt vatten. Autoklav alla kirurgiska verktyg före operation och hålla verktygen i 70% etanol före och under operationen för att upprätthålla sterilisering.
- Förbered en injektionsapparat.
- Skär ~30 cm polyetylylrör (0,28 mm i diameter). Anslut spetsen på en 30 G x 1/2 nål (nål A) till ena änden av polyetylenslangar. Försiktigt rubba ytterligare 30 G x 1/2 nål (nål B) och anslut den trasiga sidan till den andra änden av polyetenrör.
- Fäst nål A på en 1 mL tuberkulinspruta.
OBS: För denna polyetylylrör motsvarar 1,6 cm vätska i slangen 1 μL20.
- Förbered en 10:1 ketamin/xylazinblandning (10 mg/mL ketamin och 1 mg/mL xylazin) i saltlösning (bakteriostatisk 0,9% [w/v] natriumklorid). Bered lösningen nyligen före användning.
2. Beredning av djuret för kirurgi
OBS: Använd möss i åldern 6−10 veckor. Både hon- och hanmöss kan användas. I denna studie användes 6−10 veckor gamla, C57BL/6 honmöss. Denna metod kan anpassas för andra stammar av möss.
- Bedöva musen genom att injicera 250 μL av ketamin/xylazinblandningen intraperitonealt. Vänta tills musen är helt sovande. Se till att musen inte reagerar på en tå nypa för att upptäcka full anesthetization.
- Raka päls runt benen med hårklippningsmaskiner.
- Applicera depilatory krämen runt benet och vänta i 5 min. Torka bort kvarvarande päls och depilatory grädde med hjälp av en fuktig vävnad och rengör benet med sterilt vatten. Spraya 70% etanol runt benet för att sterilisera driftområdet. Etanolen är begränsad till snittplatsen.
3. Kirurgisk suturering av afferenta lymfkärl
OBS: Höger ben är suturerat, och vänster ben används som skenkontroll. Det lymfatiska suturprotokollet (steg 3,1−3,8) tar 20−30 min.
- Håll musen på en benägen position och fixa den med kirurgisk tejp för att exponera operationsområdet på höger ben.
- Injicera intradermiskt 5 μL av 1% Evans blått färgämne eller 9 cm av vätskan i injektionsapparatens slangar i fotplattan. Massera försiktigt fotplattan för att hjälpa Evans blå in i lymfkärlen.
OBS: Insulinsprutan är inte lätt att kontrollera vid liten volyminjektion. Volymen kan regleras noggrannare med hjälp av injektionsapparaten. Lymfkärl visualiseras av blått färgämne under huden. Med omfattande utbildning kan både afferenta lymfkärl ses med blotta ögat som genomskinliga kärl i fettvävnaden, parallellt med Saphenous artären. Med omfattande utbildning är det möjligt att suturera kärlen utan att injicera Evans Blue färgämne i de fall där det finns farhågor om potentiella störningar från färgämnet. - Under ett dissekerande mikroskop väljer du ett snittplats 5 mm från underkanten av poplitealfossan. Gör ett litet snitt (~5 mm) i huden med en sax. Använda fina operation forceps, sträcka snittet, och exponera de samlande lymfkärlen (Figur 1A).
OBS: Vid behov kan ett litet hudfragment avlägsnas för att exponera lymfkärlen. - Identifiera både afferenta lymfkärl som leder till pLN under det dissekerande mikroskopet (Figur 1B).
OBS: Det finns två afferenta lymfkärl från footpad till pLN. Båda måste sutured att blockera lymfa flöde helt. - Med hjälp av en nålhållare för du försiktigt in suturnålen (0,7 metrisk eller mindre) mellan det afferenta lymfkärlet och Saphenous-artären och drar försiktigt ut nålen runt det afferenta lymfkärlet. Dra försiktigt i sutursträngen och lämna ca 2 cm av sutursträngen bakom. Använd nålhållaren för att binda strängen tätt för att suturera ett lymfkärl med en kirurgs knut (Figur 1C).
OBS: Vävnaden under snittet kan torka ut med långvarig exponering för luft. Att göra snittet så litet som möjligt och utföra suturen snabbt (dvs. inom 5 min) kommer att förhindra att vävnaden torkar ut. Underhåll vävnadsfukten genom att applicera en liten volym saltlösning med en bomullspinne. - Massera försiktigt in fotplattan för att säkerställa att inget Evans Blue-färgämne passerar sutursajten och skär sedan den överflödiga strängen med sax.
- Utför samma sutursteg (dvs. steg 3.5 och 3.6) på det andra afferenta lymfkärlet (bild 1D). Stäng hudansionen med samma sutur som användes för att suturera kärlen i steg 3.5 (Bild 1E).
