Summary
Описана клеточная культура и метод воздействия бронхов in vitro для реалистичного, повторного ингаляционного воздействия частиц для тестирования токсичности.
Abstract
Для тестирования токсичности частиц, передающихся воздушно-капельным путем, были разработаны системы воздействия воздухо-жидкого интерфейса (ALI) для испытаний in vitro, чтобы имитировать реалистичные условия воздействия. Это ставит конкретные требования к моделям клеточной культуры. Многие типы клеток негативно влияют на воздействие воздуха (например, высыхание) и остаются жизнеспособными только в течение нескольких дней. Это ограничивает условия воздействия, которые могут быть использованы в этих моделях: обычно относительно высокие концентрации применяются в качестве облака (т.е. капель, содержащих частицы, которые быстро оседают) в течение короткого периода времени. Такие экспериментальные условия не отражают реалистичного долгосрочного воздействия низких концентраций частиц. Для преодоления этих ограничений было исследовано использование линии бронхиальных эпителиальных клеток человека. Эти клетки могут быть откоунены в условиях АЛИ в течение нескольких недель, сохраняя при этом здоровую морфологию и стабильный монослой с плотными соединениями. Кроме того, эта бронхиальная модель подходит для тестирования последствий повторного воздействия низких, реалистичных концентраций частиц в воздухе с помощью системы воздействия ALI. Эта система использует непрерывный поток воздуха в отличие от других систем воздействия ALI, которые используют одну небулизацию, производящую облако. Таким образом, система непрерывного потока подходит для повторного и длительного воздействия частиц, передающихся воздушно-капельным путем, при непрерывном мониторинге характеристик частиц, концентрации воздействия и доставленной дозы. В совокупности эта бронхиальная модель в сочетании с системой непрерывного воздействия потока способна имитировать реалистичные, повторяющиеся условия воздействия ингаляций, которые могут быть использованы для тестирования токсичности.
Introduction
Легкие уязвимы для ингаляционного воздействия частиц, передающихся воздушно-капельным путем. Для оценки потенциальной токсичности частиц, передающихся воздушно-капельным путем, достигнут прогресс в разработке системвоздействия воздухо-жидкого интерфейса(АЛИ) 1,2,3,4,5. Системы воздействия ALI позволяют более релевантные и реалистичные модели экспозиции по сравнению с традиционным подводным воздействием через культурную среду, которая изменяет характеристики и кинетикичастиц 6. Системы воздействия ALI предусмотрят специфические требования к моделям клеточной культуры, так как модели не имеют культуры среды и, следовательно, питательных веществ на апической стороне. Многие модели клеток негативно влияют на то, что они культурны и подвергаются воздействию воздуха (например, высыхания) и остаются жизнеспособными только в течение нескольких дней. Это ограничивает условия воздействия, которые могут быть использованы в этих моделях: обычно относительно высокие концентрации применяются в течение короткого периода времени в качестве облака (т.е. капель, содержащих частицы, которые быстро оседают). Такие экспериментальные условия не отражают реалистичного долгосрочного воздействия низких концентраций частиц; таким образом, актуальность результатов может быть поставилась под сомнение. Для преодоления этих ограничений был оптимизирован протокол культуры и экспозиции для бронхиальной модели, состоящей из бронхиальной эпителиальной клеточной линии человекаCalu-3 7.
Большинство моделей легких in vitro, используемых для воздействия ALI, содержат другие клеточные линии, такие как A549, BEAS-2B и 16HBE14o- (16HBE) или первичные клетки в качестве основы8. Эти клеточные линии имеют недостаток, что они остаются жизнеспособными в течение всего нескольких дней, когда культурные на ALI. Кроме того, некоторые из этих клеточных линий разрастаются при культуре в течение более 5 дней. Наконец, A549 клетки пропустить функциональные жесткие соединения и поэтому не может сформировать жесткий барьер, который необходим дляимитации легких 9,10. Первичные эпителиальные клетки могут быть хорошим вариантом для воздействия АЛИ, поскольку они могут быть культурно на АЛИ в течение нескольких недель. Тем не менее, первичные клетки отличаются от партии к партии, являются более трудными в обслуживании, и являются более дорогостоящими по сравнению с клеточными линиями, что делает их менее пригодными для тестирования токсичности и скрининга. При сравнении различных линий бронхиальных эпителиальных клеток человека (16HBE, Calu-3, H292 и BEAS-2B), только клетки Calu-3 отвечают всем критериям, необходимым для реалистичного, повторного воздействия ALI: они остаются жизнеспособными в течение нескольких недель, пока они культурны в ALI, обеспечивают высокую барьерную целостность, не перерастают, и легко культуры и поддержания. Клетки Calu-3 происходят от аденокарциномы и способны производить слизь11,12. Есть несоответствия о том, клетки могут развиваться реснички11,13. Клетки Calu-3 также являются подходящей моделью для изучения респираторно-синцитиальных вирусных инфекций (РСВ), которые инфицируют цилиированные эпителиальные клеткидыхательных путей 14.
