Summary
Miljöallergener som dammkvalster (HDM) innehåller ofta mikrobiella ämnen som aktiverar medfödda immunsvar för att reglera allergisk inflammation. Protokollet presenteras här visar identifiering av DSRNA arter i HDM allergener och karakterisering av deras immunogenic verksamhet i modulering eosinofila lungcancer inflammation.
Abstract
Miljöallergener som dammkvalster (HDM) är ofta i komplexa former som innehåller både allergiska proteiner som driver avvikande typ 2-svar och mikrobiella ämnen som inducerar medfödda immunsvar. Dessa allergen-associerade mikrobiella komponenter spelar en viktig roll i regleringen av utvecklingen av typ 2 inflammatoriska tillstånd såsom allergisk astma. De underliggande mekanismerna är dock fortfarande i stort sett odefinierade. Protokollet presenteras här bestämmer strukturella egenskaper och in vivo verksamhet allergen-associerade immunstimulerande RNA. Specifikt undersöks vanliga allergener för förekomsten av dubbelsträngade RNA (dsRNA) arter som kan stimulera IFN svar i lungorna och begränsa utvecklingen av svår lungeosinofili i en mus modell av HDM-inducerad allergisk astma. Här har vi inkluderat följande tre analyser: Dot blot att visa dsRNA strukturer i totalt RNA isolerade från allergener inklusive HDM arter, RT-qPCR att mäta verksamheten i HDM RNA i interferon stimulerande gener (ISGs) uttryck i mus lungor och FACS analys för att bestämma effekterna av HDM RNA på antalet eosinofiler i BAL och lunga, respektive.
Introduction
Baserat på hygienhypotesen som ursprungligen föreslogs av Strachan1, tidig barndom exponering för miljömässiga mikrobiella faktorer såsom endotoxin kan skydda mot utvecklingen av allergiska sjukdomar2,3. Vid mikrobiella infektioner, t.ex.4,5,6 Förekomsten och prevalensen av immunogena nukleinsyror såsom långa dubbelsträngade RNA-arter (dsRNA) i husdammmider (HDM) eller andra insektsallergener är dock fortfarande okända. Detta protokoll har utformats för att avgöra om HDM eller insekts- och non-insect allergener innehåller långa dsRNA-arter som kan aktivera ett skyddande immunsvar för att motverka utvecklingen av svår eosinofil lunginflammation i en musmodell av allergisk astma. Här erbjuder vi tre enkla och snabba metoder för att utvärdera de strukturella bestämningsfaktorerna i HDM totala RNA som krävs för att reglera allergen-inducerad eosinofil lunginflammation.
Den slemhinnan immunsystemet är den största immunsystemet i kroppen och fungerar som den första raden av värd försvar mot både mikrobiella infektioner och allergiska förolämpningar7,8. Den långa dsRNA, replikationen mellanliggande av många virus, är känd för att fungera som en patogen-associerade molekylära mönster (PAMP) för att kraftfullt stimulera medfödda svar via Toll som receptor 3 (TLR3) för att framkalla uttrycket av interferon stimuleras gener (ISGs)9,10,11,12,13,14. Vi har nyligen visat att HDM totala RNA innehöll dsRNA strukturer, som uppreglerade uttrycket av ISGs och minskade allvarliga eosinofila lunginflammation när de administreras via intratracheal instillation i en murine modell av allergisk astma framkallas av HDMextrakt 15. Svårighetsgraden av lunginflammationer bestäms genom att analysera immuncelltyperna i bronchoalveolar lavage (BAL) och lungvävnad via flödescytometri16,17,18,19,20.
Detta protokoll innehåller tre analyser: 1) snabb detektering av dsRNA-strukturer med RNA-punkt blot med hjälp av en mus monoklonal antikropp J2 som specifikt binder till dsRNA (≥40bp) på ett sekvensoberoende sätt; 2) snabb utvärdering för in vivo effekter av immunstimulerande RNA i mus lungor genom att mäta induktion av ISGs med HJÄLP AV RT-qPCR; 3) korrekt kvantifiering av eosinofiler i BAL och lunga i samband med HDM-inducerad lunginflammation med flöde cytometri analys.