- För skenkontrollen injicerar intradermally 5 μL av 1% Evans blått färgämne vid vänster fotplatta och massera fotplattan för att visualisera lymfkärlen. Öppna huden med en excision och stäng sedan såret utan suturering av kärlet (Bild 1F).
- Övervaka eventuellt de opererade mössen i 2−4 h. Sutursidan av benet ska visa ödem med Evans Blue spridd till låret, medan kontrollbenet kommer att visa begränsat Evans blått färgämne i fotplattan. Om möss vaknar, en ytterligare ketamin / xylazin mix kommer att injiceras för att hålla sövda tills dödshjälp.
4. Spårning av lymfaflödet
- Omedelbart efter operationen injicerar intradermiskt 10 μL av 2% fluorescein isothiocyanate (FITC) i fotplattan på både kontrollen och det lymfatiska suturerade benet.
- Avliva mössen med 400 μL ketamin/xylazinblandning och utför livmoderhalsavföring när mössen är helt sövda.
- Samla pLNs från popliteal fossa och försiktigt ta bort perinodal fettvävnaden runt pLNs under dissekering mikroskop vid 2, 6, och 12 h efter FITC injektion.
- Bädda in pLN-näten med det medullära sinusområdet som är vänt mot sidan av kryoåringen i optimal skärtemperatur (OKT) förening (Figur 1G,H).
- Förbered 20 μm frysta sektioner med hjälp av en kryotomi.
- Avbilda kryosektionerna under ett konfokalmikroskop för att bestämma FITC-fördelningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lymfkärl sutur har använts i tidigare studier15,16,17,19, där det fungerade som ett viktigt verktyg för att studera funktionen av lymfflödet innan molekylärbiologi av lymfkärl var bättre förstås. Blockera lymfflödet avbryter LN homeostas, vilket leder till HEVs förlora den kritiska genuttryck som behövs för optimal lymfocyt homing till LN15,16,17. Sedan dess tog det ytterligare två decennier att visa att DCs reser med lymfa är avgörande för att upprätthålla HEV genuttryck profil och lymfocyter homing till LN13. Den skjuvning stress som tillhandahålls av lymfflödet är avgörande för att stimulera chemokine uttryck i LN. Blockera lymfflödet avbryter chemokine CCL21 uttryck i LN19, som är kritisk i att styra DC och T cell positionering i LN. Därför kan avbrutet flöde äventyra DCs och T-celler positionering i LN8,18.
Omedelbart efter operationen, en liten molekylvikt fluorescerande spårämne, FITC, användes för att spåra lymfflödet. FITC (10 μL av 2% FITC) injicerades intraderalt i fotplattan på skenkontrollen och det lymfatiska suturerade benet. De dränerande pLNs samlades 2, 6 och 12 h senare. De dränerande plN-enheterna var inbäddade i OCT, och 20 μm frysta sektioner utarbetades. Confocal bilder visade väsentligt minskad FITC ackumulering i pLNs efter sutur. Rest-FITC i pLN-arna ackumulerades företrädesvis i LN-bihålorna (figur 2).
Hur lymfan flyter genom fettvävnaden som omger LN undersöktes med hjälp av lymfatisk sutur. De afferenta lymfkärlen som leder till pLN:erna var suturerade för att blockera lymfflödet, och det bestämdes att den perinodala fettvävnaden kunde stödja en liten mängd lymfflöde när lymfkärl blockerades21. Lymfan flödet genom fettvävnaden till kapseln av LN kartlades; det verkade mata in i LN bihålorna. Små mängder av lymfa kan ha strömmat in i LN bihålorna över tid (Bild 3).