Помимо клеточной модели, автоматизированная система экспозиции (AES) используется для воздействия жидкости ввоздухе на аэрозоли 15,16. Преимущество AES заключается в том, что он использует непрерывный воздушный поток для воздействия модели клеток на аэрозоли. Это в отличие от других систем воздействия жидкости воздуха, которые обычно используют относительно высокие концентрации в течение короткого периода времени в качестве облака (т.е. капли, содержащие частицы, которые быстрооседают) 17,18,19. Эти облачные системы не отражают реалистичного долгосрочного воздействия низких концентраций частиц. Применяя непрерывный поток воздуха с помощью AES, модель клетки может подвергаться воздействию низкой концентрации частиц в течение более длительного периода времени, отражая реалистичные условия воздействия. Еще одним преимуществом облачных систем является то, что AES имеет возможность соединять инструменты характеристики частиц, что позволяет измерять размер частиц, концентрацию числа и массу с течением времени. Ограничение AES заключается в том, что он использует относительно высокие воздушные потоки между 10 мл/мин и 100 мл/мин.
Protocol
1. Подготовка среды клеточной культуры (CCM)
- Приготовьте бутылку объемом 500 мл минимально необходимой среды (MEM), дополненную глутамином.
- Добавьте 5 мл пенициллина-стрептомицина (т.е. 100 U/mL пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина).
- Добавьте 5 мл раствора несущественных аминокислот (NEAA).
- Добавьте 10 мл амфотерицина B (по желанию).
- Добавьте 50 мл FBS (тепловая инактивация, пожалуйста, следуйте протоколу ATCC для тепловой инактивации; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, стр. 19)).
2. Подкафись клеток Калу-3
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Calu-3 культурируются в колбы культуры клеток T75 или T175 при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Клетки проносяты при 60-80% слиянии каждые 7 дней с обновлением СКК каждые 2-3 дня. СКК сливается и свежие СКК (T25 и 5 мл, T75 и 15 мл, и T175 и 25 мл) трубы в колбу и колба помещается обратно в инкубатор. Клетки следует пройти не менее 2x после оттаивания, перед использованием в экспериментах, или перед замораживанием, и они должны быть проведены не более 25x в общей сложности.
- Подтвердите, если колба 60-80% стечения, проверяя под световым микроскопом.
- Слейте СКК из колбы.
- Вымойте клетки 2x с 5 мл 1x Хэнкс 'сбалансированный раствор соли (HBSS) без кальция и без магния. Откажитесь от HBSS после каждой стирки. HBSS удаляет сыворотку, которая подавляет трипсин.
- Добавьте 3 мл трипсина-ЭДТА для T75 (4 мл для T175) и поместите колбу обратно в инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение 10-15 минут. Проверьте через 10 минут, гарантируя, что клетки отделились от поверхности колбы. В случае, если клетки выросли до 80% слияния, они не будут отделяться с помощью трипсина 0,05% и трипсина 0,25% могут быть использованы.
- Добавьте 6 мл (т.е. удвойте первоначально добавленный объем трипсина-ЭДТА) СКК в колбу и аккуратно раскачивайте колбы, чтобы обеспечить правильное смешивание. Это делается для того, чтобы трипсин был нейтрализован FBS в СКК и его деятельность на ячейках остановлена. Если трипсин разрешено оставаться в контакте с клетками слишком долго они не будут прикрепляться при положить в новую колбу культуры клеток.
- Налейте полное содержимое колбы в 50 мл центрифуги трубки.
- Центрифуга клетки в течение 5 мин при 130 х г, гарантируя, что центрифуга правильно сбалансирована.
- Вернуть флакон, содержащий клетки обратно в асептические условия и удалить супернатант мягко, не нарушая гранулы. Супернатант можно слить, а оставшуюся трубу слить, чтобы гранулы не нарушались.
- Переусердуйте клеточные гранулы в 1 мл СКК, трубя вверх и вниз до тех пор, пока все клетки не будут приостановлены (т.е. гранул или клеточных агломератов не наблюдается). Дополнительные СКК могут быть добавлены для разбавления клеточной подвески.
- Подсчитайте клетки, как мертвые, так и живые, в 1 мл СКК с помощью гемоцитометра. При необходимости для правильного подсчета, разбавить клетки в 3 или 4 мл.
- Приостановить ячейки в объем СКК требуется и добавить подвеску ячейки в каждой колбе. Для достижения около 80% слияния в неделю, семена 2 х 106 клеток в T75 или 6 х 106 клеток в T175.