Ovanstående analyser kan användas för att studera inte bara allergiska lungsjukdomar, men också respiratoriska bakteriella och virala infektioner. Till exempel kan dsRNA-specifika J2-antikroppar också användas i andra tillämpningar såsom immunoaffinitetkromatografi, immunohistokemi, enzymrelaterad immunsorbentanalys (ELISA) och immunbehållande21,22,23. Dessutom kan flera tillämpningar nedströms BAL-vätskeinsamling användas för att kvantifiera lösligt innehåll såsom cytokiner och chemokines med HJÄLP AV ELISA, och transkriptionell profilering av celler i luftvägarna (t.ex. alveolar makrofager). Även om det finns en mängd olika protokoll som finns i litteraturen för att utvärdera lungsjukdomar, fokuserar de flesta av dessa protokoll ofta på målvalideringen. De förfaranden som beskrivs här kan tillämpas för att identifiera komponenter i miljöallergener som är viktiga för att reglera utvecklingen av allergiska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentella förfaranden som beskrivs här godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee of University of Texas Health San Antonio.
1. Dot blot för att visa förekomsten av DSRNA strukturer i HDM totalt RNA
- Total RNA-isolering från allergener, insekter och non-insect allergener
- Sätt HDM, insekter eller icke-insektsdjur som samlats in levande eller erhålls kommersiellt i 50 ml-rör, och frys snabbt med flytande-N2. Förvara sedan vid -70 °C för efterföljande total RNA-isolering.
OBS: I detta experiment valdes HDM, insektsdjur och icke-insektsdjur ut eftersom de är kända för att vara vanliga källor till allergener. Vidare är en immunstimulatorisk funktion av deras RNA fortfarande oklart. - Överför en lämplig mängd (motsvarande 100 μl i volym eller mindre) av HDM, insekter eller icke-insektsdjur som lagras vid -70 °C till ett 2 ml-rör som innehåller pärlor (1,4 mm keramiska sfärer) och frys sedan rören i en behållare för flytande N2 i ~10 min.
- För den totala RNA-isoleringen, tillsätt 1 ml guanidiniumtiocyanatbaserad RNA-isoleringsreagens24 till varje rör och bryt sedan insekts- och icke-insekts små djuren med en högenergicellstörare vid maximal hastighet för 45 s och kyla på is. Upprepa det här steget två gånger.
- Överför lösningen från steg 1.1.3 till ett nytt 1,5 ml-rör och tillsätt 200 μl kloroform till varje rör och virvel. Centrifugrör vid 14 000 x g i 14 min vid 4 °C.
- När centrifugeringen är klar överför du den övre vattenfasen (200 μL) till ett nytt 1,5 ml-rör som innehåller 500 μl isopropanol för att fälla ut RNA-pelleten. Stör inte interfasen. Det rekommenderade volymförhållandet för den övre fasen jämfört med isopropanol är förhållandet 1:2.5.
- Blanda genom skonsam virvelning, sedan centrifugrör vid 14.000 x g i 14 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten med försiktighet och tvätta sedan RNA-pelleten med 500 μL 75% etanol och centrifug vid 7 500 x g i 10 min vid 4 °C. Avlägsna all vätska med försiktighet, lufttorka pelleten och lös upp RNA-pelleten med 20-50 μL RNase-fri H2O.
- Mät RNA-koncentrationen med en spektrofotometer med hjälp av följande parametrar:
- Öppna tillhörande programvara och välj vilken typ av nukleinsyror som ska mätas. Ändra exempeltypen till RNA.
- Utför den tomma mätningen med 1-2 μL RNase-fri H2O. Torka av RNase-fria H2O. Nu är instrumentet klart för mätning.
- Belastning 1-2 μL av RNA-provet och mät RNA-koncentrationen (μg/μL).
OBS: Förhållandet mellan absorbansen vid 260 och 280 nm (A260/280) vid ~2,0 (1,9-2,2) är allmänt accepterat som "ren" för RNA. Om de inte bearbetas omedelbart, förvara RNA-prover vid -70 °C och undvik frys-töcyklerna för att hålla RNA intakta.