Bild 1: Steg av popliteal LN (pLN) afferent lymfkärl sutur. Kortfattat, efter möss var sövda med en ketamin och xylazine blandning, var deras ben rakade, och restpälsen avlägsnades genom en depilatory grädde. Höger ben användes för sutur och vänster ben var skenkontrollen. Den högra sidan av footpad var intradermally injiceras med 5 μL av 1% Evans Blue färgämne beredd i PBS. (A) Genom att försiktigt massera fotplattan, Evans Blue färgämne fyllde afferenta lymfkärl. (B) En liten hud snitt utfördes 5 mm bort från pLN att exponera lymfkärlen, som anges av de två vita pilarna. (C,D) Båda afferent lymfkärl var sutured. (E) Huden excision stängdes av suturer. (F) Kontrollbenet fick Evans blå injektion, hud excision, och suturförslutning utan suturering av lymfkärlen. (G) Framgången för lymfflödet blockeringen var indicerat av Evans blå färgämne, som trädde pLN av kontrollbenet men inte den suturerade benet. (H,I) De insamlade pLN var inbäddade i OCT förening med subcapsular sinus (SCS) och medullary sinus (MS) vänd mot sidan av kryosto innan snap frysning i flytande kväve. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: FITC-fördelning i de dränerande pLN-talen på skenbenet eller suturerade benet. Confocal bilder av pLNs samlas 2, 6 och 12 h efter FITC injektion visade väsentligt minskad FITC ackumulering i pLNs efter sutur. Resterande FITC i pLNsna förträffdes företrädesvis i LN bihålorna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: FITC-fördelning i perinodal fettvävnaden (PAT), runt de dränerande pLNs av sken eller suturerade benet. Confocal bilder av PAT och LN visade att FITC kommer in i PAT och LN bihålorna men var inte effektivt distribueras i hela LN när lymfkärl blockerades. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blockerande lymfflöde kommer att ha breda tillämpningar i manipulera antigen leverans till LN i friska och sjuka förhållanden. Det är möjligt att använda denna metod för att kontrollera tidpunkten för antigenleverans för att studera hur kontinuerligt lymfflöde reglerar immunsvar vid avtappning av LNs. Denna metod för lymfflödesavbrott kan också användas för att studera hur lymfan påverkar cellfackindelning, cellaktivering, cellmigration och cell-cellinteraktioner i LN.
Möss som specifikt uttrycker human difteritoxinreceptor (DTR) i deras lymfatiska endotelceller (Flt4-cre-dtr) har utvecklats; dessa kan användas för att specifikt tömma lymfkärl för att studera lymffunktion22. Administrering av DT dödar lymfatiska endotelceller längs lymfkärlen och i LN. Utarmningen av lymfatiska endotelceller kan helt upphäva lymfflödet regionalt eller systemiskt för att studera lymfatisk funktion. Denna metod orsakar betydande vätskeansamling i vävnad och fungerar som en stor modell för att studera lymfödem och lymfatisk funktion.
Jämfört med den lymfatiska endotelcellsspecifika DTR-uttrycksmodellen är fördelen med den lymfatiska suturmetoden att den avbryter lymfflödet med minimal skada på lymfatiska endotelceller eller något annat lymfkärl runt området. Interventionen påverkar inte direkt cellerna i dränerande LN, så den resulterande påverkan på LN-mikromiljö eller immuncellkommunikation är en följd av lymfflödesblockaden snarare än potentiell celldöd som induceras av DT. En annan fördel med denna metod är att lymfflödet omedelbart blockeras efter operationen, så tidpunkten för lymfa flödesblockaden kan kontrolleras bättre.
Begränsningen av denna metod är att den endast kan användas för att studera regional intervention av lymfflöde i afferenta lymfkärl från fotplattan till pLN. Denna metod behöver identifiering av den exakta platsen för de samlande lymfkärlen. Samla lymfkärl är svårt att identifiera i vissa anatomiska platser, och därmed denna teknik kräver omfattande anatomiska och kirurgiska utbildning innan framgångsrik identifiering av afferenta lymfkärl att blockera lymfaflödet. En annan begränsning är att denna metod inte direkt kan blockera lymfan in de inledande lymfkärlen. Efter suturen kan det blockerade lymfflödet öka det interstitiella vätsketrycket och ändra lymfflödesriktningen i de initiala lymfkärlen. Således kan de intakta lymfkärlen runt området kompensera för funktionen av de avbrutna lymfkärlen och ändra lymfflödets riktning.
Dessutom ökar injektionen av Evans Blue färgämne det interstitiella vätsketrycket, vilket kan störa den efterföljande spårämne eller antigeninjektionen. Den autofluorescence av Evans Blue färgämne kan störa andra fluorescerande spårämnen eller andra fluorforer som används för immunofluorescerande färgning. För att undvika all interaktion mellan Evans Blue dye och potentiella antigener, andra spårämnen, eller potentiella molekylära mekanismer för lymffunktion reglering, är det möjligt att identifiera de samlande lymfkärl utan Evans Blue färgämne med blotta ögat. Detta kan uppnås med omfattande utbildning för att identifiera fartygen. Andra färgämnen, såsom isosulfanblå färgämne kan också användas för att ersätta Evans Blue färgämne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Ava Zardynezhad för korrekturläsning av manuskriptet. Detta arbete stöds av Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035), och Canada Foundation for Innovation for SL (32930), och av National Natural Science Foundation of China för Yujia Lin (81901576).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W.
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