- Аккуратно раскачивайте колбу, а затем поместите ее обратно в инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
- Заменить свежим СКК каждые 2-3 дня и субкультуры, когда клетки достигают 60-80% слияния.
3. Посев калу-3 клетки на культуру вставки
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставки доступны с различными размерами пор. Небольшие размеры пор (например, 0,4 мкм) имеют то преимущество, что клетки растут легче и могут достичь хорошего барьера уже после 5 дней культивирования в условиях погружения, как измеряется Транс эпителиального электрического сопротивления (TEER). Однако, когда заинтересованы в транслокации частиц, эти поры слишком малы и будет ловушка частиц. Таким образом, большие размеры пор (например, 3 мкм), как правило, выбираются для тестирования частиц. При использовании большего размера поры, клетки нуждаются в более длительных периодах времени (например, 7-10 дней культивирования в условиях погружения), чтобы достичь хорошего TEER.
- Подготовка клеточной подвески с известной концентрацией после шагов 2.1-2.10.
- Разбавить клетки до концентрации 5 х 105 клеток /мл в предварительной CCM для 6 хорошо вставки или 2,5 х 105 клеток / мл для 12 хорошо вставки.
- Возьмите пластину клеточной культуры с вставками и поместите в асептические условия.
- Заполните базолатеральной стороны с 2 мл предварительной СКК для 6 хорошо вставки, или 1 мл для 12 хорошо вставки. При добавлении среды культуры, возьмите вставку с помощью пинцета.
- Тщательно смешайте подвеску клетки, трубя вверх и вниз. Pipette 1.0 mL для 6 вставок скважины и 500 йл для 12 вставок скважин (эквивалент 100,000 клеток/см2) на верхней части мембраны в клеточной культуревставляют с 0,4 мкм пор. Для пор 3,0 мкм увеличьте плотность клеток до 128 000 клеток/см2.
- Обложка пластины клеточной культуры и инкубировать при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
- Меняем СКК каждые 2-3 дня.
- Пусть клетки станут стеченными в течение 7 дней в затопленных условиях, прежде чем продолжить культуру в ALI.
- Мера TEER.
- Возьмите эпителиальный вольтомметр, дополненный набором электродов Chopstick, и зарядите аккумуляторную систему на ночь.
- Отключите Вольтомметр от зарядного устройства и подключите электрод палочки.
- Очистите электрод 70% этанолом.
- Поместите электрод в СКК, поставив более длинный электрод во внешних средствах культуры, пока он не коснется нижней части блюда и положить короткий электрод в средствах массовой информации, не касаясь мембраны.
- Начните с пустой вставки без ячеек. Подождите, пока измерение стабилизируется и запишите сопротивление в Ohms. Это измерение является сопротивлением вставки мембраны без каких-либо клеток (т.е. пустой сопротивления).
- Повторите измерение для каждой вставки и вычесть пустое сопротивление, чтобы получить истинное сопротивление.
- Для анализа данных умножьте значения сопротивления на площадь поверхности вставки в Ω x cm2. Для 6 хорошо вставить, площадь поверхности 4,67 см2. Таким образом, если сопротивление 600 Ohm измеряется и фон 120 Ohm, сопротивление 480 Ohm, который затем умножается на площадь поверхности 4,67см 2 в общей сложности 2,241.6 Ohm x cm2. TEER должен быть 1000 фунтов стерлингов, Ω см2, чтобы продолжить.
- Удалите СКК с апической стороны вставок.
- Добавьте 2 мл предварительно сКК для 6 хорошо и 1 мл для 12 хорошо вставки в базолатеральной стороне хорошо (т.е. под вставку клеточной культуры). СКК должен касаться мембраны снизу, но не просачиваться в верхнюю часть вставки.
- В этот момент клетки apically подвергаются воздействию воздуха, который называется культивирование на ALI.
- Культурные клетки в АЛИ в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 7 дней до облучения.
- Меняем базолатеральный СКК каждые 2-3 дня. Клетки могут быть использованы в ALI в течение 6 недель.
4. Подготовка установки экспозиции
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 5-7 описывают подготовку к воздействию частиц с помощью автоматизированной станции экспозиции (AES, см. таблицу материалов). Установка для небулизации частиц и характеристики также совместима с другими системами воздействия ALI от других производителей. В качестве примера ниже описано воздействие частиц. Такие системы могут также использоваться для других воздействий, таких как сенсибилизаторы, сигаретный дым и дизельные выхлопные газы. На рисунке 1 показаны AES и модуль экспозиции. На рисунке 2 показано схематическое представление установки экспозиции, включая все другие инструменты.