- Sätt HDM, insekter eller icke-insektsdjur som samlats in levande eller erhålls kommersiellt i 50 ml-rör, och frys snabbt med flytande-N2. Förvara sedan vid -70 °C för efterföljande total RNA-isolering.
- Detektion av dsRNA-struktur i den totala RNA med hjälp av dsRNA-specifik J2-antikropp
- Bered två 20 μl RNA-prover (200 ng/μL). En med RNase-III behandling (1 μL för 1 μg RNA, inkubera vid 37 °C i 60 min) och den andra utan RNase-III behandling.
OBS: RNase III används här för att specifikt försämra dsRNA, men inte enkelsträngad RNA25. - Använd en penna för att rita galler där RNA-prover kommer att utplånas på membranet.
- Spot 2 μL av 200 ng/μL av RNA-provet på det positivt laddade nylonmembranet.
- Korsa proverna till membranet vid 1 200 mikrojoule x 100 i en UV-tvärlänk. Upprepa steg 1.2.3 och 1.2.4 två gånger till på provplatsen. Detta resulterar i totalt 0,8 μg per blot.
OBS: Se inte mer än 2 μl RNA-prov på membranet åt gången. - Blockera icke-specifik bindning med 5% mjölk i TBS-T för 1 h med skakning vid rumstemperatur. Ta bort blockeringslösningen från steg 1.2.5 och tillsätt anti-dsRNA J2-antikroppen vid 1:1 000-spädningen i 1 % mjölk i TBS-T och inkubera över natten med skakning vid 4 °C.
- Tvätta membranet med TBS-T i 5 min och upprepa detta steg i 3 gånger. Tillsätt den sekundära antikroppen (alkalisk fosfataskonjugerad Anti-Mouse IgG utspädd i 1% mjölk 1:5000) och inkubera i 1 h på en shaker vid rumstemperatur. Tvätta membranet med TBS-T i 5 min och upprepa detta steg i 3x.
- Tillsätt substratet (BCIP/NBT) och inkubera i 5-15 minuter tills en önskad signal är synlig.
- Stoppa reaktionen genom att skölja membranet med ddH2O.
- Torka membranet på mjukpapper och ta ett fotografi med hjälp av en smartphone (ett representativt resultat visas i figur 1).
- Bered två 20 μl RNA-prover (200 ng/μL). En med RNase-III behandling (1 μL för 1 μg RNA, inkubera vid 37 °C i 60 min) och den andra utan RNase-III behandling.
2. RT-qPCR för att mäta förmågan hos HDM totalt RNA för att stimulera lung-ISGs uttryck
- RNA isolering från möss lungvävnad
OBS: Möss (hona, 8-12 veckor gamla, C57BL/6J) bibehölls under specifika patogenfria förhållanden.- Bedöva djuret med isofluran och administrera genom intratrakeal instillationen med 5 μg (utspädd i 80 μl PBS) av HDM RNAs som behandlats med eller utan RNase III.
- Efter 16-18 h post HDM RNA behandling, offra musen genom CO2 inandning i några minuter. Placera sedan musen på en plattform och stift lemmar med nålar.
- Desinficera musen med 70% etanol och skär sedan huden från buken till halsen med en steriliserad sax.
- Fixa huden med nålar och skär revbenen för att exponera lungorna. Ta bort hela lungorna och tvätta dem med kall PBS. Placera lungorna på mjukpapper och punktskatt en liten bit av varje lunglob i ett 2 ml-rör som innehåller pärlor (200-300 μL i volym, 1,4 mm keramiska sfärer).
OBS: Syftet med att använda keramiska pärlor är att slipa hela lungvävnader - Frys lungproverna genom att placera rören i en behållare för vätska-N2 i ~10 min.
- Tillsätt 500 μl guanidinium tiocyanatbaserad RNA-isoleringsreage till varje rör och bryt lungvävnaderna med en homogenisator för 45 s. Chill på is mellan varje steg. Upprepa det här steget två gånger.
- Följ stegen 1.1.4- 1.1.7 för lung-RNA-isolering.
- Lufttorka pelleten och lös upp RNA-pelleten med rätt mängd RNase-fri H2O (~20-30 μL).
- Mät RNA-koncentrationen enligt beskrivningen i steg 1.1.8.
- RT-qPCR att bestämma förmågan hos HDM RNA att stimulera lunggenuttryck.
- Använd 100 ng/μL RNA som utvinns ur lungvävnader som mall, utför cDNA-syntesen enligt det refererade protokollet26.
- Ställ in en RT-qPCR-reaktion på 10 μL/brunn för en 384-brunnsplatta med cDNA som genereras ovan och de genspecifika grundfärgsparen (tabell 1 och tabell 2).
- Täta brunnarna tätt med en transparent självhäftande film och virvel plattan för 30 s. Snurra plattan på 1000 x g för 30 s för att samla prover längst ner i brunnarna.
- Lasta plattan på en RT-qPCR-maskin och börja köra RT-qPCR-reaktionen med hjälp av termiskcykelprotokollet (tabell 3).
- Exportera resultaten till en kalkylbladsfil eller analysera data med hjälp av programvaran som tillhandahålls av tillverkningen efter att programmet har slutförts (ett representativt resultat visas i figur 2).
3. FACS-analys för att fastställa effekterna av HDM RNA på infiltrationen av eosinofiler i BAL och lungor
- BAL vätskeinsamling för FACS-analys
- Avliva möss (hondjur, 8-12 veckor gamla, C57BL/6J) som behandlades med HDM allergenextrakt (enligt den experimentella design som visas i figur 3B) genom CO 2-inandning.2
- Placera musen på en plattform och stift lemmar med nålar.
- Desinficera musen med 70% etanol. Använd sax för att skära huden från det övre området av buken till halsen.
- Försiktigt, dra spottkörtlarna och sternohyoid muskeln försiktigt isär med hjälp av pincett för att exponera luftstrupen. Placera en nylonsträng (~10 cm) under luftstrupen med pincett.
- Gör ett snitt i luftstrupen (~ 2 mm under struphuvudet) precis tillräckligt för att sätta in en kanyl. Skär inte genom luftstrupen. Knut strängen runt luftstrupen och kanylen.
- Fyll på sprutan med 1 ml PBS+EDTA och fäst den i slutet av kanylen. Injicera 1 ml PBS+EDTA i lungan och aspirera helt på lösningen. Lossa sprutan från kanylen försiktigt och överför lösningen till ett 15 ml-rör på is.
- Ladda om sprutan med den färska PBS+EDTA och upprepa detta steg 2x.
- Centrifugera röret som innehåller den poolade BAL som erhålls i steg 3.1.7 för att pelleta cellerna vid 500 x g i 7 min vid 4 °C. Registrera volymen AV BAL-vätska och överför sedan supernatanten till två 1,5 ml-rör utan att störa pelleten.
OBS: Supernatanten av BAL kan lagras vid -70 °C för framtida analys t.ex. - Om det finns RBCs som finns i pelleten på grund av svår lunginflammation, efter avlägsnande av supernatant, tillsätt 500 μL RBC lysis buffert och blanda väl genom respensionus. Överför lösningen till ett nytt 1,5 ml-rör och centrifug i 7 min vid hastigheten 500 x g vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och sätt tillbaka pelleten på 150 μL FACS-buffert.
- Överför det återsuspenderade provets 150 μL till 96-brunnsplattan och centrifugera plattan i 7 min med en hastighet av 500 x g vid 4 °C.
- Snabbt, invertera plattan på mjukpapper för att samla cellerna som bor längst ner i brunnarna.
- Färga cellerna med antikroppar i FACS-bufferten i närvaro av 2,4 G2 blockerande antikroppar (2,5 μg / 100 μL). Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 min på en mörk plats.
- Efter färgning, centrifugera plattan till pellet cellerna vid 500 x g i 7 min vid 4 °C.
- Ta bort färgningslösningen genom att vända plattan på mjukpapper och tvätta sedan genom att återanvända med 100 μL FACS-buffert. Därefter centrifugera plattan igen vid 500 x g i 7 min vid 4 °C och ta bort FACS-bufferten genom att vända plattan på mjukpapper.
- Resuspend prover i 150 μL FACS buffert och överför prover till FACS rör som innehåller 350 μL FACS buffert. Tillsätt 25 μL räknepärlor till varje prov. Proverna är nu klara för flödescytometrianalys.