- Перед началом экспозиции с использованием AES подключите систему к нескольким приборам для измерения аэрозольных характеристик; они измеряются в боковом потоке перед тем, как аэрозоли попадают в шкаф.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сплиттер потока используется для подключения бокового потока к оборудованию характеристик экспозиции. Как правило, используется следующее оборудование: сканирование силы подвижности частиц sizer (SMPS), оптический сизер частиц (OPS), счетчик частиц конденсации (CPC), конические элементы колеблющегося микробаланса (TEOM). Измерения SMPS и OPS выполняются 1x в час и используют те же трубки от сплиттера потока. CPC и TEOM выполняют непрерывное измерение, и данные от обоих регистрируются на регистраторе данных модели Squirrel 2020. Кроме того, концентрация гравиметрической массы определяется с использованием микробаланса при контролируемой относительной влажности (40-70%) и температурные условия (21–23 градуса по Цельсию). Тефлоновые фильтры взвешиваются до и после каждого воздействия, чтобы подтвердить концентрацию воздействия. Для захвата выхлопных газов используется фильтр HEPA. Установка, включая инженерные наноматериалы (ENM) подвески и небулайзер все помещены в шкаф потока, чтобы предотвратить любое воздействие на людей. AES может быть использован для тестирования различных типов ENMs, включая металлы и оксиды металла. - Подготовьте наноматериальную подвеску незадолго до экспозиции. Обычно 1% подвеска готовится в качестве решения акций. Например, приостановить 100 мг наноматериала в 10 мл чистой воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для воздействия D'12, 300 мг используется для достижения около 2 мкг / см2. Это количество может быть использовано в одной экспозиции или разделено на повторные воздействия (например, 300 мг приостанавливается в 30 мл для одной экспозиции или 21,5 мг приостанавливается в 2,15 мл свежей каждый день в течение 3 недель повторного воздействия). Подвеска свежеприготовлена в каждый день экспозиции. Подвеска частиц sonicated на 16 min используя sonication зонда. Объем 1% бульонного раствора корректируется на общий объем 100 мл путем добавления чистой воды. - Положите подвеску ENM в небольшую бутылку с крышкой и магнитным мешалкой, чтобы предотвратить оседают частицы. Подключите бутылку к перистальтическому насосу через небольшую трубку и отрегулируйте поток до 25 мл/ч.
- Подключите перистальтический насос к сопла спрей и настроить настройки, чтобы непрерывной аэрозолизации.
- Насадка для распыления устанавливается на алюминиевую трубку длиной 60 см (камера смешивания диаметром 15 см, нагретая до 60 градусов по Цельсию). Установка соединена с AES через 1,5-метровую медную трубку (диаметр 15 см). Поверх AES ударник удаляет все аэрозоли размером более 2,5 мкм.
- Подключите сопло брызг к 3 бару сжатого воздуха через два контроллера потока массы (MFC), чтобы позволить небулализации суспензий. Один поток 14 л/мин используется для сопла спрей, другой MFC для смешивания воздуха в трубке.
- За день до начала экспозиции включите AES, чтобы кабинет достиг температуры 37 градусов по Цельсию.
- Включите поток воздуха и влажность в шкафу 2 ч до начала экспозиции, чтобы достичь 85% влажности. Включите обогрев камер экспозиции, в которых будут размещены вставки с ячейками.
- Включите кварцевый микробаланс (ККМ) и установите начальное значение на уровне 0 с помощью программного обеспечения. Начните работать в журнале. Каждые 10 с масса измеряется и выражается как нг/см2.
- Разогреть средства массовой информации клеточной культуры до 37 градусов по Цельсию в водяной бане (20-30 мин).
5. Подготовка клеток Calu-3 к облучему
ПРИМЕЧАНИЕ: Для типичной экспозиции ALI с использованием AES, 15-20 вставки с стечением слоя клеток необходимы. Они состоят из 3 чистых элементов управления воздухом, 3 элементов управления инкубатором, которые будут обрабатываться аналогично другим вставок без воздействия в AES, 6-8 вставок для воздействия аэрозолей (в зависимости от использования 0, 1 или 2 микробалансов), 1-3 вставки для измерения контроля (например, максимальный выпуск LDH), и 3 запасные вставки в случае, если TEER некоторых вставок недостаточно. Клетки должны иметь TEER в размере 1000 фунтов стерлингов Ω см2, чтобы продолжить.
- В первый день воздействия, мыть клетки 1x с СКК, проверить морфологии клеток, и измерить TEER клеточной модели с помощью Вольтомметра. Клетки должны образовывать плотный монослой без зазоров.
- Положите 2 мл/1 мл HEPES буферных СКК без FCS на базолатеральной стороне 6 хорошо / 12 пластин и передачи культуры вставки с клетками на новые пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время экспозиции,нет CO 2 присутствует в AES. Таким образом, HEPES буферной культуры среды (25 мММ HEPES) используется во время транспортировки и экспозиции. Эта среда используется как для открытых клеток в AES, так и для клеток управления инкубатором. - В случае, если время транспортировки клеточных культур в AES составляет более 5 минут, поместите клетки в портативный инкубатор 37 градусов по Цельсию во время транспортировки.