OBS: Olika celltyper i BAL-vätska var märkta med antikroppar som anges. Räknepärlor lades till innan FACS-körningen. Flödescytometridata analyserades med hjälp av en kommersiellt tillgänglig programvara. Se figur 3 och tabell 4 för strategi för utveckling.
- Lungvävnadsnedsmältning för FACS-analysen
- Följ steg 3.1.1 - 3.1.3.
- Skär huden från buken till halsen med en steriliserad sax. Fixa huden med nålar och skär revbenen för att exponera lungorna.
- Ta bort hela lungorna och tvätta dem med kall PBS. Placera proverna i 1,5 ml-röret som innehåller 50 μL lungrötningslösning.
- Finhacka lungvävnaderna i små bitar med en böjd sax. Överför lungvävnaderna till en 6-brunnsplatta och tillsätt sedan 8 ml lungnedsmältningslösning. Placera plattan på en shaker i 37 °C inkubator i 45 min.
- Efter inkubation, använd toppen av 1,5 ml röret för att slipa lungvävnaderna. Placera en 70 μm sil på en ny 6-brunnsplatta och applicera provet genom 0,22 μm filter.
- Överför den filtrerade lösningen till ett 15 ml-rör och centrifugera sedan rören vid 500 x g i 7 min vid 4 °C. Sug upp supernatanten och resuspend pelleten i 1 ml RBC lysis buffert och lämna den på is i 3 min.
- Överför provet till 1,5 ml-rör och centrifug vid 500 x g i 7 min vid 4 °C. Upprepa 2x
- Tvätta lungcellerna 2x med 1 ml FACS-buffert. Aspirera supernatanten och resuspend pelleten i 1 ml FACS buffert, och sedan överföra 100 μL av provet till 96 brunnsplatta.
- Centrifugera plattan i 7 min vid en hastighet av 500 x g vid 4 °C. Följ stegen som beskrivs i BAL-vätskeinsamling för FACS-analys (3.1.13 till 3.1.16) för att färga cellerna i smälta lungvävnadsprover.
OBS: Eosinofiler i lungorna var märkta med antikroppar som anges, sedan blandas med räkna pärlor för ytterligare FACS analys. Flödescytometridata analyserades med hjälp av tillhörande programvara. Se figur 3 för utvärdering av HDM RNA-inducerade immunsvar.
4. Statistisk analys
- Utför statistisk analys med hjälp av en kommersiellt tillgänglig programvara.
- Bestäm p p-värdena genom obetalt tvåstjärtat Student t-test för jämförelse av två grupper.
- Beräkna det absoluta antalet eosinofiler baserat på referenspärlor (övre panelen) med hjälp av formeln
- Bestäm p p-värdena genom tvåvägs ANOVA och Sidaks flervalsjämförelsetest för jämförelse av mer än två grupper.
- Betrakta ett p-värde som är mindre än 0,05 som statistiskt signifikant. P-värdena anges på tomter som *p <0,05, **p<0.01, ***p<0.001 och ****p<0.0001.
Obs: Alla buffertrecept finns i tabell 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förekomsten av långa dsRNA strukturer i HSM, insekter och icke-insekt små djur undersöktes av dot blot med hjälp av en dsRNA-specifik mus monoklonala antikroppar J2 (≥ 40bp). RNase III användes för att smälta dsRNA till 12–15 bp dsRNA-fragment, som inte kunde upptäckas av J2 (figur 1).
Förmågan hos HDM totala RNA att stimulera ett medfött immunsvar i muslungor på ett dosberoende sätt analyserades av RT-qPCR (figur 2, övre). RNase III-behandlingen avskaffade immunstimulerande aktiviteten hos HDM totalt RNA, vilket indikerar att dsRNA-strukturer i HDM totala RNA är avgörande för medfödd immunaktivitet i lungorna (Figur 2, lägre).