6. Обработка AES во время экспозиции
- В AES заполните модули экспозиции с помощью СКК с буфером HEPES без сыворотки теленка плода (FCS). Количество СКК зависит от используемого устройства и типа вставки культуры клеток. Имейте в виду, что держать клетки на АЛИ, среда должна достичь нижней части мембраны, но не должны протекать на верхней части мембраны. При использовании 6 хорошо вставки, добавить 6 мл HEPES буферных СКК для экспозиции модулей.
- Перенесите вставки с клетками из пластин в модули экспозиции с помощью стерильных пинцетов. Убедитесь, что на базолатеральной стороне клеток нет пузырьков воздуха, и удалите СКК на апической стороне вставок. В случае, если есть некоторые пузырьки воздуха на базолатеральной стороне, осторожно поверните вставки с помощью стерильных пинцетов, пока они не будут удалены. Храните пластины, содержащие СКК, в инкубаторе для передачи после экспозиции.
- Используйте сенсорный дисплей, чтобы выбрать продолжительность экспозиции, скорость потока воздуха и повышение электростатического осаждения. Дисплей также может быть использован для проверки влажности и температуры. Обычно выбирается продолжительность экспозиции 4 ч, при скорости потока 50 мл/мин на вставах при влажности 37 градусов по Цельсию и 85%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модули первого уровня (рисунок 1 )используютсядля воздействия чистого воздуха; вставки в этом уровне используются в качестве элементов управления чистым воздействием воздуха. Другие модули второго и третьего уровня могут быть использованы для воздействия аэрозолей, в том числе два модуля для микробалансов кварцевого кристалла (ККМ) для измерения осаждения онлайн. - Тест на утечку должен быть проведен перед началом экспозиции. Утечка должна быть менее 5 мл/мин. Следуйте инструкциям на дисплее AES. Когда тест на утечку завершен, экспозиция может быть начата. В случае утечки, трубки должны быть проверены.
- В конце экспозиции откройте дверь модуля AES, откройте модули экспозиции, поместите вставки культуры клеток обратно в пластины культуры клеток и перенесите пластины в портативный инкубатор.
- Соберите средства массовой информации из модулей (т.е. открытых образцов) и из пластин (т.е. элементов управления инкубатором) для более поздних анализов, таких как измерение лактатной дегидрогеназы (LDH).
- Вернувшись в лабораторию клеточной культуры, перенесите вставки клеточной культуры на пластины, наполненные свежим стандартным СКК. Положите пластины клеточной культуры в инкубатор до следующего воздействия или до анализа.
- После последнего дня экспозиции, положить вставки в инкубатор до следующего дня.
- На следующий день после финальной экспозиции добавьте СКК в апиаку для измерения TEER с помощью Вольтомметра. Соберите как апический, так и базолатеральный СКК отдельно для анализа цитокинов.
- Удалите все СКК и выполните анализ жизнеспособности ячейки, добавив, например, реагент распространения в апикаль сторону.
7. Очистка AES
- Заполните модули экспозиции водой, подождите 1 мин и удалите воду. Затем заполните модули 70% этанола, оставьте его на 10 мин и удалите этанол. Очистите воздействия трубы также с 70% этанола.
- Остановите 85% контроль влажности, но оставьте температуру шкафа на уровне 37 градусов по Цельсию для следующего эксперимента.
Representative Results
Эта статья предоставляет метод для культивирования и разоблачения человеческих бронхиальных эпителиальных клеток в АЛИ, который имитирует реалистичные, повторяющиеся условия воздействия ингаляции, которые могут быть использованы для тестирования токсичности. Характеристики как клеточной модели, так и системы воздействия имеют важное значение для достижения реалистичной модели ингаляционного воздействия, которая может быть использована для повторного воздействия. Результаты по этим характеристикам приведены ниже.
Требования к модели ячейки и выбор
При выборе подходящей модели ячейки необходимо учитывать следующие характеристики:
- Клеточная модель должна быть в состоянии сформировать стечение монослой с функционирующими плотными узлами для имитации легочного барьера.
- Модель ячейки должна показывать оптимальную производительность при повторном воздействии обусловленного (температурного и влажностного) воздуха.
- Модель ячейки должна реагировать на воздействие.
Это исследование началось с четырех различных линий бронхиальных эпителиальных клеток человека: 16HBE, Calu-3, H292 и BEAS-2B. Все они широко используются для тестирования токсичности наноматериалов и химических веществ. Из четырех клеточных линий только ячейки Calu-3 выполнили все вышеперечисленные требования. Клетки сформировали монослой с плотными соединениями(рисунок 3), который оставался стабильным барьером с течением времени, как измеряется TEER, в то время как другие клеточные линии либо не образуют барьер или показали падение барьерной функции при культуре на ALI (Рисунок 4). Кроме того, H292 и BEAS-2B, как правило, перерастают в несколько слоев клеток при культуре в течение более длительного периода времени. Традиционное культивирование подводных клеток и культивирование АЛИ сильно отличались, потому что в ALI питательные вещества были доступны только с базолатеральной стороны и клетки подвергались воздействию сухих условий на апической стороне. Эти условия могут вызвать стресс для клеточных моделей, которые могут наблюдаться путем измерения жизнеспособности клеток с течением времени. Сотовые линии 16HBE, H292 и BEAS-2B показали увеличение выпуска LDH при культуре в ALI, в то время как клетки Calu-3 показали лишь небольшой релиз LDH (Рисунок 5).
Затем была опробована реакция модели Calu-3 на вещества. В качестве положительного вещества контроля, LPS вводился через небулизацию к апической стороне модели. Отложенная доза составила 0,25 мкг/см2. Клетки Calu-3 показали реакцию на липополисахарид (LPS) увеличением высвобождения LDH и в высвобождении фактора некроза опухоли альфа (TNF-α)(рисунок 6).
Наконец, монослой Calu-3 подвергся воздействию кварцевого кремнезема (D-12) наноматериалов (МОМ, Эдинбург). Кристаллический кремнезем может вызвать силикоз, а также может вызвать опухоли легких. Поэтому Международное агентство по исследованию рака (IARC) классифицировало кристаллический кремнезем как канцероген человека группы I20. Механизм действия кристаллического кремнезема, как полагают, через индукцию постоянного воспаления, вызванного его реактивнойповерхности 21,22,23. Несколько исследований in vivo как у крыс, так и у мышей сообщают о индукции воспаления и гистопатологических изменений, включая опухоли и фиброз, послеингаляционного воздействия кристаллического кремнезема 24,25,26,27,28,29. Все эти эффекты наблюдаются после повторного воздействия и/или долгосрочного наблюдения. Модель Calu-3 использовалась для изучения того, можно ли имитировать наблюдения, проведенные в исследованиях in vivo, с помощью модели in vitro, которая может подвергаться повторному воздействию в ALI.
Клетки Калу-3 подвергались воздействию в течение 3 недель подряд, 5 дней в неделю, 4 ч в день до Д-12. Отложенная доза была измерена с помощью ККМ. Средняя отложенная доза составила 120нг/см 2 в день, с кумулятивной дозой 1,6 мкг/см2, каки дозы, вызывающие эффект in vivo. Другие характеристики частиц показаны в таблице 1. После 3 недель воздействия, D-12 индуцированных никаких значительных эффектов в TEER, жизнеспособность клеток, и моноцитов химиоаттракант белка 1 (MCP-1) релиз, по сравнению с чистым управлением воздухом (Рисунок 7). Поскольку на основе данных in vivo ожидалось больше токсичности D-12, реактивность частиц была проверена с помощью ацеллюлярного анализа в соответствии с протоколом, оптимизированным в рамках проекта ЕС GRACIOUS (поставляется 5,3). Реактивность партии D-12 была ниже, чем ожидалось(рисунок 8), на порядок ниже по сравнению с положительными частицами контроля углеродного черного цвета (CB). Такое отсутствие реактивности может объяснить отсутствие реакции на токсичность в модели Calu-3.
Рисунок 1: Автоматизированная станция экспозиции (AES).
Левая фигура показывает внешнюю часть шкафа с сенсорной панелью. AES имеет три уровня с модулями воздействия: верхний уровень для воздействия чистого воздуха, и средний и нижний уровень для воздействия аэрозолей. Правая фигура показывает модуль экспозиции, в котором расположены вставки с ячейками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематическое представление установки экспозиции.
Слева направо: 1) подвеска ENM, подключенная к сопла спрей через перистальтический насос; 2) Использование сжатого воздуха спрей сопла nebulizes подвески ENM и через камеру смешивания аэрозолей привели к AES; 3) Незадолго до ввода AES, аэрозольные характеристики инструменты подключены: SMPS, OPS, КПК, и TEOM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативное изображение клеток Calu-3 после культивирования в воздушно-жидком интерфейсе (ALI) в течение 10 дней.
Флуоресценция микроскопии изображение клеток Calu-3 после культивирования в АЛИ в течение 10 дней. Плотный узел белка ЗО-1 окрашен в зеленый цвет, ядра клеток окрашены в синий цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Трансепителиальное электрическое сопротивление (TEER) четырех различных клеточных линий в период культуры 21 дней.
ЗНАЧЕНИЯ TEER 16HBE, Calu-3, H292 и BEAS-2B при культуре в течение 21 дня: первые 7 дней погружены в воду, а затем 14 дней в ALI. Значения TEER были скорректированы для фонового сопротивления вставки и умножены на площадь поверхности вставки. Символы и бары ошибок представляют среднее значение и стандартное отклонение шести вставок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: LDH релиз четырех различных клеточных линий в период культуры 21 дней.