De hämmande effekterna av HDM totala RNA på utvecklingen av en allvarlig typ 2 lunginflammation utvärderades med FACS-analysen (figur 3A). I denna studie inducerades den eosinofila lunginflammationen av HDM-extrakt, som behandlades med eller utan RNase III enligt den experimentella designen (figur 3B). RNase III behandling användes för att ta bort långa DSRNA arter från HDM extrakt. Som väntat resulterade nedbrytningen av långa dsRNA arter i svår typ 2 lunginflammation återspeglas av de ökade eosinofiler nummer i BAL och lungor. Noterbart är att antalet eosinofiler i den totala RNA-behandlade gruppen med HDM i HDM är jämförbart med den grupp som behandlas med det ursprungliga HDM-extraktet som endogent innehåller de långa dsRNA-arterna (figur 3B).
Figur 1: Detektion av dsRNA-strukturerna i HDM RNAs av dsRNA-specifika J2 Ab med punkt blot. Totalt RNA från olika aeroallergener inklusive Dermatophagoides farinae (D.f.) och Dermatophagoides pteronyssinus (D.p.) blottades på ett nylonmembran för detektion av dsRNA (vänster panel). HDM (D.f. och D.p.) RNA lämnades obehandlat (-), behandlade med RNase III (dsRNA-specifik nukleas) och RNase T1 (ssRNA-specifik nukleas) (höger panel). Denna siffra är omtryckt från She et al.15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Induktion av ISG mRNA-uttryck med totalt RNA från HDM (D.f.) mättes med RT-PCR. När HDM RNA levererades till muslungor kunde den stimulera ISGs uttryck på ett dosberoende sätt(övre panelen). RNase III behandling elimineras immun stimulerande aktivitet HDM RNA (nedre panelen). Denna siffra är omtryckt från She et al.15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Karakterisering av specifika celltyper i luftvägarna och utvärdering av BAL-vätska och lungeosinofiler. (A)Gating strategi som används för att identifiera celler som återhämtat sig från BAL vätska var färgade för cellytan markörer som anges. (B)Administrering av HDM (D.f.) RNA vid 5 μg/mus (blå bar) jämfört med kontrollmuslung RNA (röd stapel). HDM (D.f.) RNA men inte dsRNA-utarmat HDM extrakt minskade antalet eosinofiler i både luftvägar och lungor hos djur som behandlats med HDM extrakt. Denna siffra är omtryckt från She et al.15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mus Primers | Sekvens (framåt-bakåt, 5'→3') | |
| RPL19 (RPL19) | AAATCGCCAATGCCAACTC; TCTTCCCTATGCCCATATGC |
|
| IL1β (av il1β) | TCTATACCTGTCCTGTGTAATG; GCTTGTGCTCTGCTTGTG |
|
| IFIT3 | TGGCCTACATAAAGCACCTAGATGG; CGCAAACTTTTGGCAAACTTGTCT |
|
| ISG15 (PÅ) | GAGCTAGAGCCTGCAGCAAT; TTCTGGGCAATCTGCTTCTT |
|
| Mx1 (på andra sätt) | TCTGAGGAGAGCCAGACGAT; ACTCTGGTCCCCAATGACAG |
|
| OASL2 (OASL2) | GGATGCCTGGGAGAGAATCG; TCGCCTGCTCTTCGAAACTG |
|
| TNFα (olika) | CCTCCCTCTCATCAGTTCTATGG; GGCTACAGGCTTGTCACTCG |
|
Tabell 1: RT-qPCR Primers.
| Reagenser | Volym (10 μl) | |
| Universal SYBR Grön supermix (2x) | 5 μl | |
| Framåt och bakåt primers (5 μM) | 1 μl | |
| cDNA-mall | 0,4 μl | |
| DNase- och RNase-fria H2O | 3,6 μl | |
Tabell 2: Master mix setup för RT-qPCR.
| Steg | Temperatur | Tid |
| Steg 1 | 95 oC | 3 minuter |
| Steg 2 | 95 oC | 10 sekunder |
| Steg 3 | 55 oC | 30 sekunder |
| Steg 4 | Gå till steg 2 (Upprepa 2-3 för 39 cykler) | |
| Steg 5 (smältkurva) | 55 oC till 95 oC | 0,5 oC, steg (hålltiden är 5 sekunder) |
Tabell 3: Program för att köra RT-qPCR.
| 1. Skapa en tomt som består av framåt (FSC) och sida scatter (SSC). |
| 2. Skapa en liten tomt för att räkna pärlor (FSC låg, FITC hög). |
| 3. Skapa ett område för att endast gate för levande celler samtidigt som man utesluter döda celler med BV510 färgämne. |
| 4. Levande celler kan sedan delas upp i CD11c hög och CD11c låga populationer. |
| 5. Från CD11c hög befolkning gate för makrofager (SiglecF hög MHCII låg) och DCs (SiglecF låg, MHCII hög). |
| 6. Från CD11c låg grind för T-celler (CD3/19 hög, MHCII låg), och B-celler (CD3/19 hög, MHCII hög). |
| 7. Från CD11c låg CD3/19null cellpopulation, gate för neutrofiler (CD11b hög, Ly-6G hög) och Eosinofiler (CD11b hög, Ly-6G låg, SiglecF hög). |
| 8. För att gating strategi för Eosinofiler i lungvävnaderna, använd dessa markörer efter utom döda celler med BV510 färgämne (CD45, SiglecF, CD11C). |
Tabell 4: FACS körs
| Tbs: |
| 20 mm Tris-HCl |
| 150 mm NaCl |
| pH 7,5 |
| TBS-T: |
| 0,05% Tween-20 i TBS |
| Blockera buffert |
| 5 % fettfri mjölk utspädd i TBS-T |
| Buffert för utspädning av antikroppar |
| 1 % fettfri mjölk utspädd i TBS-T |
| PBS+EDTA |
| 1x PBS + 0,1 mM EDTA |
| FACS-buffert |
| 2% Fetala Kalv Serum (FCS) i 1x PBS |
| Totalt cellmedium |
| RPMI 1640, 1X glutamax, 10% FCS, 50 μM 2-mercaptoetanol och Penicillin-Streptomycin. |
| Lungrötningslösning |
| Totalt cellmedium plus Liberase (50 μg/ml) och DNase I (1 μg/ml) |
Tabell 5: Recept på buffertar och lösningar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande protokollet beskriver hur man utvärderar immunstimulerande egenskaper allergen-associerade mikrobiella RNA och deras effekter på utvecklingen av eosinofil lungcancer inflammation i en mus modell av allergisk astma. Även om långa dsRNAs är kända som replikering intermediärer av många virus som kan aktivera interferon svar i däggdjursceller, deras närvaro i HDM allergener har varit okänd tills vårt senaste arbete15. Kombinationen av RNA dot blot, RT-qPCR och FACS analys presenteras i detta manuskript kan ge ett bra exempel på att dissekera medfödda komponenter såsom dsRNA arter i miljöallergener som är kritiskt involverade i reglering allergen-inducerad eosinofil inflammation.
I detta protokoll har RNA dot blot använts för att upptäcka förekomsten av dsRNA strukturer i naturliga allergener med hjälp av en mus monoklonal antikropp J2, som specifikt binder till dsRNA (≥40bp) oberoende av sekvens. Denna metod är mycket tillförlitlig eftersom J2-antikroppar fortfarande kan känna igen dsRNA-prover som förbehandlats med RNase T1 (enkelsträngad RNA-specifik endonuclease), men inte prover som förbehandlats med RNase III (en dsRNA-specifik endonuclease). Det är dock värt att påpeka att en allmänt använd syntetisk analog av dsRNA, polyinosinic:polycytidylic syra [Poly(I:C)], har rapporterats företrädesvis binda till en annan anti-dsRNA monoklonala antikropp K1, i stället för J221,22,23. Därför rekommenderas inte användning av J2-antikroppar för detektion av Poly(I:C).
Celltypanalys på prover som samlats in från BAL eller lungvävnader är användbar för att bedöma utvecklingen av allergisk lunginflammation. Även om BAL-förfarandet är en vanlig teknik kan resultaten variera mellan forskningslaboratorier. Många faktorer kan orsaka dessa variationer såsom mängden bronchoalveolar lavage samlas in. Den idealiska volymen av BAL återhämtat sig från en 8-12 veckor gamla möss är ~ 3 ml19. En annan faktor som kan bidra till bristen på reproducerbarhet är hur djup katetern ska föras in i luftstrupen (~0,5 cm är optimalt) eftersom djupare införing av katetrerna kan orsaka skador på luftstrupen. Dessutom bör forskare också överväga andra faktorer såsom ålder, stam och kön av möss eftersom dessa faktorer kan i hög grad påverka experimentresultaten27,28,29.