LDH релиз 16HBE, Calu-3, H292, и BEAS-2B, когда культурный в течение 21 дней: 7 дней погружены, а затем 14 дней в ALI. Показанные значения LDH относительно максимального выпуска LDH для каждого типа ячейки. Символы и бары ошибок представляют среднее значение и стандартное отклонение пяти вставок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Сотовые эффекты в клетках Calu-3 подвергаются воздействию LPS.
Клетки Calu-3 подвергались воздействию небулялизации облаков до 0,25 мкг/см2 LPS. (A)Преобразование WST-1. (B) выпуск LDH. (C) TNF-α после воздействия LPS. Символы и бары ошибок представляют средние значения и стандартные отклонения трех вставок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Сотовые эффекты в клетках Calu-3 подвергаются воздействию наноматериалов D-12.
Клетки Калу-3 подвергались воздействию в течение 3 недель (4 ч в день, 5 дней в неделю) к наноматериалам ДЗ12, около 120нг/см 2 в день, совокупная доза 1,6 мкг/см2. (A)Значения TEER. (B) выпуск LDH. (C) MCP-1 релиз после воздействия D'12. Все символы и бары ошибок представляют средние значения и стандартные отклонения трех вставок для элементов управления и шести вставок для экспозиции D-12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Ацеллюлярная реактивность Д-12.
D-12 был инкубирован зондом 2ʹ,7ʹ-Dichlorofluorescein Diacetate (DCFH-DA) для обнаружения его поверхностной реактивности. В качестве положительного контроля были включены частицы углерода черного цвета (CB). По сравнению с ЦБ, D-12 имеет очень низкую поверхностную реактивность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Масса частиц (мкг/м3) | Номер частицы (к/см3) | Размер частиц подвижности (нм) | Геометрическое стандартное отклонение | Размер оптических частиц (мкм) |
| 2969 (418) | 83983 (10215) | 66.6 | 2.5 | 1.1 (1.3) |
Таблица 1: Характеристики экспозиции D-12. Значения отображаются как средние со стандартным отклонением в скобках.
Discussion
В настоящем документе описывается метод культивирования человеческих бронхиальных эпителиальных клеток под АЛИ и подвергая эту бронхиатальную модель аэрозолям или газам. Преимущество использования клеток Calu-3 заключается в том, что они образуют плотные соединения, остаются монослойными, способны выдерживать поток воздуха и могут быть выдержат в течение нескольких недель в ALI, в отличие от многих других типов клеток (например, 16HBE, H292 и BEAS-2B). Использование автоматизированнойстанции ® vitroCELL (AES) имеет то преимущество, что клетки могут подвергаться воздействию в реалистичных и соответствующих условиях, поскольку низкие концентрации могут быть применены с помощью непрерывного воздушного потока.
Системы постоянного потока, такие как AES, имеют преимущества по сравнениюс использованием облачныхсистем 3,32, которые используют одну небулизацию подвески. Непрерывный поток является более реалистичным, и многие переменные, такие как скорость потока, влажность и температура контролируются. Кроме того, осаждение может быть усилено с помощью электрического поля. Наконец, аэрозольные характеристики, такие как размер, концентрация числа и масса, контролируются в Режиме онлайн. Недостатком является то, что системы постоянного потока являются более сложными по сравнению с облачными системами. Поэтому важно провести подготовительные эксперименты, которые сосредоточены на характеристиках частиц аэрозоля и доставленной дозе на вставке. Начальная начальная концентрация частиц и настройки AES могут быть скорректированы для достижения желаемой дозы на клетках33. В зависимости от типа тестируются частицы, метод генерации аэрозолей может отличаться. Использование электростатического осаждения зависит от типа частиц и лучше всего подходит для металлических частиц. Для частиц с положительным поверхностным зарядом следует применять отрицательное электростатическое поле и наоборот.
Выбор концентраций воздействия может быть трудным для любого эксперимента воздействия жидкости воздуха. Для воздействия D-12 цель состояла в том, чтобы достичь общей совокупной дозы 1мкг/см 2 после 3 недель воздействия, 5 дней в неделю, 4 ч в день. Эта доза похожа на дозы, которые индуцированных эффект в vivo21,25,27,32,33. При выполнении экспозиций, было некоторое различие между различными днями экспозиции. Хотя фактическая отложенная доза 1,6мкг/см 2 выше, чем доза 1 мкг/см2, которая была направлена на, доза, возможно, была слишком низкой, чтобы наблюдать эффекты в модели Calu-3. Между воздействием чистого воздуха и воздействием D'12 наблюдались лишь незначительные различия в TEER, жизнеспособности и реакции цитокинов, и эти различия не были статистически значимыми. Объяснением наблюдения о том, что воздействие D-12 в течение 3 недель не вызывали значительных эффектов в клетках Calu-3, является то, что макрофаги отсутствовали в модели Calu-3. Возможно, после поглощения ДЕС12 макрофаги производят провоспалительные цитокины, которые могут повлиять на клетки Calu-3. Другое объяснение заключается в том, что партия D-12, которая использовалась для экспериментов, была не так реактивна, как ожидалось. При использовании LPS в качестве положительного вещества контроля, Calu-3 показывает ответ, как измеряется увеличением выброса LDH и увеличением TNF-α выпуска. Это означает, что модель может обнаружить токсичность.
Модель ячейки Calu-3 имеет много преимуществ, о чем говорится в разделе результатов. Кроме того, при культуре в течение более длительного времени на АЛИ, Калу-3 клетки могут расти реснички / реснички,как структуры 13 и производить слизь 11,12,13. Несмотря на эти преимущества, модель имеет ограничения в отношении своей физиологической значимости. Клеточные линии Calu-3 происходят от аденокарциномы, в то время как 16HBE и BEAS-2B происходят из здоровых тканей. К сожалению, последние два не подходят для повторного воздействия ALI, поскольку они не остаются стабильным монослой с течением времени. Другим ограничением модели Calu-3 является то, что она представляет только один тип ячейки. В легких человека, несколько типов клеток, которые взаимодействуют и по-разному реагируют на воздействие присутствуют. Вдыхаемые частицы будут отложены в различных областях легких в зависимости от их аэродинамического размера. Здесь частицы соедут с эпителиальным клеточным барьером, как это имитирует модель Calu-3. В легких человека, альвеолярные макрофаги привлекают частицы, поглотить их, и очистить их от легких. Макрофаги также играют важную роль в реакции воспаления на воздействие частиц. Поэтому предпринимаются усилия по расширению модели Calu-3 путем добавления первичных макрофагов для более тесного имитации легочного барьера. Недостатком макрофагов является то, что они остаются жизнеспособными только в течение 7 дней, когда культурные на вершине Калу-3 клеток на АЛИ. Поэтому макрофаги следует читать еженедельно, чтобы превратить текущую модель Calu-3 в модель совместной культуры. В настоящее время проводится оптимизация протокола совместной культуры.
Учитывая вышесказанное, бронхиальная модель Calu-3 является подходящей моделью для повторного воздействия аэрозолей частично растворимых веществ, таких как химические вещества от сигаретного дыма и LPS. Эти растворимые вещества вызывают значительное увеличение реакций цитокинов в клетках Калу-3. Для тестирования нерастворимых частиц, таких как дизельные выхлопные газы и D-12, необходима модель кокультуры, поскольку макрофаги играют решающую роль в индукции эффектов при воздействии частиц.
Для описанных экспозиций использовались вставки мембран с порами 3,0 мкм. Основная причина выбора этого типа вставки заключается в том, что можно проверить транслокацию наноматериалов. При использовании меньшего размера поры 0,4 мкм, агломераты частиц не смогут пересечь мембрану вставки. Недостатком использования большого размера пор является то, что клеткам нужно больше времени, чтобы вырастить слияние и что труднее визуализировать морфологию клеток с помощью световой микроскопии. Чтобы проверить, что клетки действительно образуют слияние монослой, TEER должен быть 1000 фунтов стерлингов Ωсм 2 до начала экспозиции.
В совокупности представленная здесь бронхиальная модель Calu-3 подходит для повторного воздействия аэрозолей, по крайней мере, до 3 недель. Модель может выдерживать культуру и воздействие с помощью непрерывного воздушного потока и способна обнаруживать токсичность бронхового эпителия.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансируется ЕС-проект PATROLS (Физиологически якорные инструменты для реалистичных наноматериалов опасности aSsessment) и голландского министерства здравоохранения, социального обеспечения и спорта (проект V/050012). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Ивонн Стаал и д-ра Яна ван Бентема за критический обзор рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| 0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
| 2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
| 3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
| Automated exposure station | Vitrocell | ||
| Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
| Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
| DQ12 | IOM | nanomaterials | |
| ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
| EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
| FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
| Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
| Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
| Light microscope | Olympus | CKX41 | |
| Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
| Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
| Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
| OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
| Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
| Pure water | Merck | MilliQ | |
| SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
| Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
| Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
| TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
| Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
| Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |
References
- Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49 (2017).
- Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
- Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
- Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).
- Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
- Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58 (2016).
- Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
- Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11 (10), 0165225 (2016).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).
- Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).
- Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019).
- Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
- Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019).
- Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40 (2014).
- Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).
- Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).
- Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23 (2018).
- Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).
- Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).
- Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).
- Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).
- Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).
- Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).
- Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).
- Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).
- Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).
- Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).
- van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).
- Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).