Här tillhandahåller vi ett tekniskt protokoll för att karakterisera immunmodulerande effekter av HDM RNA in vitro och in vivo med RNA dot blot, RT-qPCR och FACS analys av BAL och lungvävnader. Korrekt praxis kan säkerställa framgångsrik reproducerbarhet av resultat som erhållits när de utför dessa tekniker. Försök till exempel att undvika kontaminering av RNases när du utför RNA dot blot. Centrifugeringshastigheten bör också justeras ordentligt eftersom den onödiga högre centrifugeringshastigheten kan äventyra cellens livskraft. Slutligen bör celler som används för FACS-analysen åtgärdas om de inte analyseras samma dag.
Eftersom medfödd immunitet spelar en central roll i värd försvar och inflammation2,3, de tekniker och metoder som beskrivs i detta dokument kommer att vara mycket användbart för att studera immunmodulerande roll andra medfödda immunkomponenter såsom mikrobiellt DNA i naturliga allergener i utvecklingen av typ 2 inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Ms Karla Gorena för tekniskt stöd i flöde cytometri. L.S. stöds av China Scholarship Council och Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. stöds av Institutionen för kliniska laboratorievetenskaper, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Saudiarabien. X.D.L. stöds av UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund och Max och Minnei Voelcker Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.40 µm Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Tube | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ant | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Antibody dilution buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418) | BioLegend | 117317 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate | Promega | S3721 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 to 200 dilution |
| Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 to 200 dilution |
| BCIP/NBT substrate | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking Buffer | (see Table 5 for recipe) | ||
| Cannual, 20G X 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cockroach | Greer Laboratories | B26 | |
| Counting beads | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digital Dry Bath - Four Blocks | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| Earthworm | San Antonio | Note: Locally collected | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS buffer | (see recipe in Table 5) | ||
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Flow cytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 anti-dsRNA monoclonal antibody | SCICONS | 10010200 | |
| Lung digestion solution | (see recipe in Table 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL tube | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Microscope | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Needle, 21 G x 1 1/2 in | BD Biosciences | 305167 | |
| Non-fat milk | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylon string | Dynarex | 3243 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| Shaker or Small laboratory mixer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluorescent | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 to 10 dilution |
| Spider | San Antonio | Note: Locally collected | |
| TBS | (see recipe in Table 5) | ||
| TBS-T | (see recipe in Table 5) | ||
| Total cell medium | (see recipe in Table 5) | ||
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Note: Locally collected |
References
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
- Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
- Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
- Wu, J., Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).
- O'Hara, A. M., Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).
- Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces. , Microbiology Society. Available from: https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html (2018).
- Weber, F., et al. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).
- Barral, P. M., et al. Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity. Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).
- Netea, M. G., et al. From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).
- McNally, B., et al. Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways. PLoS One. 7, 51351 (2012).
- Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia. Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).
- Toussi, D. N., Massari, P. Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands. Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).
- She, L., et al. Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation. Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).
- Fujimoto, Y., et al. Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection. Science Reports. 7, 9128 (2017).
- Yao, Y., et al. Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity. Cell. 175, 1634-1650 (2018).
- Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties. Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).
- Van Hoecke, L., et al. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Salahuddin, S., et al. Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment. Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).
- Hungary (SCICONS). "Antibodies - J2." Antibodies - Monoclonal Anti-DsRNA J2 and Anti-DsRNA K1. English and Scientific Consulting Kft. , Available from: scicons.eu/en/antibodies/j2/ (2020).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Monsion, B., et al. Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein. Front Plant Sci. 9, 70 (2018).
- TRIzol Reagent Literature. RNA Isolation with TRIzol (Invitrogen) and Qiagen RNAeasy. Invitrogen Life Technologies. , Available from: http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf (2020).
- ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245 (2020).
- IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf (2020).
- Redente, E. F., et al. Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).
- Gueders, M. M., et al. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).
